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1、一、基因工程中的几个易错易混问题1限制性核酸内切酶使双链DNA特定部位的磷酸二酯键断开，解旋酶使双链DNA的氢键断开。2DNA连接酶与DNA聚合酶都能催化形成磷酸二酯键，前者催化连接DNA片段，后者催化单个的脱氧核苷酸聚合形成DNA。RNA聚合酶催化单个的核糖核苷酸聚合，形成RNA。3质粒并不是宿主细胞生命活动所必需的，但其可使宿主细胞具有对抗生素产生抗性、产生抗生素、降解复杂有机物等抵御外界不利因素的能力。4基因组文库包含了某种生物的全部基因，cDNA文库只包含某种生物的部分基因。5启动子位于基因的首端，它驱动基因转录出mRNA，起始密码子位于mRNA的首端，它驱动mRNA翻译成多肽链。6将
2、目的基因导入植物细胞常用土壤农杆菌转化法，常导入植物体细胞，经组织培养后形成转基因植株；导入动物细胞常用显微注射法，常导入受精卵，经胚胎移植获得转基因动物；利用基因工程生产药物时，常将基因导入微生物，导入大肠杆菌常用Ca2处理成感受态细胞再进行转化。7检测是否导入目的基因及目的基因是否转录出mRNA常用DNA分子杂交法，检测目的基因是否表达出蛋白质常用分子杂交法，有时基因工程还需要进行个体生物学水平鉴定。8DNA复制用解旋酶打开氢键获得模板链，PCR利用高温使氢键断裂得到模板链。9基因工程通过转基因获得异种生物的蛋白质，蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，对蛋白质进行改造或制造出自然界没有的蛋白
3、质。二、细胞工程中的几个易混易错问题1单克隆抗体制备中的两次筛选(1)第一次筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合的细胞、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。(2)第二次筛选是将能产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。2克隆技术应注意的问题(1)植物组织培养的目的不同，培养阶段也就不同：若生产人工种子，则培养到胚状体阶段；若提取细胞产品，则一般培养到愈伤组织阶段；若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。(2)动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养(基础)、动物细胞融合、动物细胞核移植等。(3)动物细胞融合和植物体细胞杂交产生的后代中都含有
4、两个亲本的遗传物质；植物组织培养和人工种子产生的后代中都只含有一个亲本的遗传物质。(4)植物体细胞杂交后的细胞具有全能性，动物细胞融合后的杂种细胞没有全能性。(5)动物体细胞核移植是将动物的一个体细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。(6)植物体细胞杂交的终点是培育杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束。三、胚胎工程中易混淆的概念1内细胞团和滋养层细胞：在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎一端的、个体较大的细胞，称为内细胞团，将来发育成胚儿的各种组织；而沿透明带内壁扩展和排列的、个体较小的细胞，称为
5、滋养层细胞，将来发育成胎膜和胎盘。2核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同的原因分析：(1)克隆动物的绝大部分DNA来自供体细胞核，但细胞质中线粒体的DNA来自受体卵母细胞。(2)性状是基因与环境共同作用的结果。(3)个体发育中可能发生基因突变，产生新的性状。1人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如下图所示。(1)卵母细胞除从活体输卵管中采集外，还可从已处死的雌鼠_中获取。(2)图中的高血压相关基因作为_，质粒作为_，二者需用_切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有_有关。(3)子代大鼠如果_和_，即可分别在分子
