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1、第十八章第十八章 细胞工程与基因工程育种细胞工程与基因工程育种4植物离体培养的概念与应用植物离体培养的概念与应用:4组织与器官培养组织与器官培养:4花药和花粉培养与单倍体育种花药和花粉培养与单倍体育种:4植物细胞培养及其突变体筛选植物细胞培养及其突变体筛选:4原生质体培养与体细胞杂交原生质体培养与体细胞杂交:山东中医药大学药学院植物离体培养的概念与应用H植物离体培养的概念植物离体培养的概念：H植物离体培养的类型植物离体培养的类型：H植物离体培养在药用植物育种中的应用植物离体培养在药用植物育种中的应用：山东中医药大学药学院植物离体培养植物离体培养：即广义的植物组织培养，：即广义的植物组织培养，是
2、指通过无菌操作，将植物的组织、器官、是指通过无菌操作，将植物的组织、器官、细胞以及原生质体等接种于人工配制的培细胞以及原生质体等接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株和生产具有经养，以获得再生的完整植株和生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。是现济价值的其他生物产品的一种技术。是现代代生物技术生物技术的一个重要组成部分。的一个重要组成部分。山东中医药大学药学院生物技术生物技术（biotechnology、生物工程或生物工生物工程或生物工艺学艺学)：是指以生命科学为基础，利用生物体：是指以生命科学为基础，利用生物体系
3、和工程原理创造新品种和生产生物制品的系和工程原理创造新品种和生产生物制品的综合性科学技术。综合性科学技术。基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程发酵工程发酵工程生物化学工程生物化学工程蛋白质工程蛋白质工程山东中医药大学药学院基因工程基因工程：就是将生物体的遗传物质：就是将生物体的遗传物质（DNA）取出进行体外操作，包括基因的分取出进行体外操作，包括基因的分离、剪切、拼接、组合，然后将其转入寄主离、剪切、拼接、组合，然后将其转入寄主细胞，外源基因在寄主细胞内大量复制、表细胞，外源基因在寄主细胞内大量复制、表达，从而使寄主具有新的遗传性。基因工程达，从而使寄主具有新的遗传性。基因工程是按照人
4、们的预想重新设计生命。因为是遗是按照人们的预想重新设计生命。因为是遗传物质的重新组合，所以也叫重组传物质的重新组合，所以也叫重组DNA工程工程山东中医药大学药学院细胞工程细胞工程：是以细胞为基本单位在离体：是以细胞为基本单位在离体条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良生物品种和创造新种，或加速繁从而改良生物品种和创造新种，或加速繁育动植物个体或获得有用物质的过程。细育动植物个体或获得有用物质的过程。细胞工程包括的内容有细胞融合技术、组织胞工程包括的内容有细胞融合技术、组织培养技术、
5、细胞器移植技术和染色体工程培养技术、细胞器移植技术和染色体工程技术。技术。山东中医药大学药学院酶工程酶工程：指利用酶、细胞和细胞器所具：指利用酶、细胞和细胞器所具有的某些特异催化功能，借助生物反应器有的某些特异催化功能，借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需要的产品的一和工艺过程来生产人类所需要的产品的一种技术。种技术。发酵工程发酵工程：指给微生物提供最适宜的生：指给微生物提供最适宜的生长条件，利用微生物的某种特定的功能，长条件，利用微生物的某种特定的功能，通过现代化工程技术手段生产人类需要的通过现代化工程技术手段生产人类需要的产品。又称微生物工程。产品。又称微生物工程。山东中医药大学药学院生
6、物化学工程生物化学工程：简称生化工程，是由：简称生化工程，是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科，生物科学与化学工程相结合的交叉学科，主要研究将生物技术的实验室研究成果转主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产力过程中的带有共性的工程技术化为生产力过程中的带有共性的工程技术问题。问题。蛋白质工程蛋白质工程：指利用生物技术手段对蛋：指利用生物技术手段对蛋白质的白质的DNA编码序列进行有目的的改造并编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的技术的全新蛋白
