《临床样本的采集运输与保存及核酸提取ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床样本的采集运输与保存及核酸提取ppt课件（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床标本的采集、处置、运送与临床标本的采集、处置、运送与保管及保管及DNA/RNADNA/RNA提取提取 熊符熊符南方医科大学南方医科大学Guangzhou 2019, Apr.13Guangzhou 2019, Apr.13研讨背景研讨背景l 样本的采集、处置样本的采集、处置l 样本的保管样本的保管l 样本的运输样本的运输l DNA DNA的提取的提取l RNA RNA的提取的提取研讨背景研讨背景一、样本的采集、处一、样本的采集、处 理、保管及运输理、保管及运输临床标本的正确采集、运送、保管临床标本的正确采集、运送、保管的重要性的重要性l l临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键
2、性环节临床检验的质量保证关键性环节临床检验的质量保证关键性环节l l处理涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一处理涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一处理涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一处理涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一一、样本的采集一、样本的采集地地贫检测样品采集：品采集： 外周血外周血: 5mL 脐带血血: 0.51mL 羊羊 水：水：2030mL 绒 毛：毛：15mg 唾唾 液液 组 织标本采集的本卷须知标本采集的本卷须知l l一切标本的采集、运送和处置应在无菌操作，防止污染的原那一切标本的采集、运送和处置应在无菌操作，防止污染的原那一切标本的采集、运送和处置应在无菌操作，防止污染的原那
3、一切标本的采集、运送和处置应在无菌操作，防止污染的原那么下进展么下进展么下进展么下进展l l已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送l l采集足够量标本采集足够量标本采集足够量标本采集足够量标本l l每份标本都应标志患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、每份标本都应标志患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、每份标本都应标志患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、每份标本都应标志患者姓名、送检号码、标本来源、详细部位、日期、时间及相关临床信息日期、时间及相关
4、临床信息日期、时间及相关临床信息日期、时间及相关临床信息全全 血血l l以全血作以全血作为待待测标本本时，必需留意抗凝，必需留意抗凝剂的的选择，普通运用，普通运用EDTA-Na2EDTA-Na2或枸椽酸或枸椽酸钠，不可运用肝素不可运用肝素l l全血全血样本如用于本如用于DNADNA提取提取检测，可，可44下短下短期保管期保管, ,如用于如用于RNARNA检测，那么，那么应在取血后，在取血后，尽快提取尽快提取RNARNA血清浆血清浆l lDNADNA测定，可按照普通的血清定，可按照普通的血清标本本处置程序，置程序，对测定影响不大定影响不大l lRNARNA测定，定，标本的本的获取和保管方式取和保
5、管方式对测定定结果，能果，能够有决有决议性影响。最好是运用性影响。最好是运用EDTAEDTA抗凝抗凝( (严禁运用肝素禁运用肝素) )全血全血标本，抗凝后本，抗凝后6 6小小时内分内分别血血浆，如运用血清，如运用血清标本，那么需本，那么需尽快尽快(2(2小小时内内) )分分别血清，血清，标本的短期本的短期1 12 2周保管可在周保管可在-20-20下，下，较长期保管期保管应在在- -7070下下 肝素的作用机理肝素的作用机理 l l肝素肝素肝素肝素对对MLVMLV逆逆逆逆转录酶转录酶和和和和TAQ DNATAQ DNA聚合聚合聚合聚合酶酶均很均很均很均很强强的抑的抑的抑的抑制造用，假制造用，假
6、制造用，假制造用，假设临设临床床床床标标本本本本为为肝素抗凝，那么在核酸肝素抗凝，那么在核酸肝素抗凝，那么在核酸肝素抗凝，那么在核酸纯纯化化化化过过程中，程中，程中，程中，标标本中的肝素可本中的肝素可本中的肝素可本中的肝素可结结合于合于合于合于DNADNA和和和和RNARNA上上上上l l对标对标本本本本进进展煮沸、凝胶展煮沸、凝胶展煮沸、凝胶展煮沸、凝胶过滤过滤、酸碱、酸碱、酸碱、酸碱处处置后凝胶置后凝胶置后凝胶置后凝胶过滤过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这这种干种干种干种干扰扰作用作用作用作用l
