食品安全快速检测技术7分子杂交技术

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1、分子杂交技术分子杂交技术一、分子杂交种类一、分子杂交种类二、二、分子杂交的一般程序分子杂交的一般程序三、三、杂交样品膜的制备杂交样品膜的制备 四、标记探针的制备四、标记探针的制备五、分子杂交与结果检测五、分子杂交与结果检测六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化分子杂交技术分子杂交技术o分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。分子的一门技术。样 品 制 备电 泳杂 交转 膜结果显示探探 针针 制制 备备分分 子子 杂杂 交交 流流 程程 图图核酸分子杂交核酸分子杂交一一. . 分子杂交种类分子杂交种类

2、1. 按其分子种类划分按其分子种类划分 1） DNA杂交杂交探针为探针为DNA或或RNA 2） RNA杂交杂交探针为探针为DNA或或cDNA 3） 蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析探针为抗体探针为抗体2. 按样品制备过程划分按样品制备过程划分 1） 原位杂交原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交原位组织块杂交 原位裂解细胞，原位裂解细胞，不需要分离不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于大量样品，常用于目的

3、基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的一特定的DNA、RNA或蛋白质序列或蛋白质序列。一一. . 分子杂交种类分子杂交种类 3）印迹转移杂交）印迹转移杂交(blotting hybridization) 先先纯纯化化样样品品，然然后后使使不不同同大大小小的的分分子子在在凝凝胶胶上上分分离离，转转移移到到固固体体基基质质上上，与与探探针针杂杂交交。该该法法可可检检测测出出感感兴兴趣趣分分子子的的分分子子量量。用用于于转转移移的的方方法有：法有： i. 扩散法扩散法 ii. 毛细管法毛细管法 iii. 电泳转移法电泳转移法 iv. 真空转移

4、法。真空转移法。 根根据据转转移移对对象象的的不不同同分分为为Southern印印记记法法（DNA）、Northern印印迹迹法法（RNA）和）和Western 印迹法（蛋白质）。印迹法（蛋白质）。一一. . 分子杂交种类分子杂交种类 2）斑点杂交）斑点杂交(dot hybridization) 先分离先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，放射自显影后，判断是否有杂交及其杂交强度，行杂交，放射自显影后，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测缺失或拷贝数改变的检测，半定量分析半定量分析。

5、 它利用两种探针与待测它利用两种探针与待测DNA结合，先结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制可用于粗制DNA样品，可检测出的样品，可检测出的DNA样样品品 4) 夹心杂交法夹心杂交法(sandwich hybridization)一一. . 分子杂交种类分子杂交种类 1) DNA和和RNA的杂交的杂交 制备制备DNA或或RNA样品样品与固定基质结合与固定基质结合80真空固定真空固定预杂交预杂交加

6、入标记探针杂交加入标记探针杂交洗涤洗涤放射自显影或显色反应。放射自显影或显色反应。 2）蛋白质的免疫分析蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品制备蛋白质样品与固定基质结合与固定基质结合常温空气中固定常温空气中固定封封闭剂封闭闭剂封闭 一抗反应一抗反应洗涤洗涤二抗二抗-酶偶联物反应酶偶联物反应洗涤洗涤显色显色反应（反应（EIA） 或或 一抗放射标记物一抗放射标记物洗涤洗涤放射自显影（放射自显影（RIA）二、二、 分子杂交的一般程序分子杂交的一般程序1. 固定基质的种类与特性固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类可与三类

7、大分子大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结不能结 合小分子合小分子DNA，RNA和蛋白质（和蛋白质（20,000）优点优点：i. 用于用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（用于蛋白质分析时，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高；可直接染色；分辨率高； 不需要预激活；易于操作不需要预激活；易于操作 缺点缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）次） 2）重氮化纸：）重氮化纸：D

8、BM纸与纸与DPT纤维素纸纤维素纸最大特点最大特点是能结合是能结合小分子小分子的的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同和蛋白质，共价结合，可用不同 探针进行探针进行多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 三、三、 杂交样品膜的制备杂交样品膜的制备 3) 尼龙膜尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜阳离子尼龙膜 i) 容量大容量大, 蛋白质可结合蛋白质可结合480g/cm2 ii) 可结合不同大小的可结

9、合不同大小的DNA，RNA和蛋白质。和蛋白质。 iii) 韧性好韧性好 iv) 可用于电转移可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色。不能用于蛋白质的直接染色。 ii. 尼龙尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态，时阴离子状态，电转移时要注意。电转移时要注意。 4）离子膜离子膜 i. DEAE-纤维素纸纤维素纸 ii. CM-纤维素纸纤维素纸三、三、 杂交样品膜的制备杂交样品膜的制备