7、质的技术。山东中医药大学药学院植物离体培养的类型（按植物离体培养的类型（按外植体外植体的种的种类和培养目的来分）类和培养目的来分）:c胚胎培养胚胎培养c组织培养组织培养c器官培养器官培养c花粉培养与花药培养花粉培养与花药培养c细胞培养细胞培养c原生质体培养原生质体培养山东中医药大学药学院外植体外植体：在离体条件下，分离下来进行培养的部分称为外植体。山东中医药大学药学院植物离体培养在药用植物育种中的应用植物离体培养在药用植物育种中的应用_扩大变异范围扩大变异范围_克服远缘杂交的一些障碍克服远缘杂交的一些障碍_获得体细胞杂种获得体细胞杂种_倍性控制倍性控制_突变的诱导和离体选择突变的诱导和离体选择
8、_加速亲本材料的纯化加速亲本材料的纯化_快速无性繁殖快速无性繁殖_获得脱毒苗获得脱毒苗_种质资源的试管保存种质资源的试管保存_可作为外源基因转化的受体系统可作为外源基因转化的受体系统山东中医药大学药学院组织与器官培养组织与器官培养实验室实验室4无菌操作室无菌操作室4培养室培养室4化学实验室、洗涤消毒室和细胞学实验室化学实验室、洗涤消毒室和细胞学实验室培养条件培养条件步骤与方法步骤与方法山东中医药大学药学院培养条件培养条件培养基培养基无菌操作无菌操作培养的环境条件培养的环境条件山东中医药大学药学院培养基培养基4种类种类固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基4营养成分营养成分4配方：常用的有配方
9、：常用的有MS、ER、B5、SH、HE等。等。4配制配制/洗涤洗涤/母液的配制母液的配制/配制步骤配制步骤山东中医药大学药学院营养成分营养成分4无机成分无机成分v大量元素：大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等。等。v微量元素：微量元素：Fe、Na、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I 等等4有机成分有机成分4天然复合物：常用的有椰乳、酵母提取物、水解天然复合物：常用的有椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等，还有番茄汁、黄瓜汁、橙汁、马铃薯酪蛋白等，还有番茄汁、黄瓜汁、橙汁、马铃薯汁等。汁等。4植物生长调节剂植物生长调节剂v生长素：常用的有生长素：常用的有2,4 -D、NAA、IAA、IBA等等v细胞分裂
10、素：常用的有细胞分裂素：常用的有6-BA、KT、ZT等等v赤霉素：赤霉素：GA3山东中医药大学药学院有机成分有机成分b能量物质：常用能量物质：常用2%3%蔗糖蔗糖b氨基酸：常用甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨氨基酸：常用甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等b维生素：常用维生素：常用Vc、VB1、VB6、生物素、烟酸、叶生物素、烟酸、叶酸、肌醇等。酸、肌醇等。山东中医药大学药学院无菌操作无菌操作4污染来源污染来源a培养基及玻璃器皿培养基及玻璃器皿a无菌操作室、所用器械无菌操作室、所用器械a外植体外植体4材料的消毒材料的消毒a消毒剂的种类：消毒剂
11、的种类：Ca(Cl0)2、NaClO、H2O2、AgNO3、HgCl2、酒精等酒精等a消毒方法：材料修整消毒方法：材料修整流水冲洗流水冲洗药剂药剂消毒（常用消毒（常用75%乙醇浸渍乙醇浸渍30s 0.1%升汞升汞浸泡浸泡210min或或2%10% NaClO浸泡浸泡1030min无菌蒸馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗35次）次）山东中医药大学药学院培养的环境条件培养的环境条件v光照：白色荧光灯，光强光照：白色荧光灯，光强10005000Lx，1216hr，用自动定时器控制光照时间用自动定时器控制光照时间v温度：多为温度：多为252v湿度：湿度：v容器内湿度：容器内湿度：100%v环境湿度：要求环境湿度：