6、水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是_、早期胚胎培养和胚胎移植。解析：(1)对于实验动物大鼠，如果是从活体输卵管中采集的卵母细胞，可以直接与获能的精子在体外受精。如果是从已处死的雌鼠卵巢中采集的卵母细胞，需要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。(2)题图中的高血压相关基因作为目的基因，质粒作为载体，二者需用同种限制性核酸内切酶切割后才能连接成重组载体，该过程与质粒上有限制酶切割位点有关。(3)若在子代大鼠的体内检测出与高血压相关的蛋白质，则从分子水平上说明高血压相关基因已成功表
7、达；若子代大鼠的血压升高，则从个体水平上说明高血压相关基因已成功表达。(4)在转基因动物的培育过程中，需要用到的胚胎工程技术主要有体外受精技术、早期胚胎培养和胚胎移植等。答案：(1)卵巢(2)目的基因载体同种限制性核酸内切酶(或同种限制酶)限制酶切割位点(3)检测到体内有相关蛋白出现高血压(4)体外受精2克隆技术是人类医学科学史上的一个里程碑，在于其为人类认识自身奥秘和纷繁复杂的生物界提供了锐利武器并展示了广阔前景。“治疗性克隆”指把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞、肌肉细胞
8、和血细胞)，用于替代疗法。下图所示为人类“治疗性克隆”的大概过程，请据图作答。(1)过程A表示_，是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术的主要操作是应用患者的体细胞作为核供体，由细胞提供_，进行人工重组。(2)经过程B得到的结构中，是未分化的细胞，因而这些细胞被认为是胚胎干细胞。在体外培养条件下，胚胎干细胞具有增殖能力并保持_状态。(3)在进行C过程时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是_。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_。(4)“治疗性克隆”的结果说明高度分化的体细胞的核仍然具有_。相同的胚胎干细胞，“克隆”的结果各种各样，如有的是神经细胞，有的是血细胞，有
9、的是肌肉细胞，究其本质原因是_的结果。解析：本题考查与治疗性克隆有关的核移植、动物细胞培养及胚胎干细胞的有关问题。(1)A过程为将供体的体细胞的细胞核移植到受体的去核的卵母细胞中，图中所示供体提供细胞核，受体提供细胞质。(2)在体外培养的条件下，胚胎干细胞只能增殖但不发生分化。(3)动物细胞培养的培养液中常需要加入血清，可以补充培养基中缺乏的物质。CO2的作用是维持培养液酸碱度的相对稳定。(4)高度分化的动物细胞核仍然具有全能性。细胞分化的实质是基因的选择性表达。答案：(1)细胞核移植细胞质(2)未分化(3)血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液的pH(4)全能性基因选择性表达1基因工程
10、(1)一个原理：基因重组。(2)两项技术：体外DNA重组技术、转基因技术。目的基因获取的两条途径：直接从自然界已有的物种中分离、人工合成(化学合成法、PCR技术)。(3)三种工具：限制酶、DNA连接酶和载体。限制酶主要从原核生物中提取，具有专一性，切割外源DNA产生黏性末端或平末端；EcoliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端；常见的载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(4)三类转化法：植物农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；动物显微注射法；微生物Ca2处理法。(5)四个操作步骤：获取目的基因，构建基因表达载体，将目的基因导入受体细胞
11、，目的基因的检测与鉴定(DNA分子杂交；DNAmRNA分子杂交；抗原抗体杂交实验；从个体水平鉴定，如抗虫、抗病接种实验)。(6)基因表达载体的四部分组成：启动子、目的基因、终止子、标记基因。(7)三类标记基因：抗生素基因、表达产物有颜色的基因、发光基因等。(8)蛋白质工程“四步”曲：预期蛋白质的功能，设计预期蛋白质的结构，推测应有的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列。(9)质粒载体的五个条件：有一至多个酶切位点，能自我复制，有标记基因，具有安全性，大小合适。(10)五种酶的比较：限制酶识别双链DNA的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶连
