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1、质粒分子生物学与质粒技术质粒分子生物学与质粒技术第1讲 质粒分子生物学概论 1.什么是质粒 2.质粒的复制分配和不相容性3.质粒的接合转移 4.细菌质粒控制的表型 5.抗性质粒 6.毒力质粒 7.降解质粒 8.共生质粒 1 什么是质粒1.1 定义和命名质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的，符合这三条规范的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。狭义的质粒普通是指细菌染色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小写字母 p 加 2-3 个大写字母和数字，如 pJP4，pDTG1。 1.2 细菌质粒细细菌菌细细胞胞中中染染色色体体以以外外的的共共价价闭闭合合
2、环环状状DNADNA分分子子 (cccDNA)(cccDNA)，其其大大小小在在1-1700 1-1700 kbkb之之间间。根根据据质质粒粒控控制制的的性性状状，可可以以把把细细菌菌质质粒粒分分成成抗抗性性质质粒粒、降降解解质质粒粒、毒毒力力质质粒粒和和共共生生质质粒等粒等类类型。型。 1.3 真核生物的DNA质粒uu 环环状状DNADNA质质粒粒：酵酵母母2mm2mm质质粒粒，植植物物线线立立体体中中的的环环状状DNADNA质质粒粒，人人和和动动物物的的核核DNADNA质质粒粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。uu 线线状状DNADNA质质粒粒：乳乳酸酸克
3、克鲁鲁维维酵酵母母的的嗜嗜杀杀线线状状DNADNA质质粒粒，植植物物线线粒粒体体中中与与雄雄性性不不育育有有关关的的线状线状DNADNA质粒。质粒。1.4 真核生物的RNA质粒uu有有壳壳体体的的dsRNAdsRNA质质粒粒：由由蛋蛋白白质质壳壳体体包包裹裹，存存在在于于某某些些真真菌菌和和植植物物细细胞胞中中，由由于于它它们们酷酷似似病病毒毒，所所以以也也常常被被称称作作真真菌菌病病毒毒和和植植物物隐隐蔽蔽病病毒毒，或或称称类类病病毒毒颗颗粒粒，典典型型代代表表是是酿酿酒酒酵酵母母的的嗜嗜杀杀dsRNAdsRNA质质粒粒。与与RNARNA病病毒毒的的主主要要区区别别是是它它们不具有感染性们不
4、具有感染性uu无无壳壳体体的的dsRNAdsRNA质质粒粒：存存在在于于脂脂质质小小囊囊中中的的栗栗疫疫菌菌减减毒毒dsRNAdsRNA质质粒粒，玉玉米米线线粒粒体体中中与与雄雄性性不育有关的不育有关的dsRNAdsRNA质粒。质粒。 2 质粒的复制、分配和不相容性 2.1 复制 (Replication) 质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为根本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调理复制起始的基因编码蛋白质或RNA)。2.3 不相容性 (Incompatibility) 两种质粒不能在同个寄主细胞中共存的景象，叫质粒的不相
5、容性。质粒之间的不相容性，是由于它们存在种或几种与质粒复制或分配有关的一样因子，如根本复制子中的反向转录区(ColE1质粒的RNA)，ori区中的反复子(Iteron)，与分配蛋白结合的分配位点。不相容性是质粒分类的理想规范。肠道细菌质粒分别属于30多个不相容组，用Inc表示。3 质粒的接合转移 经过细胞与细胞之间的接触，使DNA从一个细胞转移到另外一个细胞的景象叫接合(Conjugation)。这一过程由接合性质粒的转移 (tra) 基因区编码。被转移的DNA可以是接合质粒本身，也可以是染色体或可诱动的非接合性质粒。得到供体DNA的受体细胞称为接合体或接合子。每个供体细胞所产生的接合体数称为
6、接合频率。 3.1 F质粒的接合转移机制 F质粒的分子大小为100 kb，编码接合转移功能的tra基因区位于遗传和物理图谱的66.6100 kb 位置，编码37个蛋白质和1个反义RNA，这些分子分别担任性菌毛的合成和装配，杂交对的稳定，外表排斥，DNA转移，以及tra区基因表达的调理。 图图1-10 F1-10 F质质粒接合粒接合粒接合粒接合转转移区的构造移区的构造移区的构造移区的构造66.6-100 kb66.6-100 kb区区区区traAtraA：性菌毛：性菌毛：性菌毛：性菌毛亚亚基；基；基；基；traNtraN和和和和traGtraG：杂杂交交交交对稳对稳定；定；定；定；traStra
