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1、生物化学讲义 第一章 蛋白质化学(12学时)【基本要求】:1. 掌握蛋白质的基本单位-氨基酸的种类、结构特征及其主要的理化性质。2. 掌握蛋白质的一二三四级结构以及稳定其结构的重要作用力。3. 掌握蛋白质的重要性质(两性解离、变性、沉淀、紫外吸收、颜色反应)。【内容提要与学时分配】 1蛋白质的生物学功能(1) 2蛋白质的元素组成与分子组成(2) 3蛋白质的分子结构(4) 4蛋白质结构与功能的关系(2) 5蛋白质的理化性质(2) 6蛋白质的分类与分离纯化简介(1)第一节 蛋白质通论一、蛋白质的生物学意义(160)蛋白质是生命的体现者恩格斯语。Protein “第一重要的”,“最原初的”。概括起来
2、,蛋白质主要有以下功能:1.催化功能(Enzyme) 2.调节功能 3. 运动功能 4. 运输和跨膜转运功能5. 保护和防御功能 6. 信息传递与识别功能 7. 贮存功能 8. 结构功能二、蛋白质的分类(158)(一)按分子形状分类 1.球状蛋白 2.纤维状蛋白 (二)按分子组成分类简单蛋白:清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。缀合蛋白:核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。三、蛋白质的元素组成与分子量(157)1. 元素组成 蛋白质平均含碳50,氢7,氧23,氮16。其中氮的含量较为恒定,而且在糖和脂类中不含氮,所以常通过测量样品中氮的含量来测
3、定蛋白质含量。如常用的凯氏定氮法:蛋白质含量蛋白氮6.25(即100/16)。2.蛋白质的分子量 蛋白质的分子量变化范围很大,从6000到100万或更大。四、蛋白质的水解(123)蛋白质的水解主要有三种方法:1.酸水解 2.碱水解 3.酶水解 第二节 氨基酸( amino acid)一、氨基酸的结构与分类(124)(一)基本氨基酸组成蛋白质的20种氨基酸称为基本氨基酸,或称为常见氨基酸、蛋白质氨基酸。基本氨基酸都符合通式,都有单字母和三字母缩写符号。 一般结构特征:I. 它们中除脯氨酸外都是-氨基酸,即在-碳原子上有一个氨基。II. 不同的氨基酸,其R侧链不同,对氨基酸的理化性质和在结构中的影
4、响也不同。III. 天然氨基酸都是L-构型的,即羧基在上,氨基在左端。若氨基在右为D-构型(与标准甘油醛的构型参照得出的)。A按照氨基酸侧链的极性分类(127):非极性氨基酸:Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种极性不带电荷:Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七种带正电荷:Arg, Lys, His带负电荷:Asp, GluB 按照氨基酸侧链的化学结构,分为三类:脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。1.脂肪族氨基酸 共15种。侧链只是烃链:Gly, Ala, Val, Leu, Ile。侧链含有羟基:Ser,
5、Thr侧链含硫原子:Cys, Met 侧链含有羧基:Asp(D), Glu(E)侧链含酰胺基:Asn(N), Gln(Q) 侧链显碱性:Arg(R), Lys(K)2.芳香族氨基酸 包括苯丙氨酸(Phe,F)、色氨酸(Trp,W)和酪氨酸(Tyr,Y)三种。 3.杂环氨基酸 包括组氨酸(His)和脯氨酸(Pro)种。(B是指Asx,即Asp或Asn; Z是指Glx,即Glu或Gln。)C 照酸碱性分类:酸性氨基酸:Asp, Glu碱性氨基酸:Arg, Lys, His中性氨基酸:15种还有两种新发现的氨基酸: 硒代半胱氨酸(Sci 2002.5.24) 吡咯赖氨酸小结:2酸3碱3芳香2含S2含
6、OH2酰胺甘Gly(最特殊,唯一无旋光性)、丙Ala(顾名思义)/苯丙Phe(顾名思义)、酪Tyr(有-苯酚基)、色Trp(-吲哚基P66) / 甲硫Met(-甲硫基)、半胱Cys(-巯基)、丝Ser(-羟基)、苏Thr(-羟基) / 天冬Asp(酸性氨基酸,-羧基)、天冬酰氨Asn(-酰氨)、谷Glu(酸性氨基酸,-羧基)、谷氨酰氨Gln(-酰氨)/ 精Arg(-胍基P66)、赖Lys(-氨基)、组His(-咪唑基P66)/缬Val、亮Leu、异亮Ile:都是烷烃链 / 脯Pro(亚氨基)。(二)不常见的蛋白质氨基酸(128)某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸,它们是基本氨基酸在蛋白质合成以
7、后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、锁链素等。其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。在甲状腺素中还有3,5-二碘酪氨酸。凝血酶原种含有-羧基谷氨酸。(三)非蛋白质氨基酸(129)自然界中还有150多种不参与构成蛋白质的氨基酸,它们大多是基本氨基酸的衍生物,也有一些是D-氨基酸或、-氨基酸,多数以游离态存在。这些氨基酸中有些是重要的代谢物前体或中间产物,如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物,-丙氨酸是遍多酸(泛酸,辅酶A前体)的前体,-氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。荧光素含有D-半胱氨酸,青霉素中D-赖氨酸。二、氨基
8、酸的性质(一)物理性质1、水溶性 -氨基酸都是白色晶体,每种氨基酸都有特殊的结晶形状,可以用来鉴别各种氨基酸。一般都溶于水,不溶于有机溶剂。(除胱氨酸和酪氨酸外,都能溶于水中;脯氨酸和羟脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中)2、旋光性 除甘氨酸外,-氨基酸都有旋光性,-碳原子具有手性。苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。3、光谱性质(143) 三个带苯环的氨基酸有紫外吸收,F:257nm,; Y:275nm,; W:280nm。通常蛋白质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的,一般在280nm,可以定量测定蛋白质.(二)酸碱性质(129) 氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基,所以氨基酸是两性电解质(ampholy