7、l每每每每gg核酸核酸核酸核酸标标本中参与本中参与本中参与本中参与0.1U0.1U的肝素，即可的肝素，即可的肝素，即可的肝素，即可100%100%的抑制的抑制的抑制的抑制酶酶活性活性活性活性l l在在在在标标本中参与肝素本中参与肝素本中参与肝素本中参与肝素酶酶I I 或或或或13 U/g13 U/g核酸在于核酸在于核酸在于核酸在于5 mM 5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 下作用下作用下作用下作用2 2小小小小时时可去除肝素的抑制造用可去除肝素的抑制造用可去除肝素
8、的抑制造用可去除肝素的抑制造用二、样本的运送二、样本的运送 l l样样本一本一本一本一经经采集，那么采集，那么采集，那么采集，那么应应尽能尽能尽能尽能够够快的送至快的送至快的送至快的送至检测实验检测实验室室室室l l样样本中如参与了适当的本中如参与了适当的本中如参与了适当的本中如参与了适当的稳稳定定定定剂剂，如用于，如用于，如用于，如用于DNADNADNADNA测测定的定的定的定的EDTAEDTAEDTAEDTA抗凝血等，那么可在室温下运送或抗凝血等，那么可在室温下运送或抗凝血等，那么可在室温下运送或抗凝血等，那么可在室温下运送或邮邮寄寄寄寄l l建建建建议议：将全血：将全血：将全血：将全血标
9、标本或本或本或本或DNADNADNADNA样样本用冰袋加泡沫盒快本用冰袋加泡沫盒快本用冰袋加泡沫盒快本用冰袋加泡沫盒快递递运送。如需提取运送。如需提取运送。如需提取运送。如需提取RNARNARNARNA的的的的样样本需本需本需本需预处预处置后加置后加置后加置后加lml lml lml lml TrizolTrizolTrizolTrizol在低温运送在低温运送在低温运送在低温运送三、样本的保管三、样本的保管l l常常常常规规外周血外周血外周血外周血标标本，采集后做血常本，采集后做血常本，采集后做血常本，采集后做血常规规，常温，常温，常温，常温2424小小小小时时内，内，内，内，4 4可保管可保
10、管可保管可保管1 1周；做血周；做血周；做血周；做血红红蛋白蛋白蛋白蛋白电电泳常温泳常温泳常温泳常温1 1周，周，周，周，电电泳泳泳泳4 4可保管可保管可保管可保管1515天；天；天；天；DNADNA提取提取提取提取样样本常温本常温本常温本常温2424小小小小时时，4 4保管保管保管保管1 1个星期，个星期，个星期，个星期， 20 20 保管保管保管保管3 3个月，个月，个月，个月，70 70 保管半年保管半年保管半年保管半年3 3年；年；年；年；RNARNA提取提取提取提取样样本常本常本常本常温温温温6 6小小小小时时，4 4保管保管保管保管1212小小小小时时， 70 70 保管保管保管保
11、管3 3个月，羊水在个月，羊水在个月，羊水在个月，羊水在1212小小小小时时内离心可保管同上。内离心可保管同上。内离心可保管同上。内离心可保管同上。研讨背景研讨背景 二、核酸的提取二、核酸的提取核酸提取的重要性核酸提取的重要性l l核酸提取是临床核酸提取是临床PCRPCR检验最为关键的部分，检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分亦是手式操作的主要部分l l核酸提取的成败关系到临床核酸提取的成败关系到临床PCRPCR检验的正确检验的正确与否与否l l临床临床PCRPCR检验操作中最易出问题的环节检验操作中最易出问题的环节一、提取核酸总的原那么一、提取核酸总的原那么l l保证核酸一级构造的完好
12、性；保证核酸一级构造的完好性；保证核酸一级构造的完好性；保证核酸一级构造的完好性；l l其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应分子的污染应分子的污染应分子的污染应降低到最低程度；降低到最低程度；降低到最低程度；降低到最低程度；l l核酸样品中不应存在对酶有抑制造用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制造用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制造用的有机溶剂和过核酸样品中不应存在对酶有抑制造用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；
