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1、乙肝丙肝核酸检测的新平台乙肝丙肝核酸检测的新平台 COBASCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqManAmpliPrep/COBAS TaqMan 全自动荧光定量分子诊断系统全自动荧光定量分子诊断系统顾顾 剑剑罗氏分子诊断罗氏分子诊断 自动化程度 1992 1996 1998 2001 2003 2006 MWPCOBASAMPLICOR COBAS AMPLIPREP COBASAMPLICORMONITOR罗氏分子诊断罗氏分子诊断标准化标准化自动化自动化重复性重复性COBAS TAQMAN 48COBAS TAQMAN 96一直以来，罗氏分子诊断对临床一直以来，罗氏分子诊断对
2、临床核酸检测市场提供完善可靠和创核酸检测市场提供完善可靠和创新性的产品及解决方案新性的产品及解决方案目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题治疗终点无法准确判定有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临床症状依然明显不能及时预测耐药（病毒学突破）核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下，不久却发现病毒出现反跳疗效的准确监测？治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后问题的根源在哪里？问题的根源在哪里？内内 容容HBV核酸检测的现状与需要核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CT
3、M能带来什么益处总结HBV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用监测在抗病毒治疗中的临床应用HBV DNA是监测抗病毒治疗监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物HBV 治疗的路线图理念，为HBV DNA监测用于临床实践提供了指导对用药耐药性的监测用药耐药性的监测（拉米夫定YMDD，）肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）HBV DNA监测的的临床床应用用HBV治治疗路路线图 Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案方案优化，中国肝化，中国肝脏病病杂志志国产试剂现状国产试剂现
4、状目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HBV试剂盒说明：5005107 IU/mL较可信的测试范围：1045107 IU/mL对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测注：注：1 IU/mL= 1 copy/mL内内 容容HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结HCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用监测在抗病毒治疗中的临床应用HCV病毒感染是可治愈的疾病HCV RNA检测可以有效指导临床用药治疗的终点治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检测可以直接指导停药时机）慢性慢性HCV治疗方案治疗方案用药用药12周早期病毒
5、学反应周早期病毒学反应HCV RNA下降下降2log继续治疗至继续治疗至48周周继续治疗至继续治疗至24周周考虑停药考虑停药国产试剂现状国产试剂现状目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HCV试剂盒说明：5005107 IU/mL较可信的测试范围：1045107 IU/mL注：1 IU/mL= 1 copy/mL内内 容容HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的罗氏的CAP/CTM能带来什么益处能带来什么益处总结全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统真正实现真正实现 “样品进，结果出样品进，结果出”
6、全球安装超过全球安装超过 2,000台，国内安装超过台，国内安装超过 40台台COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系统系统COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48系统COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统（带连接系统）COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统（无连接系统）COBAS AmpliPrep仪器简介仪器简介全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制 基于MGPMGP磁珠磁珠分离技术，确保高质量的核酸提取纯化最多72个样品可以同时上机，运行中可连续装载上架，提高工作效率
7、包括耗材、样品、试剂均可以连续上样DNA或者RNA1.裂解、稳定和去蛋白裂解、稳定和去蛋白2.核酸捕获核酸捕获病毒或细胞3.冲洗冲洗4.洗脱洗脱37C孵育孵育COBAS AmpliPrep仪器仪器MGP 磁珠分离技术磁珠分离技术室温室温80C孵育孵育取SPU枪头样本管/反应管管盖抓手样本初始体积感应器取试剂钢针CAP机械臂介绍机械臂介绍样本管/反应管结构COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析仪简介分析仪简介检测通量可达4*24测试独立的24孔热循环仪TaqMan 48有2个模块，TaqMan 96有4个模块最多可同时进行4个不同的分析检测 操作简单，核酸扩增和检测全部自动
8、完成实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏度高和特异性好，动态范围宽HBV-DNA定量测试定量测试用于药品用于药品FDA注册试验注册试验通用名商品名 FDA批准日期关键的HBV-DNA测试Interferon alfa-2b-2b 干扰素 INTRON A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV1998杂交研究解决方案 1Adefovir dipivoxil阿德福韦酯 HEPSERA2002Amplicor Monitor 2Entecavir恩替卡韦BARACLUDE2005Cobas Amplicor 3Peginterferon alfa-2a聚乙二醇干扰素-
9、2aPEGASYS2005Cobas Amplicor 4Telbivudine替比夫定TYZEKA2006Cobas Amplicor 5Tenofovir替诺福韦VIREAD (HIV)Phase 3Cobas TaqMan 6 INTRON A (Interferon alfa-2b) package insert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV INTRON A (Interferon alfa-2b) package insert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2.