12、接的是两个DNA片段，形成的也是磷酸二酯键，不需要模板；解旋酶是将双链DNA解开，破坏的是氢键；DNA聚合酶是将两个脱氧核苷酸连接起来，形成磷酸二酯键，其需要模板；RNA聚合酶是促进转录过程形成RNA。2细胞工程(1)基本技术植物细胞工程基本技术：植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术。动物细胞工程基本技术：动物细胞培养技术、动物细胞核移植技术、动物细胞融合技术、单克隆抗体技术，其中，动物细胞培养是其他技术的基础。(2)细胞融合方法诱导植物体细胞的原生质体融合的方法：离心、振动、电激或用聚乙二醇作为诱导剂。动物细胞融合常用的诱导方法：聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。(3)植物体细胞杂交和动物细胞融
13、合的结果及原理植物体细胞杂交过程：植物细胞融合，杂种细胞的植物组织培养。结果：形成杂种植株，产生了一个生物体。原理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。动物细胞融合过程：用胰蛋白酶处理获得分离的单个动物细胞，用一定的方法诱导细胞融合，形成杂种细胞，再进行细胞培养。结果：动物细胞融合形成杂种细胞，杂种细胞进行细胞培养，获得大量的克隆细胞，但没有形成生物体。原理：细胞增殖和细胞膜的流动性。(4)五个注意植物体细胞杂交和动物细胞培养都需要酶：植物体细胞杂交需要纤维素酶和果胶酶去壁，动物细胞培养需要胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理细胞间质。植物组织培养需要脱分化和再分化，动物细胞培养不需要脱分化；植物组织培养的
14、结果是获取植株或细胞代谢产物(愈伤组织阶段)，动物细胞培养获得的是细胞或细胞分泌物。植物组织培养用的是固体培养基，加入的是细胞分裂素、生长素和蔗糖等；动物细胞培养用的是液体合成培养基，加入的是葡萄糖、血浆、血清等，还需要氧气、二氧化碳等气体条件。动物细胞核移植的受体细胞是减数第二次分裂中期的去核的卵母细胞，单克隆抗体的制备至少需要两次细胞筛选。生物导弹技术是利用单克隆抗体的特异性来识别目标，然后将药物与单克隆抗体进行捆绑，具有定点打击的作用。3胚胎工程(1)基本技术：体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养。(2)关键知识点哺乳动物的受精及早期胚胎发育：精子卵子受精卵卵裂期桑椹胚囊胚原肠胚
15、。受精标志：在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体。受精完成的标志：雌、雄原核的融合。(3)卵子和精子能够受精的前提条件比较成熟的精子并不代表具有受精能力，必须获能后才具备受精能力。动物排出的卵子并未成熟且成熟程度因动物种类不同而异，但只有达到减数第二次分裂中期时，才具备与精子受精的能力。(4)从细胞识别和生理上来分析两个保障同种生物精卵结合的保障：卵细胞透明带上存在精子的特异性识别受体，只允许同种生物的精子与卵细胞结合。防止多精入卵的保障：透明带反应、卵细胞膜反应。(5)胚胎移植的培育流程对供、受体母牛进行选择，并用激素进行同期发情处理。用激素(促性腺激素)对供体母牛做超数排卵处理，超数排卵的
16、母牛发情后，选择同种优良的公牛进行配种或人工授精。冲卵(胚胎的收集)后，对胚胎进行质量检查，这时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段，并培养或保存。胚胎的移植。对受体母牛进行是否妊娠的检查。受体母牛产下胚胎移植的犊牛。(6)克隆动物的培育过程：对去核的雌性动物的卵母细胞与供体动物的细胞核(一般在培养10代以内，其细胞核型没有发生变化)进行细胞核显微注射，获得重组细胞，该重组细胞在一定条件下进行有丝分裂(卵裂)，获得早期胚胎，之后再进行胚胎移植。(7)八个注意冲卵是从供体母牛体内获得早期胚胎的过程，而不是获得受精卵或卵细胞。胚胎分割的材料：发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。囊胚期分割要求：内细胞团均等
17、分割，以免影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。囊胚细胞开始分化，但囊胚的内细胞团细胞具有全能性。胚胎移植以及胚胎分割移植的操作对象是桑椹胚、囊胚。克隆动物与试管动物：试管动物的产生过程是有性生殖，克隆动物的产生过程是无性生殖。试管动物和克隆动物的培育过程中在形成早期胚胎之前都是在体外进行的，经过胚胎移植之后是在体内进行的。用来进行胚胎移植的胚胎有三个来源：体内正常受精产生的胚胎、核移植产生的重组细胞培养而来的胚胎、体外受精产生的早期胚胎。胚胎干细胞来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体积小、细胞核大、核仁明显等特点，具有发育的全能性。4生物工程技术应用的组合(1)转基因植物培育：