10、 2. 固定基质的选择依据固定基质的选择依据 1）强度，耐久性，操作简便）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好）重现性好三、三、 杂交样品膜的制备杂交样品膜的制备 3. 各种杂交样品膜的制备各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜原位菌落杂交样品膜(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。 (2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上用无菌牙签将各个菌落先转移

11、至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。的菌落。 (3) 倒置平板倒置平板,于于37培养至划线的细菌菌落生长到的宽度。培养至划线的细菌菌落生长到的宽度。 (4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直

12、至琼脂,在在3个以上的不对称位置作个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。 (5) 用用Parafilm膜封好主平板膜封好主平板,倒置贮放于倒置贮放于4,直至获得杂交反应的结果。直至获得杂交反应的结果。 (6) 裂解细菌裂解细菌,按下述方法按下述方法,使释放的使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。结合于硝酸纤维素滤膜。 i) 细胞培养（高密度，几百细胞培养（高密度，几百十万个菌落或低密度，几百个十万个菌落或低密度，几百个以下）以下） ii) 细菌细胞原位裂解与细菌细胞原位裂解与DNA变性变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜原位噬菌斑杂

13、交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）平板） ii) 噬菌体转移噬菌体转移用用NCF作影印作影印 iii) DNA变性与固定（与上同）变性与固定（与上同）三、三、 杂交样品膜的制备杂交样品膜的制备 2） 斑点杂交样品膜的制备斑点杂交样品膜的制备 制备样品制备样品点样点样固定（可用斑点杂交仪或直接点样）固定（可用斑点杂交仪或直接点样）三、三、 杂交样品膜的制备杂交样品膜的制备 3）转移杂交样品膜的制备）转移杂交样品膜的制备 i. 扩散法（扩散法（Difusion blotting method ) 简单但不能定量简单但不能定量转移，与电转比

14、转移，与电转比较只能转移较只能转移25-50%的蛋白质。的蛋白质。 ii. 毛细管法毛细管法 (Capillary blotting method )毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将将DNA或或RNA自胶体转移至膜上。要转印完全，起码需要作用自胶体转移至膜上。要转印完全，起码需要作用6 h以上。以上。 虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 Southern、Northern印迹印迹iii.

15、电转移法电转移法 (electro blotting ) ：半干法和湿法电转。：半干法和湿法电转。iv. 真空转移法真空转移法 (Vaccum bllotting ) 转移速度与凝胶的厚度成反比，在相同转移率（转移速度与凝胶的厚度成反比，在相同转移率（50%）时，）时，真空法比毛细管法快真空法比毛细管法快13倍，其损失仅倍，其损失仅6%，而毛细管法损失率，而毛细管法损失率20%。 v. 各种转移方法的比较各种转移方法的比较 i) 扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩（扩散法为散法为70%，毛细管法，毛细管

16、法80%）耗时多。）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。vi. 转移的最佳条件转移的最佳条件 i) 固定基质的选择固定基质的选择 ii) 转移前预处理：转移前预处理：DNA和和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移大分子的转移对于分子量较大的对于分子量较大的DNA片段片段，必须进行，必须进行原位断裂原位断裂后再进行转移，断裂后

17、再进行转移，断裂DNA分子分子最佳长度为最佳长度为1-2kb。 其步骤是：其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次处理凝胶两次（每次15分钟）分钟）水洗水洗0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次两次，每次15分钟分钟转移。转移。 对于大分子蛋白质对于大分子蛋白质，可采用下述三种方法之一：，可采用下述三种方法之一： 解偶联剂使凝胶解聚；解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶蛋白酶作用；转移缓冲液中加入作用；转移缓冲液中加入SDS。四四. . 标记探针的制备标记探针的制备 1. 标记化合物的种类标记化合物的种类 1）放射性同位素标记物）放射性同位素标记物125I，3H，14C用于蛋白质标用于蛋白

18、质标记；记；32P，3H，35S用于核酸用于核酸标记，其中标记，其中32P和和35S使用频使用频率高。率高。32P标记核苷酸的标记核苷酸的位位或或位，位，35S则是标记核苷酸则是标记核苷酸的的位位. 2) 非放射性标记物非放射性标记物 i. 生物素生物素 分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一种碱性蛋白种碱性蛋白抗生物素蛋白抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可牢固地结合。每个抗生物素蛋白可结合结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。牢固，可

19、大大提高其灵敏度。 生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合物。物。 ii. 半抗原半抗原 包括汞，包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP（脱氧尿三（脱氧尿三磷酸）上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的磷酸）上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。酶偶联物反应和显色反应。 iii. 蛋白质检测标记物蛋白质检测标记物 i) 酶偶联二抗（