7、S和和和和traTtraT：外表排斥；：外表排斥；：外表排斥；：外表排斥；traMtraM：转转移信号；移信号；移信号；移信号；traYtraY：缺口：缺口：缺口：缺口酶酶；traItraI：DNADNA解旋解旋解旋解旋酶酶；traDtraD：驱驱动动单单链链DNADNA转转移移移移；traJtraJ、finOfinO、finPfinP：调调理基因理基因理基因理基因3.2 细菌染色体的诱动 细菌的染色体与质粒的转移原点oriT序列共价衔接，染色体作为质粒DNA的延伸部分被转移。可以利用这一功能定位染色体基因，以及获得含有染色体片段的质粒。3.3 非接合质粒的诱动 许多天然质粒虽然是非接合性的，
8、但依然含有一个oriT位点和转移基因，当与它共存的接合质粒提供一个接合系统时，也能进展有效的转移，称之为诱动 (Mobilization)。4 细菌质粒控制的表型4.1 抗性质粒 包括抗菌素抗性R质粒和金属抗性质粒。R质粒的进化、转移和分散给抗菌素治疗带来很大费事，是医学所面临的艰苦问题之一。R质粒与转座子Transposon和整合子Integron的相互作用，使细菌耐药性问题更加严重。4.2 毒力质粒 许多细菌的致病力和毒性与质粒有关，如大肠杆菌肠毒素和定居抗原，破伤风毒素，炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，植物冠瘿病Ti质粒和发根病Ri质粒。pTi-SAKURApTi-SA
9、KURA的分子构造的分子构造的分子构造的分子构造206479 bp206479 bp，195 ORF195 ORF 毒力基因毒力基因2222：virA, virB1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11, virC1C2,virA, virB1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11, virC1C2, virD1D2D3D4, virE1E2, virG, virH virD1D2D3D4, virE1E2, virG, virHT-DNAT-DNA基因基因1616：tms1, tms2, tmr, nos, acs(2), e, 5, 6a, 6b, 21-h,tms1, tms
10、2, tmr, nos, acs(2), e, 5, 6a, 6b, 21-h, rolB-h, 5-h, IS ORF(2), tiorf174 rolB-h, 5-h, IS ORF(2), tiorf174复制基因复制基因3 3：repA, reB, repCrepA, reB, repC接合基因接合基因2020：traCDG, traAFB, traM, traR, traI, trbBCDEJKLFGHItraCDG, traAFB, traM, traR, traI, trbBCDEJKLFGHI其它基因其它基因5050；未鉴定的；未鉴定的ORFORF8484引自：引自：K. Su
11、zuki et al. / Gene 242 (2000) 331-336 K. Suzuki et al. / Gene 242 (2000) 331-336 4.3 4.3 降解质粒降解质粒 许多环境污染物的降解途径由质粒基因编码，许多环境污染物的降解途径由质粒基因编码，降解基因组成几个支配子，支配子的表达受调理降解基因组成几个支配子，支配子的表达受调理基因控制。目前，曾经测定全序列并注释基因的基因控制。目前，曾经测定全序列并注释基因的降解质粒有降解质粒有1010余种，分别是尼龙寡聚体降解质粒余种，分别是尼龙寡聚体降解质粒pOAD2pOAD2，芳香烃降解质粒，芳香烃降解质粒pNL1pNL1
12、，除草剂阿特拉津，除草剂阿特拉津降解质粒降解质粒pADP-1pADP-1，甲苯降解质粒，甲苯降解质粒pWWOpWWO，烟碱降，烟碱降解质粒解质粒pAO1pAO1，咔唑降解质粒，咔唑降解质粒pCAR1, pCAR1, 异丙基苯降异丙基苯降解质粒解质粒pBD2pBD2，卤乙酸降解质粒，卤乙酸降解质粒pUO1pUO1，2,4-D2,4-D降解降解质粒质粒pJP4pJP4，萘降解质粒，萘降解质粒pND6-1pND6-1和和pDTG1pDTG1。 The catabolic plasmids that complete sequence has been determinedPlasmid Substr