12、要求70%80%山东中医药大学药学院组织培养的步骤与方法组织培养的步骤与方法4无菌培养的建立无菌培养的建立4营养繁殖体的增殖营养繁殖体的增殖P诱导腋芽的发生诱导腋芽的发生P诱导产生不定芽诱导产生不定芽P体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生4生根生根4试管苗移栽大田试管苗移栽大田山东中医药大学药学院花药和花粉培养与单倍体育种花药和花粉培养与单倍体育种4单倍体在植物育种上的单倍体在植物育种上的重要性重要性4花药和花粉培养花药和花粉培养技术技术4单倍体植株的染色体加倍单倍体植株的染色体加倍4自然加倍自然加倍4人工诱导加倍人工诱导加倍4从愈伤组织再生二倍体植株从愈伤组织再生二倍体植株山东中医药大学药学院单倍体
13、在植物育种上的重要性单倍体在植物育种上的重要性4单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体4有利于远缘杂交新类型的培育和稳定有利于远缘杂交新类型的培育和稳定4与诱变育种相结合可加速育种进程与诱变育种相结合可加速育种进程4可作为外源基因转化的受体系统可作为外源基因转化的受体系统山东中医药大学药学院花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术4花药培养花药培养4材料的选取材料的选取4材料灭菌材料灭菌4接种培养接种培养4再生单倍体植株再生单倍体植株4花粉培养花粉培养:4影响花药及花粉培养影响花药及花粉培养的的因素因素山东中医药大学药学院花粉培养花粉培养4花粉的分离花粉的分离4机械分离法
14、机械分离法4自然散落法自然散落法4花粉的培养花粉的培养4浅层液体培养法浅层液体培养法4看护培养法看护培养法山东中医药大学药学院影响花药及花粉培养的因素影响花药及花粉培养的因素4供体植株的基因型供体植株的基因型4培养基培养基4小孢子发育阶段小孢子发育阶段4供体植株的生理状态及培养前的预处理供体植株的生理状态及培养前的预处理4培养方式培养方式山东中医药大学药学院植物细胞培养及其突变体筛选植物细胞培养及其突变体筛选4单细胞培养单细胞培养4单离细胞的方法单离细胞的方法：4单细胞培养方法单细胞培养方法：4培养细胞的密度及活力测定培养细胞的密度及活力测定：4细胞突变体的筛选细胞突变体的筛选：山东中医药大学
15、药学院单离细胞的方法单离细胞的方法物理方法物理方法化学方法化学方法酶法酶法山东中医药大学药学院单细胞培养方法单细胞培养方法4液体浅层培养液体浅层培养4微滴培养微滴培养4平板培养平板培养4看护培养看护培养4饲喂层培养饲喂层培养4条件培养条件培养山东中医药大学药学院培养细胞的密度及活力测定培养细胞的密度及活力测定4起始培养的细胞密度：每毫升培养液起始培养的细胞密度：每毫升培养液104108个细胞个细胞4细胞活力测定：染色法细胞活力测定：染色法4荧光素双醋酸盐（荧光素双醋酸盐（FDA）4酚藏花红酚藏花红4Evans blue(Evans 蓝）蓝）4植板率的测定植板率的测定：山东中医药大学药学院植板率
16、：每个平板接种细胞总植板率：每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分率数中形成细胞团的百分率4植板率植板率=每平板形成的细胞团数每平板形成的细胞团数/每平板每平板接种的细胞总数接种的细胞总数 100%4每平板接种的细胞总数每平板接种的细胞总数=每毫升培养液中的每毫升培养液中的细胞数目细胞数目X该平板细胞培养液的毫升数该平板细胞培养液的毫升数4每平板形成的细胞团数计数方法每平板形成的细胞团数计数方法4低倍显微镜下直接计算低倍显微镜下直接计算4细胞团显影法细胞团显影法山东中医药大学药学院细胞突变体的筛选细胞突变体的筛选4细胞突变体筛选的一般技术细胞突变体筛选的一般技术4细胞材料的选择细胞材料的选择4
17、诱发突变的方法诱发突变的方法4突变细胞的选择方法突变细胞的选择方法4突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定4农业上有用性状的突变体离体筛选农业上有用性状的突变体离体筛选4对病害的抗性对病害的抗性4对土壤障碍的抗耐性对土壤障碍的抗耐性4对除草剂的抗性对除草剂的抗性4对温度的抗耐性对温度的抗耐性山东中医药大学药学院植物原生质体植物原生质体：是指除去细胞壁的由质：是指除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。膜包裹着的具有生活力的裸细胞。原生质体融合原生质体融合：也称体细胞杂交，指使：也称体细胞杂交，指使不同的原生质体相互融合形成杂种细胞，不同的原生质体相互融合形成杂种
