DNA的三级结构ppt课件

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1、噬菌体T2DNA长约50m E-coli DNA 长约1mm 人生殖细胞DNA长约1m 三DNA的三级构造双链环状DNAdouble stranded cyclic DNA, DSCDNA 双链环状DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体DNA、细菌质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA等。 1共价闭合环状DNAcovalently closed circular DNA, cccDNA的超螺旋构造superhelical structure 构成超螺旋的根底: DNA双螺旋的扭曲构成超螺旋superhelix 负超螺旋负超螺旋 正超螺旋正超螺旋超螺旋超螺旋DNA的性质的性质 构造严

2、密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。构造严密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。变变性性2开环开环DNAopen circular DNA, ocDNA也称松环也称松环DNArelaxed circular DNA, rcDNA+3连环连环DNACatenanes DNA 单体单体二聚体二聚体1反复序列 repeated sequence 1高度反复序列highly repeated sequence 卫星DNAsatellite DNA 基因组genome四真核细胞染色体DNA构造主体主体DNAbulk DNA 卫星卫星DNAsatellite DNA 2中度反复序列moderately

3、repeated sequence 3单一序列unique sequence 2回文构造palindromic structure (1) 回文构造 回文构造也称反向反复inverted repeats(2) (2) 发夹形和十字形发夹形和十字形一RNA的类别 1核糖体RNAribosomal RNA, rRNA 2转移RNAtransfer RNA, tRNA 3信使RNAmessenger RNA, mRNA 五、RNA的构造4其它类别的RNA 1病毒RNAViral RNA, rRNA 2核内RNAnuclear RNA, nRNA 不均一核RNAheterogeneous nuclea

4、r RNA,HnRNA 小分子核RNAsmall nuclear RNA, sn RNA 小分子核仁RNAsmall nucleolar RNA, sno RNA 染色体RNAchromosomal RNA, ch RNA 3线粒体RNAmitochondrial RNA, mit RNA 4叶绿体RNAchloroplast RNA, chlRNA或ctRNA 二RNA的一级构造 1RNA分子中核苷酸之间的衔接方式3,5-磷酸二酯键 2RNA分子中核苷酸的陈列顺序 酵母tRNAAla小片段重叠法 直接阅读法直读法 1965年3几类RNA的一级构造 1 tRNA的一级构造 tRNA一级构造的共

5、同点: Mr较小Mr25000，沉降常数4S。 各种tRNA的链长很接近，普通在7393个核苷酸之间。 tRNA分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的不变和半不变的 各种tRNA的3一端为CCA；5一端大多数为pG，少数为pC。 tRNA分子中含有较多的修饰成分。 2rRNA的一级构造 原核生物核糖体 70S50S30S5S rRNA， 23S rRNA34种蛋白质16S rRNA21种蛋白质真核生物核糖体 80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49种蛋白质18SrRNA33种蛋白质3mRNA的一级构造 真核生物mRNA的一级构造可用下式表示 :5-帽子 5-非密码区

6、 密码区3-非密码区 polyA 5-cap：m7G(5)pppNmp 5-cap cap0: m7G(5)pppNp cap1: m7G(5)pppNmpNp cap2: m7G(5)pppNmpNmpNp 5-cap的功能 (1) 防止mRNA被核酸酶降解。(2) 为mRNA翻译活性所必需。(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。3-polyA : polyA的残基数20200个，或更多。polyA的功能 (1) 维护mRNA，免受核酸外切酶的作用。(2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。RNA前体 成熟RNA有功能的RNA 断裂、修剪、修饰

7、 三RNA的二级构造 大多数天然RNA是一条单链，经过本身回折构成部分螺旋区，部分非螺旋区。 少数病毒RNA如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等RNA是双链螺旋，类似于DNA的双螺旋构造。 RNA中双螺旋构造稳定的要素主要是碱基堆积力，其次是氢键。 1tRNA的二级构造 1aa接受臂amino acid arm 2二氢尿嘧啶环 dihydrouridine loop, DHU loop 3反密码环anticodon loop 4额外环extra loop 5TC环TC loop X光晶体衍射解出的 tRNA 立体构造 1980年牛心线粒体tRNAser只需63个核苷酸，沉降常数3S，短少D环

