植物组织中淀粉含量的测定2007-01-12 08:55Ⅰ 蒽酮硫酸法一、原理 淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测定 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料 （二）试剂 浓硫酸（比重 1.84 ） 9.2mol/L HClO 4 2%蒽酮试剂，同实验 24 （三）仪器设备 电子天平，容量瓶： 100 mL 4 个、 50 mL 2 个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻度吸管 0.5mL 1 支、 2.0 mL 3 支、 5 mL 4 支，分光光度计，记号笔 三、实验步骤 1. 标准曲线制作 取小试管11支从0～10编号，按表24-3加入溶液和蒸馏水以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线表24-3 各试管加入标准液和蒸馏水量管 号01～23～45～67～89～10淀粉标准液(ml)00.40.81.21.62.0蒸 馏 水（ml）2.01.61.20.80.40淀粉含量（mg）040801201602002. 样品提取 称取 50 ～ 100 mg 粉碎过 100 目筛的烘干样品，置于 15 mL 刻度试管中，加入 6 ～ 7 mL 80 ％乙醇，在 80 ℃水浴中提取 30 min ，取出离心（ 3000 rpm ） 5 min ，收集上清液。
重复提取两次（各 10 min ）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于 85 ℃恒温水浴，使乙醇蒸发至 2 ～ 3 mL ，转移至 50 mL 容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的测定 向沉淀中加蒸馏水 3 mL ，搅拌均匀，放入沸水浴中糊化 15 min 冷却后，加入 2 mL 冷的 9.2 mol/L 高氯酸，不时搅拌，提取 15 min 后加蒸馏水至 10 mL ，混匀，离心 10 min ，上清液倾入 50 mL 容量瓶再向沉淀中加入 2 mL 4.6 mol/L 高氯酸，搅拌提取 15 min 后加水至 10 mL ，混匀后离心 10 min ，收集上清于容量瓶然后用水洗沉淀 1 ～ 2 次，离心，合并离心液于 50 mL 容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用 3. 测定 取待测样品提取液 1.0 mL 于试管中，再加蒽酮试剂 5 mL ，快速摇匀，然后在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，从标准曲线查出淀粉含量（ mg ） 四、结果计算 ：含量（%）=100*C*VT/V1*1000*W式中： C ——从标准曲线查得淀粉量， mg 。
V T ——样品提取液总体积 , mL V 1 ——显色时取样品液量， mL W ——样品重， g 0.9 ——由葡萄糖换算为淀粉的系数 Ⅱ 碘 - 淀粉比色法 一、原理 对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘–淀粉比色法淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘–淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料 （二）试剂 1 ． 80 ％硝酸钙溶液 2 ． 0.5 ％碘液：称 5.00 g 结晶碘和 10.00 g 碘化钾，放入研钵混合干研，然后加 10 mL 蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入 1000 mL 容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶
3 ． 5 ％含碘硝酸钙溶液：取 10 mL 80 ％的硝酸钙溶液，加入 160 mL 水再加入 3 mL 0.5 ％的碘液混匀，现用现配 4 ．标准淀粉溶液：称取纯淀粉 50 mg 于研钵中，加 3 mL 80 ％硝酸钙溶液，研细并转移到 100 mL 的三角瓶中，用 15 mL 80 ％的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。
将三角瓶置于沸水浴中煮沸 5 min ，冷却后全部转入 50 mL 容量瓶中并定容此液为 1 mg/mL 的淀粉标准液 5 ． 0.1 mol/L NaOH 6 ． 0.1 mol/L HCl （三）仪器设备分析天平，研钵，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心管，试剂瓶三、实验步骤 1 ．称取 1 ～ 3 g 叶片，剪碎放入研钵，加 5 mL 80 ％的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入 100 mL 的三角瓶中，用 10 mL 80 ％的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏斗，在沸水浴上煮沸 3 ～ 5 min （叶片含淀粉少的 3 min ，含淀粉多的 5 min ），使样品中淀粉转变为胶体溶液 2 ．给三角瓶中加 20 mL 蒸馏水，混合液转入离心管中离心（ 2000 ～ 3000 rpm ） 2 ～ 3 min ，将离心后的淀粉胶体浑浊液移入 100 mL 容量瓶（淀粉含量少时，可移入 50 mL 容量瓶），三角瓶及离心沉淀物用 5 ～ 10 mL 热蒸馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共洗 2 ～ 3 次）定容，即为淀粉提取液3 ．取 5 ～ 10 mL 淀粉待测液，加入到盛有 2 mL 0.5 ％碘液的离心管中，混匀静置 15 min 后离心（ 3000 rpm ） 5 min ，弃上清液。