13、l l其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取其他核酸分子，如提取DNADNADNADNA中的中的中的中的RNARNARNARNA，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。，也应尽量去除。二、核酸提取的根本步骤二、核酸提取的根本步骤1 1、核酸的释放：、核酸的释放：破裂细胞破裂细胞释放核酸释放核酸 机械法与非机械法机械法与非机械法 非机械法中溶胞法是应最广泛的方法非机械法中溶胞法是应最广泛的方法各种组织细胞破碎方法各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 应用应用应用应用 机械法机械法机械法机械法1.1.1.1.匀浆法匀浆法匀浆法匀浆法机体
14、软组织机体软组织机体软组织机体软组织2.2.2.2.捣碎法捣碎法捣碎法捣碎法动物韧性组织动物韧性组织动物韧性组织动物韧性组织3.3.3.3.研磨法研磨法研磨法研磨法细菌、酵母细菌、酵母细菌、酵母细菌、酵母 物理法物理法物理法物理法1.1.1.1.超声法超声法超声法超声法细胞混悬液细胞混悬液细胞混悬液细胞混悬液2.2.2.2.反复冻融法反复冻融法反复冻融法反复冻融法培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞3.3.3.3.冷热交替法冷热交替法冷热交替法冷热交替法细菌、病毒细菌、病毒细菌、病毒细菌、病毒4.4.4.4.低渗裂解低渗裂解低渗裂解低渗裂解红细胞红细胞红细胞红细胞 化学法化学法化学法化学法1.1.
15、1.1.有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2.2.2.2.去垢剂去垢剂去垢剂去垢剂组织、培养细胞、组织、培养细胞、组织、培养细胞、组织、培养细胞、血液血液血液血液3.3.3.3.酶解法酶解法酶解法酶解法细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2 2、核酸的分别与纯化：、核酸的分别与纯化：、核酸的分别与纯化：、核酸的分别与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分别他物质分别他物质分别
16、他物质分别 非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖和脂 类分子、非需求的核酸分子、试剂和溶液类分子、非需求的核酸分子、试剂和溶液类分子、非需求的核酸分子、试剂和溶液类分子、非需求的核酸分子、试剂和溶液3 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子参与一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后运用有参与一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后运用有
17、参与一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后运用有参与一定的盐类醋酸钠、氯化钠等后运用有机溶剂如乙醇、异丙醇等机溶剂如乙醇、异丙醇等机溶剂如乙醇、异丙醇等机溶剂如乙醇、异丙醇等少数盐类可运用少数盐类可运用少数盐类可运用少数盐类可运用70-75%70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤的乙醇洗涤的乙醇洗涤 4. 核酸的鉴定核酸的鉴定 浓度鉴定浓度鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 完好性鉴定完好性鉴定浓度鉴定浓度鉴定DNADNA：1 1紫紫外外分分光光光光度度法法：测定定DNADNA在在A260nmA260nm的的光吸收光吸收值。 如如计算算DNADNA浓度度 A260 A260稀稀释倍数倍数5050 g/ml g/ml紫紫外
18、外分分光光光光度度法法只只用用于于测定定浓度度大大于于0.25ug/ml0.25ug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸RNARNA：l l紫外吸光光度法紫外吸光光度法: l l A260稀稀释倍数倍数40 g/mll l(OD260-OD320)稀稀释倍数倍数40 g/mll l 2 2 2 2荧光光度法荧光光度法荧光光度法荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，