20、）酶偶联二抗（） ii) 蛋蛋白白质质A（来来自自金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌）。可可作作用用于于大大多多数数哺哺乳乳动动物的物的IgG（免疫球蛋白），灵敏度较低（免疫球蛋白），灵敏度较低（5ng） iii) 免疫金（免疫金（immunogold） 3) 两类标记化合物的比较两类标记化合物的比较 i. 灵敏度灵敏度 i ) 检测蛋白质，两种方法差不多。检测蛋白质，两种方法差不多。 ii) 检测核酸，放射法比酶法敏感。检测核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 稳定性稳定性 酶法探针可在酶法探针可在4保存一年，放射性标记需每次制备。保存一年，放射性标记需每次制备。 iii. 安全性安全性 非放射性标记

21、安全。非放射性标记安全。 iv. 效率效率 非放射性标记所需时间短。非放射性标记所需时间短。2. 标记探针的制备方法标记探针的制备方法 1）链标记法）链标记法 2) 末端标记末端标记 3) 3) 标记化合物的纯化标记化合物的纯化 1）链标记法链标记法 i. 切口移位法切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 随机随机DNADNA引物延伸法引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段片段+dNTP(32P) iii. 反转录法反转录法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（标记）（标记） iv. 转录法转录法 含有待

22、标记含有待标记DNA片段的重组质粒片段的重组质粒+NTP(32P)RNA（标记）（标记） SP6聚合酶聚合酶 v. 引物延伸法引物延伸法 含待标记含待标记DNA的单链的单链DNA分子分子(M13mp系列系列)+引物引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待标记待标记DNA链链 vi. T4 DNA聚合酶法聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶聚合酶, 无无dNTP3-5外切酶活性外切酶活性加入加入dNTP和标记和标记核苷酸核苷酸新合成链（新合成链（32P）2) 末端标记末端标记 i. 5-末端标记末端标记 ss-和和ds-DNA, RNA脱磷酸化反应脱磷酸化反应 (CIP) T4DNA连

23、接酶连接酶(-32P )ATP ii. 3-末端标记末端标记 i) TdT加尾反应，用于加尾反应，用于dsDNAii) 补齐反应补齐反应 iii) T4 RNA连接酶反应连接酶反应 RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi 3) 标记化合物的纯化标记化合物的纯化 i. 柱层析柱层析 利用利用Sephadex G-50，前峰，前峰-标记物，后峰标记物，后峰-核苷酸核苷酸 ii. 旋转柱层析旋转柱层析 快速，简便快速，简便, 可同时纯化多个样品。可同时纯化多个样品。下一节下一节双链双链DNADNA标记法一标记法一切口移位法切口移位法 （Nic

24、k TranslationNick Translation）o原理及过程：原理及过程：反应体系中反应体系中DNADNA酶酶I I随机在探针随机在探针DNADNA上打开缺口，然后利用上打开缺口，然后利用DNADNA聚合酶聚合酶I I 5 5 3 3外切酶活性，在缺口处按外切酶活性，在缺口处按5 5 3 3方向切除单核方向切除单核苷酸；在切除的同时苷酸；在切除的同时DNADNA聚合酶聚合酶I I有有5 5 3 3的聚合酶活性，在缺口处的聚合酶活性，在缺口处3 3端链接底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行，端链接底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行，缺口平移，并且

25、底物中被标记的单核苷酸被随机掺入。缺口平移，并且底物中被标记的单核苷酸被随机掺入。DNADNA聚合酶聚合酶I I的两种的两种作用交替进行，探针即被标记。作用交替进行，探针即被标记。 Nick Translation返回返回双链双链DNADNA标记法二标记法二随机引物法（随机引物法（6 6核苷酸引物标记法）核苷酸引物标记法） o原理及过程：原理及过程：利用利用E.coli E.coli DNADNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow亚单位亚单位，合成含有标记，合成含有标记核苷酸的核苷酸的DNADNA链。链。KlenowKlenow具有具有5 5 3 3聚合酶活性。被标记的聚合酶活性。

26、被标记的DNADNA（探（探针）变性成单链，引物与模板结合。在针）变性成单链，引物与模板结合。在KlenowKlenow的催化下，以引物的催化下，以引物3 3端端为起点，沿模板为起点，沿模板3 3 5 5方向合成方向合成DNADNA新链。反应体系中含有标记的新链。反应体系中含有标记的dNTP,dNTP,随机掺入新合成的随机掺入新合成的DNADNA链中，探针即被标记。链中，探针即被标记。返回返回 1. 核酸核酸杂交步骤与结果检测杂交步骤与结果检测 1）预杂交：预杂交： 预杂交液中常加入鲑鱼精预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是，若标记探针是cDNA或或RNA，预杂交液中还需加入多聚预杂交液