9、te)。在水溶液和结晶态中都以偶极离子的形式存在。氨基酸在溶液中的解离方向和解离的程度取决于溶液的PH值。当氨基酸分子所带的净电荷为零时的pH称为氨基酸的等电点(pI)。等电点的值是它在等电点前后的两个pK值的算术平均值。pI=(pK1 + pK2)/2 注意:pI时净电荷为零,但不是不带电荷;此时其溶解度最小,最容易沉淀析出。pHpI时,氨基酸带负电荷,-COOH解离成-COO-,向正极移动。pH=pI时,氨基酸净电荷为零,溶解度最小pHpI时,氨基酸带正电荷,-NH2解离成-N+H3,向负极移动。(三)化学性质(135)1.氨基的反应(1)与亚硝酸作用氨基酸在室温下与亚硝酸反应,脱氨,生成
10、羟基羧酸和氮气。常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。这也是Van slyke法测定氨基氮的理论基础。(2与甲醛反应氨基还可以与甲醛反应,生成羟甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在,所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后,氨基酸不再是偶极离子,其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示,因而可以滴定,这叫甲醛滴定法,可用于测定氨基酸。(3)与DNFB反应-Sanger反应氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸)。这一反应是定量转变的,产物黄色,可经受酸性100高温。该反应曾被英国的Sanger用来测定胰岛素的氨基酸顺序,也
11、叫桑格尔试剂,现在应用于蛋白质N-末端测定。 (4)与异硫氰酸苯酯(PITC)反应-Edman反应-氨基与PITC(异硫氰酸苯酯)在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物(PTC-AA),后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化,生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)。这些衍生物是无色的,可用层析法加以分离鉴定。这个反应首先是Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸,在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位,是氨基酸自动序列分析仪的工作原理。(5)磺酰化氨基酸与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl,丹磺酰氯)反应,生成DNS-氨基酸。产物在酸性条件下(6NHCl)100也不破坏,因此可
12、用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光,激发波长在360nm左右,比较灵敏,可用于微量分析。2.羧基的反应羧基可与碱作用生成盐;羧基可与醇生成酯,此反应常用于多肽合成中的羧基保护。3茚三酮反应氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热,引起脱氨、脱羧反应,最后生成蓝紫色物质(570nm)。而脯氨酸生成黄色化合物(440nm)。常用于氨基酸的定性定量分析.也可通过二氧化碳测定氨基酸含量。4. 以下反应常用于氨基酸的检验:l 酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly反应),可用于定性、定量测定。组氨酸生成棕红色的化合物,酪氨酸为桔黄色。l 精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反应(Sakoguch
13、i反应),生成深红色,称为坂口反应。用于胍基的鉴定。l 酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应(Millon反应),生成白色沉淀,加热后变红,称为米伦反应,是鉴定酚基的特性反应。l 色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸,在界面会出现紫色环,用于鉴定吲哚基。(glyoxalate反应)l 酪氨酸在碱性条件下与福林试剂反应(Folin)反应,生成蓝色化合物。第三节 蛋白质的一级结构一、肽键和肽(162)一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的共价键,称为肽键。在蛋白质分子中,氨基酸借肽键连接起来,形成肽链。最简单的肽由两个氨基酸组成,称为二肽。含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽
14、、五肽等。/肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水,已不是完整的氨基酸,所以称为残基。/肽的命名是根据组成肽的氨基酸残基来确定的。一般从肽的氨基端开始,称为某氨基酰某氨基酰某氨基酸。肽的书写也是从氨基端开始。即有方向性,从N端C端。/有主侧链之分,主链完全一样,仅R不同。/ 除了蛋白质部分水解可以产生各种简单的多肽以外,自然界中还有长短不等的小肽,它们具有特殊的生理功能。例如;动植物细胞中含有一种三肽,称为谷胱甘肽,即-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有巯基,故常以GSH来表示。它在体内的氧化还原过程中起重要作用。/脑啡肽是天然止痛剂。/肌肉中的鹅肌肽是一个二肽,即-丙氨酰组氨酸。肌肽可作为肌肉中的缓冲
15、剂,缓冲肌肉产生的乳酸对pH的影响。/一种抗菌素叫做短杆菌酪肽,由12种氨基酸组成,其中有几种是D-氨基酸。这些天然肽中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。/许多激素也是多肽,如催产素、加压素、舒缓激肽等。活性肽保健品行业的热点。三、一级结构的测定(168)(一)一级结构(Primary structure)(即化学结构、共价结构)蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础,它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示,从N-末端向C-末端书写。采用三字母符号时,氨基酸之间用连字符()隔开。例如,牛胰核糖核酸酶,124个氨基酸;胰岛素,51个氨基酸。(二)测定步骤测定蛋白质的一级结构,要求样品必须是均一的(纯度大于97)而且是已知分子量的蛋白质。一