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1、第十章第十章植物细胞培养的基本过植物细胞培养的基本过程和方法程和方法第一节第一节 植物细胞的获取植物细胞的获取细胞来源：1、外植体； 2、愈伤组织1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小； 叶片组织2、外植体的前处理：（1）冲刷材料; 流水 几分钟-数小时 吐温 (2) 表面浸润灭菌；超净台 70%酒精 10-30S（3）深层灭菌； 氯化汞 次氯酸钠 （4）无菌水冲洗。 3min/次 3-10次一、从外植体直接分离植物细胞一、从外植体直接分离植物细胞二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞愈伤组织的概念-P173形成过程：形成过程：1、起始期； （诱导
2、期） 准备进行分裂2、分裂期；细胞体积变小分生状态3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂怎样从愈伤组织分离得到细胞？怎样从愈伤组织分离得到细胞？P175 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。 果胶酶 增强分散效果第二节第二节 悬浮培养悬浮培养（cell suspension culture） 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游悬浮培养是细胞培
3、养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。术。 1、悬浮细胞的诱导、悬浮细胞的诱导-愈伤组织诱导愈伤组织诱导 要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。散易碎。 适于悬浮培养适于悬浮培养 适于再生植株适于再生植株如何获得符合要求的愈伤组织？如何获得符合要求的愈伤组织？1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶 是最常用的外植体，特别是幼胚。是最常用的外植体，特别
4、是幼胚。2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要 配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性 好、细胞状态好的细胞不断继代培养。好、细胞状态好的细胞不断继代培养。 悬浮细胞生长动态：悬浮细胞生长动态：基本的悬浮培养体系基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一均是将细胞分散在一定容积的培养液中进定容积的培养液中进行，在一个培养周期行，在一个培养周期不添加培养基。这种不添加培养基。这种培养体系基本是处于培养体系基本是处于封闭状态。当一种营封闭状态。当一种营养物质
5、耗尽时，细胞养物质耗尽时，细胞即停止生长。在这种即停止生长。在这种悬浮培养体系中，细悬浮培养体系中，细胞扩增生长成胞扩增生长成S形曲形曲线。线。细胞生长指标细胞生长指标1、细胞生长计量: 细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重2、细胞活力测定悬浮细胞培养的同步化悬浮细胞培养的同步化细胞同步化：细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。要
6、达到完全同步化相当困难。体积选择法：体积选择法：通过细胞体积大小分级，通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。体系中。饥饿法：饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。裂受阻，从而停留在某一分裂时期。抑制法：抑制法：通过一些通过一些DNA合成抑制剂处理合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除合成前期，当
7、解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1期期的同步化细胞。的同步化细胞。低温法：低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞冷处理也可提高培养体系中细胞 同步化程度。同步化程度。第三节第三节 固定化培养固定化培养 细细胞胞固固定定化化是是将将细细胞胞包包埋埋在在惰惰性性支支持持物物的的内内部部或或贴贴附附在在它它的的表表面面。其其前前提提就就是是通通过过悬悬浮浮培养获得足够数量的细胞。培养获得足够数量的细胞。方法：方法：吸附法、包埋法吸附法、包埋法n包埋式固定化培养系统：包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；脂、琼脂糖、藻酸
8、盐、聚丙烯酰胺等；n吸附式固定化培养系统：吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。第四节第四节 单细胞培养单细胞培养 悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。细胞培养还比
9、较困难。n1、平板培养、平板培养 n2、看护培养、看护培养n3、微室培养、微室培养n4、条件培养（双层滤纸培养）、条件培养（双层滤纸培养）1、细胞平板培养、细胞平板培养 平板培养平板培养(plate culture)：将一定密度的悬将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。 单细胞的分离：单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能用于平板培养的小细胞团不能超过超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。 单细胞悬浮液的制备：单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速分离的单细胞经低速离心，培养液
10、洗涤离心，培养液洗涤2次后，调整密度为次后，调整密度为5105ml。 植板：植板：将将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约于培养皿中，厚度约12mm。 封口：封口：用石蜡膜封培养皿。用石蜡膜封培养皿。2、看护培养、看护培养看护培养（看护培养（nurse culture）：）：是由是由Muir1954年设计的。年设计的。 操作方法：操作方法： 在固体培养基上置入一块在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待伤组织
11、上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其琼脂培养基上让其 迅速生长迅速生长3、微室培养、微室培养 它可对单细胞进行活体连续观察。这它可对单细胞进行活体连续观察。这一方法也可用于原生质体培养观察细一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。胞壁的再生和细胞分裂过程。4、双层滤纸培养、双层滤纸培养 Horsch等（等（1980）将平板培养与饲）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。板培养方
12、法。第五节第五节 原生质体培养原生质体培养 原生质体的特点原生质体的特点:具有全能性；具有全能性；无细胞壁障碍；无细胞壁障碍；吸收能力强、分泌能力提高；吸收能力强、分泌能力提高；可进行细胞融合。可进行细胞融合。 原生质体的制备原生质体的制备 基础材料准备基础材料准备预处理与酶解（或机械破壁）预处理与酶解（或机械破壁）原生质体收集与纯化原生质体收集与纯化原生质体活力测定原生质体活力测定1、用于分离原生质体材料的准备、用于分离原生质体材料的准备无菌试管苗叶片无菌试管苗叶片培养细胞培养细胞2、预处理与酶解、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴材料预处理：子叶、下胚轴;叶片叶片;愈伤组织或愈伤组织或
13、胚性悬浮细胞胚性悬浮细胞叶肉原生质体叶肉原生质体酶处理：酶处理： 酶浓度酶浓度 酶解时间酶解时间 酶解温度酶解温度3 3、原生质体的收集和纯化、原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂：飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖。蔗糖。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用酶液洗出干净，再用PercollPercoll飘浮一次。飘浮一次。 4、原生质体活力检测原生质体活力检测目测法：目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。原生质体活力。FDA法：法：FDAFDA（二乙酸荧光素）是一种非极
14、性物质，能自（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDAFDA被酯酶裂解即发荧被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。定活性。 原生质体培养方法原生质体培养方法