10、EPIVIR-HBV (Lamivudine) package insert GlaxoSmithKline, Research Triangle park, NC 3. HEPSERAHEPSERA (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences. Foster City, CA 4. 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) package insert. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TYZEKA (Telbivudine) Package Insert. No
11、vartis Pharmaceuticals TYZEKA (Telbivudine) Package Insert. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HI国外发表的文献国外发表的文献Evaluation of initial virological
12、response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, 2008, 15, 392398Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV
13、RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology ,2008, 43, 162168COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Journal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828834Evaluat
14、ion of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4) Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor Monitor
15、TM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al., Journal of Medical Virology 2005, 77:486490Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and plasma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virolog
16、y 2009 Jul;45(3):232-6Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 274-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan
17、 Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Stephane Chevaliez et al., Journal of Clinical, May 2008, p. 17161723HBV的定量检测性能指标的定量检测性能指标国产国产HBV试剂试剂CAP/CTM HBV灵敏度灵敏度 (LOD)500 IU/mL？12 IU/mL检测范围检测范围1045107 IU/mL54 - 1.1108 IU/mL定量方法定量方法外标法定量内标法定量内标法定量其它其它对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测涵盖亚型: A-G
18、加强加强pre-core突变检测突变检测注：注：国产试剂国产试剂1 IU/mL= 1 copy/mLHCV的定量检测性能指标的定量检测性能指标国产国产HCV试剂试剂CAP/CTM HCV灵敏度灵敏度 (LOD)500 IU/mL？15 IU/mL检测范围检测范围1045107 IU/mL43 6.9107 IU/mL定量方法定量方法外标法定量内标法定量内标法定量其它其它未知1-6 型 (能区分 0.5 log浓度变化)定量原理定量原理外标法定量（国产试剂）外标法定量（国产试剂）使用一组（4管）外部标准品定量，分别为5105104 4到5107 IU/mL未考虑各患者血液成分间的差异性各患者血液
19、成分间的差异性对结果的影响定量原理定量原理内标定量内标定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM)内标是已知拷贝数的人工构建核酸，加入每一反应管，与靶核酸竞争扩增，管内定量可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性结果避免假阴性结果充分考虑管间反应效率的差异充分考虑管间反应效率的差异，得到可靠精确的结果 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统系统封闭样品管输入，封闭封闭样品管输入，封闭PCR管输出管输出 标准化，重复性标准化，重复性纯化好纯化好的核酸的核酸主反应液主反应液PCRPCR反应体系的配制反应体系的配制试剂、样品和耗材的装载上机试
20、剂、样品和耗材的装载上机样品处理单元K-枪头K-管样品试剂罗氏分子诊断严格的生产和质控体系罗氏分子诊断严格的生产和质控体系为整个行业设定了高标准为整个行业设定了高标准1. 原料严格把关3. GMP生产2. 原料质检4. GMP生产6. 成品质检5. 试剂盒成品7. 资料入档COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan全自动荧光定量分子诊断系统的应用全自动荧光定量分子诊断系统的应用抗病毒治疗评估和监测（抗病毒治疗评估和监测（HBV/HCV），为临床医生和病人提高更准确的结果，指导用药。可针对疑难病例、低病毒载量、长期用药或高端病人肝移植肝移植的术前术后监控全国药物、诊断试剂临床评估
21、临床评估实验基地CAP室间质评时有与国际接轨与国际接轨的平台，评价更科学基础研究基础研究的工具，文章可信度大大增加国内部分用户国内部分用户省份省份用户用户主要检测项目主要检测项目仪器类型仪器类型北京北京大学人民医院肝炎所（魏来）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京大学基础医学院（庄辉）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京友谊医院（贾继东）HBV/HCVCAP/CTM 48浙江浙江大学附属第一医院（李兰娟）HBV/HCVCAP/CTM 48广东南方医院（侯金林）HBV/HCVCAP/CTM 96北京北京大学第一医院HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京协和医院HBV/HCV/HI
22、VCAP/CTM 48上海上海瑞金医院（张欣欣）HBV/HCVCAP/CTM 48四川华西医科大学附属华西医院（唐红）HBV/HCVCAP/CTM 96湖北武汉同济医院HBV/HCVCAP/CTM 48广东广州第八人民医院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海公共卫生中心HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48重庆西南医院(毛青) (装机中)HBV/HCVCAP/CTM 48重庆重医大附二院(任红，张大志) (装机中)HBV/HCVCAP/CTM 48国内用户现已超过40家 国内国内HBV核酸检测实例核酸检测实例共检测21份国产试剂HBV均为阴性的标本其中CAP/CTM HBV仍
23、为阴性者共9份，CAP/CTM HBV为阳性者共12份。阳性率57.1%1份国产试剂阴性样本，CAP/CTM HBV检测达到106 IU/mL。估计因耐药产生HBV病毒突变致使国产试剂无法检测CAP/CTM HBV在国产试剂阴性样本中的阳性表血清学指标特征血清学指标特征构成比（构成比（CAP/CTM HBV阳性阳性/国产试剂国产试剂HBV阴性）阴性）HBsAg+, HBeAb+, HBcAb+ (小三阳)8/13HBsAg+, HBeAg+, HBcAb+ (大三阳)2/3HBsAg+, HBcAb+1/1HBsAg+, HBeAg+, HBcAb+, HBeAb+1/1HBsAb+, HBcAb+0/2HBsAb+, HBcAb+, HBeAb+0/1总总 结结COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan全自动荧光定量分子诊断系统的特点全自动荧光定量分子诊断系统的特点国际金标准国际金标准灵敏度和重复性明显优于国产试剂，对抗病毒治疗重要灵敏度和重复性明显优于国产试剂，对抗病毒治疗重要唯一内标定量，结果精准唯一内标定量，结果精准全自动全封闭体系，保证结果的重现性全自动全封闭体系，保证结果的重现性We Innovate Healthcare