27、中还需加入多聚A以阻止特异性结合以阻止特异性结合, 42 4-6h或过夜。或过夜。 2）杂交：探针杂交：探针100变性，迅速冷却，加入预杂交液中，变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42一天一天五五. . 分子杂交与结果检测分子杂交与结果检测3）洗涤：）洗涤：2SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，常温洗涤两次，1SSC+0.1%SDS 65洗涤两次，每次洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算：分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算： T=4GC+2AT * 高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件；高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，

28、采用高强度杂交条件；若使低同源性若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。4）放射自显影或显色反应）放射自显影或显色反应 使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主要有两种酶：要有两种酶： i. 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶: 可

29、将可将3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯氯萘酚氧化成紫色沉淀物。萘酚氧化成紫色沉淀物。 ii. 碱性磷酸酶碱性磷酸酶的作用底物是的作用底物是5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，吲哚磷酸，在酶作用下，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰四该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。 iii. 两种酶偶联物的比较两种酶偶联物的比较 i) 碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高

30、10倍左右，但噪声大。倍左右，但噪声大。 ii) 碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续30分钟。分钟。 5) 杂交结果杂交结果2. 2. 蛋白质蛋白质的免疫分析的免疫分析 封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。杂交结果示意图杂交结果示意图六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o探针的选择探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或或cDNA双链探针双链探

31、针 在检测单链靶序列时应选用与其互补的在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针或单链探针或RNA探针探针 长的双链长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交 o探针的标记方法探针的标记方法 选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定；选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定； 但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在对灵敏

32、要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统 六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o探针的浓度探针的浓度总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加膜杂交中膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为标记探针与非放射性标记探针的用量分别为510ng/ml和和251000ng/ml，而原位杂交中，无论应，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，

33、其用量均为用何种标记探针，其用量均为 受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响 六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o杂交率杂交率 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行的条件下进行 在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形对靶序列杂交的情形 t1/2=ln2/kct

34、1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（s）k =形成杂交体的速率常数形成杂交体的速率常数mol/(Lxntxs)决定于探针长度（决定于探针长度（L）、探针复）、探针复杂度（杂度（N）、温度、离子强度、粘度和）、温度、离子强度、粘度和pHc =溶液中的探针浓度（溶液中的探针浓度（mol/L）六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o杂交最适温度杂交最适温度 杂交技术最重要的因素之一杂交技术最重要的因素之一 反应温度低于反应温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反

35、应温度再低（定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30），虽然互补），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱键结合的更弱 最适复性温度最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：）：Tor =Tm 25苛刻复性温度苛刻复性温度：Ts = Tm (10或或15)非苛刻复性温度非苛刻复性温度：Tns =Tm (30或或35) 可以通过使用高浓度盐溶液（如），或使用某些有机溶剂的水溶液降可以通过使用高浓度盐溶液（如），或使用某些有机溶剂的水溶液

36、降低反应温度低反应温度 现在认为，适当选择甲酰胺和盐水浓度及合适的反应温度，可使现在认为，适当选择甲酰胺和盐水浓度及合适的反应温度，可使DNA复性和复性和DNA-RNA杂交获得高特异性和更快的反应速度。杂交获得高特异性和更快的反应速度。 六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o杂交的严格性杂交的严格性 影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体在低于杂交体Tm值值25时杂交最佳时杂交最佳 。 通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严

37、格性 在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶DNA和非特异靶和非特异靶DNA（如鱼精或大肠杆菌（如鱼精或大肠杆菌DNA）的膜。在不同温度下使膜与探针）的膜。在不同温度下使膜与探针杂交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探针无杂交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探针无任何反应的温度就是最适温度任何反应的温度就是最适温度 六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o杂交反应时间杂交反应时间 在条件都得到满足的

38、情况下，杂交的成败就取决于保温时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间 一般杂交反应要进行一般杂交反应要进行20h左右左右推荐推荐用用Cot =值来计算杂交反应时间值来计算杂交反应时间Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间）和反应时间（t）的乘积，实验表明）的乘积，实验表明Cot =100时，杂交反应基本完时，杂交反应基本完成成 六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化o杂交促进剂杂交促进剂 惰性多聚体惰性多聚体可用来促进可用来促进250个碱基以上的探针的杂个碱基以上的探针的杂交率，对单链探针可增加交率，对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达切或随机引物标记的探针可增加高达100倍倍 硫酸葡聚糖、聚乙二醇（硫酸葡聚糖、聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酸）、聚丙烯酸 小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交 六、核酸分子杂交实验因素的优化六、核酸分子杂交实验因素的优化