8、和D臂，呈二叶草型。 近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是规范的三叶草构造。 2rRNA的二级构造的二级构造 3mRNA的二级构造 The secondary structure of HEC-SODs mRNA. the free energy of result is 587.9J. 四四RNA的三级构造的三级构造 tRNA的三级构造的三级构造 六、核酸酶类包括核酸水解酶、合成酶、衔接酶等。 一核酸水解酶的分类 1底物：核糖核酸酶ribonuclease, RNase 脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease, DNase 2作用方式：核酸内切酶endonuclease3按磷酸二

9、酯键断裂的方式 4其它：如双链酶、单链酶等 核酸外切酶exonuclease二核糖核酸酶类 1牛胰核糖核酸酶pancreatic ribonuclease, 简称RNase A或RNase I 2核糖核酸酶T1ribonuclease T1，简称RNase T1 3核糖核酸酶T2ribonuclease T2，简称RNase T2 主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC AUCGAG三脱氧核糖核酸酶 1牛胰脱氧核糖核酸酶 pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I 2牛脾脱氧核糖核酸酶 spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II 3

10、限制性内切酶restriction endonuclease 简称限制酶 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对本身起了维护作用。发现概略: 1限制性内切酶的特征 具有严厉的碱基专注性，有专注的识别顺序、切点 粘性未端，平整末端 2限制性内切酶的命名 EcoRI 3限制性内切限制性内切酶举例例 四非专注性核酸酶类nonspecific nuclease 引见二种外切酶 1蛇毒磷酸二酯酶venom phosphodiesterase 5-核苷酸蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严厉的要求 寡核苷酸 水解速度 最快较慢，水解速度降低10倍最慢，几乎不作用，水解速度再降低100倍 橘青霉磷酸二

11、酯酶专注性： 与蛇毒磷酸二酯酶一样 2牛脾磷酸二酯酶 对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反 +3-核苷酸五磷酸单酯酶 将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物 1特异性磷酸单酯酶 2非特异性磷酸单酯酶 磷酸基无论在3或5位，都能水解，如E. coli磷酸单酯酶 1 磷酸基连在5位才干水解，如牛精液5-核苷酸酶 2 磷酸基连在3位才干水解，如麦芽3一核苷酸酶 一普通性质：分子大小、性状、溶解度。 分子大小：DNA Mr 1061010或更大性状： DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均不溶于普通的有机溶剂，微溶于水， 但它们的钠盐在水中溶解度

12、较大。 RNA Mr 104106或更大 七、核酸的性质和最常用的研讨方法二粘度 三酸碱性质 四紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有剧烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进展核酸的定量测定。 1紫外分光光度法 首先根据A260/A280的比值判别核酸样品的纯度纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0假设样品中含有杂蛋白或苯酚，那么A260/A280比值明显降低纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量假设260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA或相当于40g/ml单链DNA或RNA或相当于20g/ml寡核苷酸。2摩尔

13、磷消光系数molar absorptivity法 A：样品的光吸收值 C：每升溶液中磷的摩尔数 L：光径 在pH7.0时；DNA的 为6600, RNA的 为77007800。 ：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数 知道了磷的含量就可知核酸的含量3增色效应与减色效应 增色效应hyperchromic effect 减色效应hypochromic effect 五沉降特性 1核酸浮力密度的测定 浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度 氯化绝CsCl密度梯度沉降平衡 用12个知浮力密度的规范DNA样品作参考 式中 ：未知DNA的密度 0：规范DNA的密度 ：角速度弧度/秒 r： 未知DNA与转轴

14、之间的间隔 r0：知DNA与转轴之间的间隔 2DNA中G-C含量的测定 G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系 Rolfe-Meselson导出了如下公式： =0.100G-C%+1.658(g/cm3) 知道了浮力密度就可计算出G-C对的含量 3核酸的构象和分别 ：RNA环状DNA线状DNA蛋白质 DNA 沉降沉降六核酸的变性、复性和杂交 1变性denaturation 核酸变性的概念 引起核酸变性的要素 1热变性 构造：螺旋线团 理化性质：紫外吸收 粘度比旋光度 生物活性：生物活性或丧失 2熔点Tm Tm: 熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度 3影响Tm值的要素 DNA的均一性 DNA中