沉淀用 5 ％的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗后的沉淀中加入 10 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 混匀，将离心管浸入沸水内 5 min ，使沉淀溶解将溶液转入 50 mL 容量瓶中，加入 0.3 mL 0.5 ％碘液，用 30 mL 左右的水冲洗并入容量瓶，加入 2 mL 1mol/L 的盐酸，用水定容并显色，在 590 nm 波长处测定光密度 4 ．绘制标准曲线 取标准淀粉溶液（ 1 mg/mL ） 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mL 于 6 个离心管中，用 80 ％硝酸钙溶液将各管的体积补足至 5 mL ，再向各管加入 2 mL 0.5 ％碘液，混匀静置 15 min 后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在 590 nm 波长下测定光密度此系列溶液的淀粉含量分别为 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mg ，然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线 四、结果计算 ：含量（%）=100*C*VT/V1*1000*W式中： C ——从标准曲线查得淀粉量， mg V T ——样品提取液总体积 , mL 。
V 1 ——显色时取样品液量， mL W ——样品重（ g ） III 旋光法（谷物淀粉含量的测定）一、原理： 酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解同时钙离子与淀粉分子上的羟基络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液淀粉分子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度（α），旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含量溶提淀粉溶胶所用的酸性氯化钙溶液的pH值必须保持2.30，密度须为1.30，加时间的长短也要控制在一定范围因为只有在这些条件下，各种不同来源的淀粉溶液的比旋度［α］才都是203°，恒定不变样品中其他旋光性物质（如糖分）须预先除去 二、材料、仪器设备及试剂： （一）材料：面粉或其他风干样品（二）仪器设备：1. 植物样品粉碎机；2. 离心机；3.分析天平；4. 粗天平；5. 旋光仪及附件；6. 三角瓶；7. 分样筛（100目）；8. 布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵；9. 离心管；10. 小电炉三）试剂： 三、实验步骤： 1. 样品准备：（1）称取样品：将样品风干、研磨、通过100目筛，精确称取约2.5g样品细粉（要求含淀粉约2g，请参考附注估计），置于离心管内。
2）脱脂：加乙醚数ml到离心管内，用细玻棒充分搅拌，然后离心倾出上清液并收集以备回收乙醚重复脱脂数次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难）大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到离心管内，充分搅拌，然后离心，倾去上清液，得到残余物4）脱糖：加80％乙醇10ml到离心管中，充分搅拌以洗涤残余物（每次都用同一玻棒），离心，倾去下清液重复洗涤数次以去除可溶性糖分 2. 溶提淀粉：（1）加醋酸－氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约10ml加到离心管中，搅拌后全部倾入250ml三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液50ml分数次洗涤离心管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内2）煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在4min～5min内迅速煮沸，保持沸腾15min～17min，立即将三角瓶取下，置流水中冷却煮沸过程中要时加搅拌，勿令烧焦；要调节温度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃将瓶侧的细粒擦下；并加水保持液面高度 3. 沉淀杂质和定容：（1）加沉淀剂：将三角瓶内的水解液转入100ml容量瓶，用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶瓶，并入容量内，加30％ZnSO41ml混合后，再加15％K4Fe（CN）61ml，用水稀释至接近刻度时，加95％乙醇一滴以破坏泡沫，然后稀释到刻度，充分混合，静置，以使蛋白充分沉淀。
2）滤清：用布氏漏斗（加一层滤纸）吸气过滤先倾清溶液约10ml于此滤纸上，使其完全湿润，让溶液流干，弃去滤液，再倾清溶液进行过滤，用干燥的容器接受此滤液，收集约50ml，即可供测定之用 4. 测定旋光度：用旋光测定管装满滤液，小心地按照旋光仪使用说明，进行旋光度的测定淀粉（％）＝α×N×100/{[α]20D×L×(W－K)}×100 式中：α：用钠光时观测到的旋光度；［α］20 D：淀粉的比旋度，在这种方法条件下为203°；L：旋光管长度（cm）；W：样品质量（g）；K：样品水分含量（％）；N：稀释倍数；100：换算为百分率也可以不用上列公式计算，改用工作曲线来求得淀粉含量，这样准确度高些Ⅲ、淀粉含量的测定一、 目的掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法二、原理淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量三、材料、仪器设备及试剂 材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同，另增加碘试剂；100ml、250ml容量瓶碘试剂（碘化钾—碘溶液）的配制：称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸馏水中使用前需稀释10倍四、实验步骤 1.葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。
2.淀粉的水解取上述还原糖含量测定中经85﹪乙醇浸提后的全部淀粉残渣，放入100ml三角瓶中，加入6mol·L－1盐酸10ml，混匀，在沸水浴中加热10min－30min（用碘试剂检查淀粉水解程度，直至不显蓝色为止），再加蒸馏水20ml,摇匀并过滤于100ml容量瓶中，过滤后残渣再用蒸馏水冲洗3次，一并过滤入容量瓶，定容至100ml准确取出10ml过滤液置入250ml容量瓶中，加酚酞2滴，用10﹪NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容至250ml，待测 3.还原糖含量测定取4 支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入待测液2ml,1支空白管加2ml蒸馏水代替样品液，然后各管再加入。