19、且荧光强度与核酸含量呈正比。发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析适用于低浓度核酸溶液的定量分析适用于低浓度核酸溶液的定量分析适用于低浓度核酸溶液的定量分析1-5ng1-5ng1-5ng1-5ngEB与DNA的结合纯度鉴定纯度鉴定紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：紫外分光光度法：在在在在260nm260nm和和和和280nm280nm处测定处测定处测定处测定DANDAN溶液的光吸收，纯溶液的光吸收，纯溶液的光吸收，纯溶液的光吸收，纯的的的的DNA A260DNA A260与
20、与与与A280A280之比应在之比应在之比应在之比应在1.80 (1.601.80)1.80 (1.601.80)，低于此值阐明制备物中留有蛋白质成份。高于，低于此值阐明制备物中留有蛋白质成份。高于，低于此值阐明制备物中留有蛋白质成份。高于，低于此值阐明制备物中留有蛋白质成份。高于此值阐明有此值阐明有此值阐明有此值阐明有RNARNA的残留量的残留量的残留量的残留量纯的纯的纯的纯的RNA A260RNA A260与与与与A280A280之比应在之比应在之比应在之比应在2.0(1.802.00), 2.0(1.802.00), Ratio1.8 : Ratio2.2 : RNA; Ratio2.2
21、 : RNA能够能够能够能够曾经水解成单核苷酸曾经水解成单核苷酸曾经水解成单核苷酸曾经水解成单核苷酸A260/A280比值是纯度检测的重要目的！比值是纯度检测的重要目的！注：注：注：注：测测定吸光定吸光定吸光定吸光值值，稀，稀，稀，稀释释液液液液应应运用运用运用运用完好性鉴定完好性鉴定凝胶电泳法：凝胶电泳法：基因组基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，假设发生电泳，在电场中泳动慢，假设发生降解，可出现电泳图谱脱尾景象；降解，可出现电泳图谱脱尾景象；总总RNA电泳，观测各条带的含量，提示能否存电泳，观测各条带的含量，提示能否存在在RNA降解；如加样槽中存在条带，能够是降解；如加样槽中存在条带，能够是
22、DNA污染。污染。DNA完好性鉴定：完好性鉴定：正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否那么提示倍，否那么提示RNA的降解的降解RNA完好性鉴定：完好性鉴定：5 5、核酸的、核酸的、核酸的、核酸的储储存存存存DNADNA保管保管保管保管 1 1 1 1短期短期短期短期储储存：存：存：存： 4 4 4 4或或或或-20-20-20-20存放于存放于存放于存放于TETETETEtristristristris和和和和EDTAEDTAEDTAEDTA缓缓冲液中。冲液中。冲液中。冲液中。 TETETETE缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的PHPHPHPH与与与与D
23、NA DNA DNA DNA 储储存存存存有有有有关关关关，PHPHPHPH为为8 8 8 8时时，可可可可减减减减少少少少DNADNADNADNA脱氨反响，脱氨反响，脱氨反响，脱氨反响，PHPHPHPH低于低于低于低于7.07.07.07.0时时DNADNADNADNA容易容易容易容易变变性。性。性。性。2 2 2 2长长期期期期储储存：存：存：存： TETETETE缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中-70-70-70-70保保保保管管管管数数数数年年年年；在在在在DNADNADNADNA溶溶溶溶液液液液中中中中加加加加一一一一滴滴滴滴氯氯仿仿仿仿可有效防止可有效防止可有效防止可有效防止细细菌和核
24、酸的菌和核酸的菌和核酸的菌和核酸的污污染。染。染。染。核酸的核酸的核酸的核酸的储储存存存存RNARNA保管：保管：保管：保管：l lRNARNA可溶于可溶于0.3mol/L0.3mol/L的醋酸的醋酸钠钠溶液或双蒸水，在溶液或双蒸水，在- -7070保管。保管。l lRNARNA可溶于可溶于70%70%的乙醇溶液或去离子的甲的乙醇溶液或去离子的甲酰酰胺溶液胺溶液中，可在中，可在-20 -20 保管。保管。l lRNARNA假假设设以以DEPCDEPC焦碳酸二乙焦碳酸二乙酯酯可以抑制可以抑制RNARNA酶酶对对RNARNA的降解的降解三、基因组三、基因组DNA的分的分别与纯化别与纯化一、一、DN
25、A样品预备样品预备l l 常常见见的的标标本：本：l l 血液、尿液、唾液、血液、尿液、唾液、组织组织及培育及培育细细胞等胞等l l 生物生物组织组织：l l 最好新最好新颖组织颖组织，假，假设设不能不能马马上提取，上提取，应储应储存存 l l 70 70或液氮或液氮DNA提取前样本采集、提取前样本采集、预处置和保管：预处置和保管：l l全血全血全血全血l l 抗凝剂：抗凝剂：抗凝剂：抗凝剂：l l EDTA-Na2 EDTA-Na2l l 或枸橼酸钠或枸橼酸钠或枸橼酸钠或枸橼酸钠l l 作为抗凝剂作为抗凝剂作为抗凝剂作为抗凝剂l l 不宜运用肝素不宜运用肝素不宜运用肝素不宜运用肝素 抗凝剂处