15、G-C对的含量 阅历式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 盐离子强度 2复性renaturation 1复性 理化性质: 比旋光度 粘度高于Tm值5 复性 也称退火 annealing生物活性得到部分恢复 2影响复性的要素 样品的性质 DNA的浓度 DNA片段的大小 温度 离子强度 3复性动力学 DNA的复性过程是一种双分子反响 S：single strand DNA D：double strand DNA 经重排，积分等 式中 C0：t=0时，起始DNA的浓度mol/L C：t时间时，单链DNA的浓度mol/L k：复性反响常数L/molsec t：复性时间sec CC0= 1 1

16、+kC0tCot : 时的时的Cot值，即指复性完成一半时的值，即指复性完成一半时的Cot值。值。 3杂交hybridization 核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可经过 碱基互补构成双螺旋构造。 单链DNA与单链DNA杂交DNA-DNA利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研讨同源性等。单链DNA与单链RNA杂交DNA-RNA单链RNA与单链RNA杂交RNA-RNA用硝酸纤维素膜作为支持物进展杂交 1975年英国E. M. Southern首创的Southern blottingSouthern印迹原理方法探针：作为检测用的知DNA序列或RNA序列的片段 1977年G.K.Stark首

17、创Northern blotting Northern印迹 Western blottingWestern 印迹 七凝胶电泳 核酸研讨中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、本钱低。 经过凝胶电泳 1可进展核酸分别，知道核酸的纯度。 2测定分子大小。 3估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段 适用于大分

18、子核酸，普通用于DNA分析。 一DNA的生物功能 1DNA与遗传 1DNA是主要的遗传物质间接证据直接证据八、核酸的生物功能 细菌转化作用 transformation 肺炎球菌pneumococcus 1928年细菌学家Griffith 细菌毒性实验 1944年Avery细菌转化实验 转化作用：转化作用的物质称转化因子 从一种细菌中得到DNA经过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改动。 噬菌体感染实验 1952年美国Hershey 噬菌体感染实验 转导作用transduction 人工合成基因的表达 3. DNA与遗传性疾病、癌变的关系1镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变2白化病的

19、基因缺失3癌变二RNA的生物功能 1RNA与蛋白质的生物合成 1mRNA与遗传密码 遗传密码genetic code 密码子codon mRNA的主要功能 2tRNA的作用 tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。 tRNA必需识别相应的氨基酸和识别mRNA上相应的密码子。 tRNA怎样识别相应的氨基酸: 主要靠高度专注的氨 酰-tRNA合成酶。tRNA怎样识别mRNA上相应的密码子 3rRNA的作用的作用 详见网上参考资料九、核酸的分别、纯化和核苷酸的制备 一核酸的分别、提取通那么 为了得到完好的大分子核酸，

20、普通要留意3点 :1坚持低温04。 2防止过酸、过碱，防止猛烈搅拌。 3防止核酸酶的作用。 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠SDS；或加蛋白变性剂。 抑制RNase： 1实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐diethyl pyrocarbonate, DEPC处置。 2加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。 3加核糖核酸酶阻抑蛋白RNasin等RNase的抑制剂。 二大分子DNA的提取 1资料的选择 2细胞破碎 3DNA-蛋白质DNP的提取 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白DNP，RNA与蛋白质结合成RNP

21、，而且DNP和RNP经常混在一同。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分别DNP和RNP。 可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。 相 对 溶 解 度NaClmol/LDNP在NaCl中的溶解度4去蛋白质 1SDS 2苯酚法 3氯仿法 4酚:氯仿:异戊醇25:24:1 5沉淀DNA 6去杂质 1去RNA 2去多糖 7进一步纯化 生物资料 DNPRNP DNP 纤维状DNA 较纯DNA 纯DNA *原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分别纯化要简单些。 破细胞1.0mol/L NaCl*去蛋白质酒精沉淀去RNA柱层析，电泳密度梯度离心去多糖三RNA的提取 1不同种类RNA的提取 2大分子RNA的提取 1酚提取 2酚-氯仿-SDS法 3mRNA的提取 4工业上制备RNA 1稀碱法 2浓盐法 四核酸纯度鉴定 1.A260/A280 2.电泳 五核酸含量的测定 1.定磷法 2.定糖法 3.紫外吸收法 六核苷酸的制备 1碱水解 2酶水解 3.自溶法