18、细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。植株的过程。山东中医药大学药学院原生质体培养与体细胞杂交原生质体培养与体细胞杂交4原生质体的分离原生质体的分离4原生质体的培养原生质体的培养4原生质体的融合原生质体的融合4原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛选选4体细胞杂种植株的再生及其鉴定体细胞杂种植株的再生及其鉴定山东中医药大学药学院原生质体的分离原生质体的分离4分离原生质体的材料来源分离原生质体的材料来源 叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及悬浮细胞最常用。悬浮细胞最常用。4分离植物原生质
19、体的酶分离植物原生质体的酶4原生质体分离的操作程序原生质体分离的操作程序山东中医药大学药学院原生质体的培养原生质体的培养4原生质体的培养方法原生质体的培养方法4原生质体的分裂与增殖原生质体的分裂与增殖4植株再生植株再生山东中医药大学药学院原生质体的融合原生质体的融合4原生质体融合的类型原生质体融合的类型4诱导融合的方法和步骤诱导融合的方法和步骤山东中医药大学药学院胚性愈伤组织山东中医药大学药学院纯化后的原生质体山东中医药大学药学院基因工程基因工程育种育种分子育种：运用分子生物学技术，通过直分子育种：运用分子生物学技术，通过直接手段或间接手段选育新品种的途径。接手段或间接手段选育新品种的途径。4
20、基因工程与育种基因工程与育种 4分子标记辅助育种分子标记辅助育种 山东中医药大学药学院基因工程与育种基因工程与育种4基因工程的概念与基因工程的概念与作用作用4植物基因工程的方法与步骤植物基因工程的方法与步骤4基因工程的安全性评价基因工程的安全性评价山东中医药大学药学院基因工程的作用基因工程的作用抗病基因工程抗病基因工程抗虫基因工程抗虫基因工程抗除草剂基因工程抗除草剂基因工程抗逆境基因工程抗逆境基因工程提高果实耐贮性和切花寿命基因工程提高果实耐贮性和切花寿命基因工程提高产量和改良品质基因工程提高产量和改良品质基因工程山东中医药大学药学院植物基因工程的方法与步骤植物基因工程的方法与步骤目的基因的分
21、离和克隆目的基因的分离和克隆目的（外源）基因的导入目的（外源）基因的导入转基因植株的鉴定转基因植株的鉴定山东中医药大学药学院目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆鸟枪法鸟枪法mRNA分离法分离法转座子标签法及转座子标签法及T-DNA插入突变法插入突变法基因图谱的克隆法基因图谱的克隆法山东中医药大学药学院目的（外源）基因的导入目的（外源）基因的导入农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化DNA理化转移方法理化转移方法种质系统转化法种质系统转化法微激光束法微激光束法病毒载体法病毒载体法山东中医药大学药学院DNA理化转移方法化学刺激质粒入原生质体化学刺激质粒入原生质体电融合法电融合法微注射微注射基
22、因枪法基因枪法超声波处理法超声波处理法碳化硅纤维介导碳化硅纤维介导DNA转移法转移法电泳法电泳法山东中医药大学药学院转基因植株的鉴定转基因植株的鉴定外源基因整合的鉴定外源基因整合的鉴定外源基因转录水平的鉴定外源基因转录水平的鉴定外源基因表达蛋白的检测外源基因表达蛋白的检测报告基因的酶法检测报告基因的酶法检测山东中医药大学药学院基因工程的安全性评价基因工程的安全性评价安全性评价的意义安全性评价的意义安全性评价与控制措施安全性评价与控制措施申报与审批制度申报与审批制度山东中医药大学药学院分子标记辅助育种分子标记辅助育种4分子标记的种类及其原理和方法分子标记的种类及其原理和方法4RFLP标记标记4RAPD标记标记4AFLP标记标记4SSR标记标记4分子标记辅助育种的分子标记辅助育种的应用应用山东中医药大学药学院分子标记辅助育种的应用分子标记辅助育种的应用4分子标记与育种亲本选择分子标记与育种亲本选择4分子标记与育种过程监测和个体的鉴定分子标记与育种过程监测和个体的鉴定4分子标记与品种审定分子标记与品种审定山东中医药大学药学院