18、基因工程植物组织培养。(2)转基因动物培育：基因工程动物细胞培养胚胎移植。(3)核移植(克隆)动物培育：核移植动物细胞培养胚胎移植。(4)胚胎移植：有性生殖动物细胞培养胚胎移植。(5)植物体细胞杂交：酶工程体细胞融合植物组织培养。(6)试管婴儿：体外受精动物细胞培养胚胎移植。1(2015年长春调研)下图是某单基因遗传病的家系图，请分析并回答：(1)据图分析，该病的致病基因位于_染色体上。为诊断2号个体是否为杂合子，可将致病基因的DNA片段用_作标记制成探针进行检测。为获得大量致病基因，通常采用PCR技术进行扩增，该技术成功的关键是要有_酶，扩增的前提是要有一段该致病基因的核苷酸序列，以便根据这
19、一序列合成_。(2)若该病会导致病人免疫力下降，治疗需要大量的抗体。临床使用的鼠源性单抗(一种单克隆抗体)是用经过免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用_培养基筛选出杂交瘤细胞，然后进行_和抗体检测，再经多次筛选、培养进而提取出的，鼠源性单抗具有特异性强、_，并可在体外大量制备的特点。(3)若5号个体在连续隔周注射某种鼠源性单抗治疗一种病毒感染性疾病，开始病毒量明显减少，一段时间后，这种病毒量又开始上升。上升的原因可能是病毒发生了_，还可能是人体产生了能与鼠源抗体特异性结合的_，使鼠源性单抗不能发挥抗病毒的作用。(4)目前，研究人员可应用_技术，改造鼠源性单抗分子的结构，降低人体对鼠源性单抗的免疫反
20、应。解析：(1)由3、45可推断，该遗传病的致病基因为常染色体上的隐性基因。利用放射性同位素标记的致病基因DNA片段作为探针，可以检测2号个体是否为杂合子。PCR技术的关键是要有热稳定的DNA聚合酶。(2)单克隆抗体需用经过免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用特定的选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，然后进行克隆化培养和抗体检测再经多次筛选、培养进而提取获得。单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高，并可在体外大量制备等特点。(3)病毒的遗传物质裸露，容易受外界因素的影响而发生突变。(4)通过蛋白质工程，可以获得自然界并不存在的蛋白质。答案：(1)常放射性同位素热稳定(或耐高温)的DNA聚合(Taq)引物(2)
21、特定的选择性(选择)克隆化培养灵敏度高(3)变异(突变、基因突变)抗体(4)蛋白质工程2下图为培育转基因抗虫棉的技术流程，请据图回答：(1)质粒上标记基因的作用是_。(2)过程是_，这是基因工程的核心步骤，其目的是_。(3)过程采用最多的方法是_，检测抗虫基因是否整合到棉花细胞DNA分子上的方法是_。(4)过程的培养基除含有必需的营养物质、琼脂外，还需要添加_，过程的实质是_。解析：(1)基因工程中运载体上的标记基因的作用主要是可以通过标记基因检测目的基因是否导入成功。(2)过程是基因表达载体的构建过程，主要的目的是使目的基因在受体细胞中稳定保存并遗传给后代，同时能够使目的基因能够表达和发挥作
22、用。(3)过程是将重组质粒导入受体细胞，最常用的方法是采用农杆菌转化法，检测抗虫基因是否整合到棉花细胞DNA分子上采用DNA分子杂交的方法。(4)是植物组织培养的脱分化过程，在培养过程中必须要添加植物激素。过程是再分化过程，实质是基因的选择性表达。答案：(1)检测受体细胞中是否含有目的基因(2)基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用(3)农杆菌转化法DNA分子杂交(4)植物激素基因的选择性表达题组集训1(2012年高考海南卷)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此，可将丙种蛋
