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1、细胞培养总结,Cell Culture,细胞生物学教研室,一、细胞培养技术回顾,（一）细胞培养所用制品的清洗与消毒,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗,（二）细胞培养常用试剂,细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水,1：水,2：细胞培养基,市场上可提供干粉培养基和液体培养基 常用的培养基种类 RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12 等,细胞培养基应用选择,
2、选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,3：血清,热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。 适用于细胞因子和免疫相关实验，否则建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活
3、后有时会严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm，5 分钟去除，也可不用处理； 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。,4: 平衡盐液体,组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Ha
4、nks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),PBS（Phosphate-Buffered Sallines）,DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型,5：消化液,分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液 单独或混合使用,6：pH 调整液,NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存 HEPES（分子量238.31）溶液 羟乙基哌秦乙硫磺酸，一种弱酸，无细胞毒性 主要作用：防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养
5、基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。 HEPES配制 使用终浓度一般为10-50 mmol/L 常配成1M 储存液：用20 ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。 使用时可向100 ml培养液中加入2ml HEPES储存液，终浓度为20 mmol/L,7：谷氨酰胺补充液,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰
6、胺，故需单独配制谷氨酰胺，临用前加入培养液中； 使用终浓度为1 4 mmol/L 配制方法： 一般配制为100倍储存液，浓度200 mmol/L（29.22 g/L） 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装，-20保存； 使用时向100 ml培养液中加入0.5 2 ml储存液，终浓度为1 4 mmol/L,8：酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 橙红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫红色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,9：抗生
7、素溶液,抗生素使用种类与浓度： 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin (青霉素) 100 U/ml -20 G(+) streptomycin (链霉素) 100 ug/ml -20 G(+) , G(-) gentamicin (庆大霉素) 50 ug/ml -20 G(+) , G(-), 支原体 amphotericin B (两性霉素B) 2.5 ug/ml -20 真菌 nystatin (制霉菌素) 50 ug/ml -20 真菌,（三）、器材和液体的准备,细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用 手术器材、瓶
8、塞、配制好的PBS液 15磅，121，20分钟蒸气灭菌 培养液、小牛血清、消化液 抽滤后备用,冷冻保存细胞的解冻与复苏要点,快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）； 用80g 离心23 分钟，弃上清液； 用510 ml 新鲜完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞； 接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml； 24 小时后去除未贴壁的细胞，常规培养。,二、细胞的原代和传代培养,原代培养1.植块法培养,原代培养 2. 酶解组织 消化、接种培养,原代细胞植块培养,细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞
9、密度适宜，5天到一周即可形成单层,贴壁生长细胞传代方法,传代细胞培养结果,传代细胞培养,二、细胞增殖检测,（一）、细胞计数及活力测定,。 计数四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中死细胞和活细胞数。 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度 细胞悬液的细胞数/ml （四个大格子细胞数/4）稀释倍数104 公式中说明： 除以4表示4个大格的细胞数平均； 乘以104因为计数板中每个大格体积：长1.0mm宽1.0mm高0.1mm0.1mm3 ； （ 1ml103 mm3）,细胞台盼蓝染
10、色计数和活力测定的实验结果,（二）、CCK8 实验结果,（三）、流式细胞仪测定细胞周期,（四）、细胞分裂指数测定,（五）、EDU或BRDU标记实验,二、细胞运动检测,（一）、细胞划痕实验,（二）、TRANS-WELL实验1,（二）、TRANS-WELL实验2,二、细胞凋亡检测,流式细胞仪检测细胞凋亡,三、真核细胞转染,Transfection of eukaryotic cells,Transfection,What is Transfection? Transfection is a method of transporting DNA, RNA and/or various macromo
11、lecules into an eukaryotic cell by using chemical, lipid or physical based methods. Methods: (just a few examples) Method Application CaPO4, DEAE DNA Transfection Liposome Based DNA Transfection Polyamine Based DNA Transfection,Purpose/uses of Transfection,Study gene function Study protein expressio
12、n Transfer DNA into embryonic stem cells,How it works,Utilize Chemical, lipid or physical methods (direct microinjection, electroporation, biolistic particle delivery) for transportation of genetic materials or macromolecules.,How it works Chemical and lipid methods,Neutralize negative charges on DN
13、A Chemical method: Calcium phosphate; creates precipitates that settle on cells and are taken in. Lipid or Polymer methods: interact with DNA, promotes binding to cells and uptake via endocytosis.,How it works Physical methods,Electroporation: use of high voltage to deliver nucleic acids; pores are
14、formed on cell membrane. Direct Microinjection: Use of a fine needle. Has been used for transfer of DNA into embryonic stem cells. Biolistic Particle delivery: Uses high-velocity for delivery of nucleic acids and penetration of cell wall.,Experimental method/process (chemical methods),HBS = HEPES-Bu
15、ffered Saline,Advantages/Disadvantages,Advantages: Provides the ability to transfer in negatively charged molecules into cells with a negatively charged membrane. Liposome-mediated transport of DNA has high efficiency. Good for long-term studies requiring incorporation of genetic material into the c
16、hromosome.,Disadvantages: Chemical Reagents: not useful for long-term studies. Transfection efficiency is dependent on cell health, DNA quality, DNA quantity, confluency (40-80%) Direct Microinjection and Biolistic Particle delivery is an expensive and at times a difficult method.,脂质体转染绿色荧光蛋白质粒结果,Invitrogen阳离子脂质体转染指南,脂质体转染绿色荧光蛋白融合的目标基因表达定位在胞质,四、流式细胞术,