13、ates Strain Size (bp) Catabolic References genespOAD2 Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA Microbiology oligomers nylBC 1995,141:2585pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, J. Bacteriol. m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch 1999,181:1585pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108
14、845 atzA,atzB J. Bacteriol. atzC,atzDEF 2001,183:5684pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl Envi. Microbiol. 2002,4:856pAO1 Nicotine Arthrobacter 165 ndh, 6hlno J. Bacteriol. nicotinovorans kdh, dhph 2003,185:1976pCAR1 Carbazole P. resinovorans CA10 199035 carABCDEF J. Mol. Biol. antABC 2003,
15、326:21pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus 210205 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. Erythropolis BD2 2003,185:5269pUO1 Haloacetates Delfitia 67066 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. Acidovorans B 2003,185:6741pJP4 2,4-D Ralstonia 87688 tfdA, tfdB Envi.Microbiol. 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 tfdCDEF 2004,6:655pND6-
16、1 naphthalene Pseudomonas ND6 101858 nah Gene 2004,336:231pDTG1 naphthalene P. putida 83042 nah J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2004,341:7534.4 共生质粒 在许多根瘤菌属细菌中存在与结瘤和固氮有关的共生质粒，质粒的大小在1000 kb以上，与细菌染色体基因一同行使固氮功能。Sinorhizobium meliloti 的豆科共生复合基因组由3部分组成：染色体为3654 bp，pSymA为4226 bp结瘤和固氮，pSymB为1683333 bp。中华苜蓿根瘤菌Sin
17、orhizobium meliloti1021的基因组组成 性质 染色体 pSymA pSymB 基因组长度(bp) 3654 4226 1683333 6691694蛋白基因 3341 1293 1570 6204tRNA基因 51 2 1 54rRNA支配子 3 0 0 3共生功能 菌毛合成 菌毛合成 外表多糖 结瘤，固氮 外表多糖 固氮第2讲 质粒技术1. 质粒的分别和纯化2. 质粒的拷贝数测定3. 质粒DNA转化4. 细菌杂交实验5. 质粒的限制酶作图6. 质粒基因定位7. 质粒测序和基因注释8. 质粒克隆载体1 质粒的分别和纯化分别： SDS温暖裂解法；碱SDS室温裂解法；碱SDS加
18、热 (5065) 裂解法；煮沸裂解法；碱SDS蛋白酶裂解法。纯化: CsClEB密度梯度离心法 (角转头：40000rpm, 40h；近垂直转头：78000rpm, 4.5h)；低熔点琼脂糖凝胶回收法；凝胶冻溶法；凝胶透析袋回收法；凝胶透析膜回收法；纯化kit。细细胞胞裂裂解解物物进进展展琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，荧荧光光扫扫描描染染色色体体DNADNA带带和和质质粒粒DNADNA带带，根根据据峰峰面面积积计计算算质质粒粒占占总总DNADNA的百分数的百分数(RP)(RP)。RP RP = = (1.36(1.36质质粒粒峰峰面面积积)()(染染色色体体峰峰面面积积+1.36+1.36质质