26、理血抗凝剂处理血肝素肝素柠檬酸柠檬酸* *EDTA*EDTA*-80-80保存保存2 2个月，第个月，第1010天收率天收率90%90%4 4 第四天收率第四天收率90%90%第第1010天提取效天提取效果差果差第十天收率第十天收率85%85%室温室温提取效果差提取效果差第四天收率第四天收率90%90%第十天提取效果差第十天提取效果差二、二、DNA提取提取l l一酚抽提法：一酚抽提法：l l 先先用用EDTAEDTA、 SDSSDS、蛋蛋白白酶酶K K破破碎碎细细胞胞，消消化化蛋蛋白白，然然后后用用pH8pH8的的TrisTris饱饱和和酚酚或或酚酚- -氯氯仿仿抽抽提提DNADNA，最最后后
27、乙乙醇醇或或异异丙丙醇醇进进展展沉沉淀淀。获获DNADNA大小为大小为100100150kb150kb。酚酚抽抽提提法法提提取取步步骤：骤：DNA酚抽提法表示图主要试剂的作用：主要试剂的作用：主要试剂的作用：主要试剂的作用： EDTA EDTA：1. 1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 2. 降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性SDSSDS的作用：的作用：的作用：的作用：1. 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使溶解膜蛋白和脂肪，从而使溶解膜蛋白和脂肪，从而使溶解膜蛋白和脂肪
28、，从而使细细胞膜破裂胞膜破裂胞膜破裂胞膜破裂2. 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释释放出来放出来放出来放出来3. 3. 对对RNARNA、DNADNA酶酶有抑制造用有抑制造用有抑制造用有抑制造用4. 4. 与蛋白与蛋白与蛋白与蛋白质质构成构成构成构成R-O-SO3 .RR-O-SO3 .R蛋白蛋白蛋白蛋白质质复合物，复合物，复合物，复合物，使蛋白量使蛋白量使蛋白量使蛋白量变变性性性性蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K：水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化水
29、解蛋白质的作用，消化DNADNA酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质酶和细胞中的蛋白质蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在力，而且在力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍坚持较高活性，可存在时仍坚持较高活性，可存在时仍坚持较高活性，可存在时仍坚持较高活性，可 同时运用同时运用同时运用同时运用苯酚：苯酚：苯酚：苯酚：蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制蛋白质强变性剂、抑制DNADNA酶活
30、性酶活性酶活性酶活性苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水苯酚溶于有机溶剂，微溶于水提取提取提取提取DNADNA前苯酚用前苯酚用前苯酚用前苯酚用Tris-HclTris-Hcl饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多饱和，防止吸收过多DNADNA，降低，降低，降低，降低DNADNA的损失率的损失率的损失率的损失率氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏氧化苯酚会破坏DNADNADNADNA的沉淀：的沉淀：的沉淀：的沉淀：1 1无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀沉淀前往往参与沉淀前往往参与沉淀前往往参与沉淀前往往参与NaClN
31、aCl等盐离子，作用是中和核酸分子外表的等盐离子，作用是中和核酸分子外表的等盐离子，作用是中和核酸分子外表的等盐离子，作用是中和核酸分子外表的负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNADNA沉淀析出，无水乙沉淀析出，无水乙沉淀析出，无水乙沉淀析出，无水乙醇运用前冰冻，可以减少醇运用前冰冻，可以减少醇运用前冰冻，可以减少醇运用前冰冻，可以减少DNADNA沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程