23、白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。回答下列问题：(1)为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的_序列，据此可利用_方法合成目的基因。获得丙种蛋白质的基因还可用_和_方法。(2)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需要使用_酶和_酶。(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗_的危害。(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子_(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。解析：本题考查抗虫作
24、物培育过程的相关知识。(1)获取目的基因的方法主要有基因文库获取法、PCR技术扩增法和人工化学合成法三种。已知丙种蛋白质氨基酸序列，可通过推测丙种蛋白质的基因序列，然后利用化学方法人工合成丙种蛋白质基因。(2)在构建重组质粒的过程中，需要使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶，前者能识别特定的核苷酸序列，使每条链特定部位的核苷酸之间的磷酸二酯键断开形成黏性末端，被喻为“分子手术刀”；后者能使两个带有相同黏性末端的DNA片段连接起来，被称为“分子针线”。(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，可筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，而后培养出含有丙种蛋白质的抗乙种昆虫的植株。(4)若只用
25、重组质粒感染甲种农作物叶片伤口，可在叶片组织中筛选出含丙种蛋白质的细胞，由于该重组质粒感染的是体细胞，故该植株的种子中不含有丙种蛋白质基因。答案：(1)基因化学基因文库PCR(其他合理答案也可)(2)限制DNA连接(3)乙种昆虫(4)不含2回答下列问题。(1)在哺乳动物的核移植实验中，一般通过_(物理方法)将受体细胞激活，使其进行细胞分裂和发育，当胚胎发育到_阶段时，将胚胎移入受体(代孕)动物体内。(2)一般情况下，体外扩增目的基因常用的方法是_。在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用_处理
26、。(3)获取干扰素的传统方法是从人的白细胞中提取，但产量很低。科学家利用_酶将干扰素基因与牛乳腺蛋白基因的_(即RNA聚合酶识别与结合的部位)等调控组件连接在一起，采用_的方法将重组DNA导入牛的_细胞中，经胚胎早期培养一段时间后移植入母体内发育成熟，即可获得能产生干扰素的转基因牛，大大提高了干扰素的产量。解析：(1)哺乳动物的核移植实验中，一般通过电脉冲(或电刺激)激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。只有当胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段时，才可移入受体(代孕)动物体内。(2)一般情况下，常用PCR技术体外扩增目的基因。在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止
27、分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用胰蛋白酶处理。(3)启动子是RNA聚合酶识别与结合的部位。将目的基因导入牛的受精卵细胞中常采用显微注射的方法。答案：(1)电脉冲(或电刺激)桑椹胚或囊胚(2)PCR技术(多聚酶链式反应)接触抑制胰蛋白酶(3)DNA连接启动子显微注射受精卵3矮牵牛是观赏花卉，生产上常用组织培养繁殖，下表是在不同条件下矮牵牛不同部位组织培养结果。请结合实验结果和有关知识回答。(1)培养基接种前需要对外植体进行_处理，培养基进行_处理，以防止污染。(2)从表中结果可知，选择_作外植体，6BA浓度为_，NAA浓度为_时可以获得大量的无根试管苗
28、。(3)培养基中，6BA属于_类生长调节剂，NAA属于_类生长调节剂。无根试管苗在移栽前需要诱导生根，诱导生根的培养基中一般不加入_(填“6BA”或“NAA”)，并且需要降低培养基中_浓度，以便提高试管苗的自养能力。解析：为了防止在培养过程中杂菌的污染，需对外植体进行消毒处理，对培养基进行灭菌处理。由表中信息知，选择叶或茎尖作外植体，6BA浓度为2 mg L1，NAA浓度为0.2 mgL1时，可以获得大量无根试管苗，结合植物组织培养技术可知，6BA属于细胞分裂素类生长调节剂，NAA属于生长素类生长调节剂。诱导生根的培养基中一般不加入6BA，为提高试管苗的自养能力，需降低蔗糖浓度，降低试管苗对蔗糖的依赖性。答案：(1)消毒灭菌(2)叶或茎尖2 mgL10.2 mgL1(3)细胞分裂素生长素6BA蔗糖