19、粒粒峰面峰面积积) )测测定定一一个个细细胞胞中中总总DNADNA的的含含量量 (Mc (Mc = = DNADNA的的g g数数细细胞胞数数) )。计计算一个算一个质质粒的粒的质质量：量：MP = MP = 质质粒粒 bp bp 数数6601.6510-24 g6601.6510-24 g计计算算质质粒拷粒拷贝贝数：数：CP = (MCRP)MPCP = (MCRP)MP2 2 质质粒的拷粒的拷贝贝数数测测定凝胶定凝胶带荧带荧光光密度光光密度测测定法定法3 质粒DNA转化 质粒转化主要有3种方法：钙诱导的感受态转化，原生质体转化，电穿孔转化。影响转化的要素：质粒的大小、纯度、浓度、构型、稳定
20、性和能否被修饰；受体细胞的菌龄、用量、限制-修饰系统和重组功能，能否有不相容性质粒，与质粒原来寄主的亲源关系；挑选药物的浓度。 转化频率transformation frequency：每个活细胞产生的转化子数，测定时运用饱和DNA浓度。 转化效率transformation efficiency：每 mg DNA产生的转化子数，测定时运用亚饱和DNA浓度。 4 细菌杂交实验滤膜杂交：混合供体和受体菌培育物，用孔径为0.45mm的滤膜过滤，带菌的滤膜在营养平板上培育过夜，用无菌水洗下膜上的细菌，涂选择平板，挑选接合体。平板杂交：在选择平板上涂布供体菌和受体菌的混合物或分别划线受体菌和供体菌，培
21、育过夜，长出的菌落为接合体。液体杂交：静止培育供体菌和受体菌的混合物，然后涂选择平板，挑选接合体。例 ： PpG378 (Leu-Nah+) PpG376 (Leu+Nah-)5 质粒的限制酶作图 制造质粒限制图的方法主要有直接酶切法、重叠片段克隆法和测序法。直接酶切法是经过限制酶的完全消化和部分消化，确定各种限制酶切割位点在质粒中的位置，适用于小质粒；重叠片段克隆法是先进展限制片段的克隆，确定每个克隆片段的限制酶位点，以及各克隆片段在质粒中的陈列顺序，最后得到整个质粒的限制图，适宜于较大的质粒。最理想的方法是先测定质粒的核苷酸序列，然后根据限制酶的识别序列用计算机作图，适宜于一切质粒，特别是
22、巨型质粒。 pND1.860质粒的限制酶作图 重叠片段克隆法作图战略：Hind、EcoR和Xba单酶消化：测定限制片段大小和切点数。Hind完全消化片段克隆Hind + EcoR消化：确定Hind片段中的EcoR位点Hind部分消化片段克隆：Hind消化，确定Hind片段陈列顺序EcoR消化，确定EcoR位点 EcoR+ Xba消化，确定Xba位点 6 质粒基因定位：转座子插入突变法 把携带转座子的质粒引入含有待测质粒的细胞中，挑选并搜集含有插入突变的细胞，经过限制酶分析确定插入位点，然后测定含有转座子插入的细胞其待测基因能否失活，从而确定基因的大约位置。图图2-10 阿特拉津氯水解酶基因阿特
23、拉津氯水解酶基因atzA的定位的定位 7 质粒测序和基因注释(annotation) 质粒测序：用鸟枪克隆法，将纯化的质粒用超声波打碎，用琼脂糖凝胶电泳分别 1-kb片段，补平片段末端，与平末端pUC18衔接，电转化 E. coli DH5，挑选有插入片段的转化子，测定克隆片段的序列，根据测序结果拼接质粒序列，空缺部分用PCR方法补齐并测序。 质粒基因注释：向GenBank注册质粒序列，报告每个编码序列CDS，或称ORF的基因称号、位置、功能和翻译产物。哺乳动物细胞表达载体载体的类型：自主复制的瞬时表达载体：带有真核病毒复制子。与寄主基因组整合的表达载体：不含病毒复制子。哺乳动物细胞表达载体的
24、功能元件：原核细胞复制原点和挑选基因 (抗生素抗性)。 真核启动子和加强子元件。能进展染色体外复制的病毒复制子序列。在哺乳动物细胞中表达的选择标志基因 (抗生素或药物抗性)。终止和加poly(A)的信号序列。带有剪接供体和剪接受体功能位点的内含子序列 (用于mRNA剪接)多克隆位点。 哺乳动物细胞表达载体对克隆基因的要求： 普通运用cDNA。 克隆基因必需带有天然的 rbs 和单一的起始密码子AUG。图图2-21 瞬时表达载体瞬时表达载体pMSG 图图2-22 制备等基因表达的制备等基因表达的 Flp-InTM 寄主细胞系寄主细胞系 (invitrogen 公司公司) 图图2-23 制备制备 Flp-InTM 表达细胞系表达细胞系 (invitrogen 公司公司)