32、释放热量对沉淀析出过程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNADNA的损伤。的损伤。的损伤。的损伤。2 2异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀 除了使除了使除了使除了使DNADNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNARNA分子分子分子分子二二 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与蛋白质与DNADNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的复的复合物，可以使蛋白量
33、变性。减少了酚多合物，可以使蛋白量变性。减少了酚多次抽提的步骤次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。三磁珠法：三磁珠法：磁珠在高盐低磁珠在高盐低pHpH值下吸附核酸，在低盐高值下吸附核酸，在低盐高pHpH值下与核酸分别，再经过挪动磁珠来值下与核酸分别，再经过挪动磁珠来获取获取DNADNA四微柱法四微柱法 ：利用利用DNADNA在高盐、低在高盐、低pHpH的特定溶液环境下可的特定溶液环境下可吸附在固相介质如硅胶膜上，洗涤去吸附在固相介质如硅胶膜上，洗涤去除杂质后，
34、再改动溶液环境使除杂质后，再改动溶液环境使DNADNA溶解到纯溶解到纯水或水或TETE中中三、三、DNA的浓缩的浓缩l l固固体体聚聚乙乙二二醇醇PEGPEG浓浓缩缩：用用透透析析袋袋 外敷外敷PEGPEG至适宜量至适宜量l l丁丁醇醇抽抽提提浓浓缩缩：DNADNA溶溶液液中中水水可可分分配配到到正正丁丁醇醇或或仲仲丁丁醇醇，但但DNADNA不不会会。因因此此反反复复几几次可显著减少次可显著减少DNADNA体积体积四、四、DNA回收回收 l l主要是从电泳中分别回收主要是从电泳中分别回收DNADNA片段片段l l回收原那么：尽量提高回收率回收原那么：尽量提高回收率l l 去除回收去除回收DNA
35、DNA样品中的污染物样品中的污染物l lDNADNA降解的缘由降解的缘由降解的缘由降解的缘由l l 样本不够新颖，采集资料过陈旧样本不够新颖，采集资料过陈旧样本不够新颖，采集资料过陈旧样本不够新颖，采集资料过陈旧l l 样本本身存在大量样本本身存在大量样本本身存在大量样本本身存在大量DNADNA酶酶酶酶l l提取提取提取提取DNADNA的生物活性差的缘由？的生物活性差的缘由？的生物活性差的缘由？的生物活性差的缘由？l l 提取的基因组提取的基因组提取的基因组提取的基因组DNADNA盐浓度过高盐浓度过高盐浓度过高盐浓度过高l l 基因组基因组基因组基因组DNADNA中乙醇未去除净中乙醇未去除净中
36、乙醇未去除净中乙醇未去除净l l 基因组基因组基因组基因组DNADNA中能够存在其他抑制要素中能够存在其他抑制要素中能够存在其他抑制要素中能够存在其他抑制要素l l提取基因组提取基因组提取基因组提取基因组DNADNA，有时参与蔗糖的缘由，有时参与蔗糖的缘由，有时参与蔗糖的缘由，有时参与蔗糖的缘由l l 参与多糖，维护参与多糖，维护参与多糖，维护参与多糖，维护DNADNA长度长度长度长度影响影响DNA质量的要素质量的要素四、四、RNA的分别与纯化的分别与纯化一、样本来源一、样本来源l l实际上一切有核真核细胞、细菌、病毒都实际上一切有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取可以提取RNAl l样本选择取
37、决于实验目的样本选择取决于实验目的l l全血是基因组提取全血是基因组提取RNA最常见的样本最常见的样本每个每个每个每个细细胞的胞的胞的胞的RNARNA量量量量约为约为10-5 g10-5 g 80%-85% rRNA 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 1%-5% mRNA 其他其他其他其他RNARNA：hnRNAhnRNA、 snRNA snRNA 、snoRNAsnoRNA组织材料组织材料组织材料组织材料起始样品量起始样品量起始样品量起始样品量Total RNATotal RNA提取量提取量提取量提取量bloodblood1m
38、l1ml15201520ggleukocytesleukocytes1 1101010107 7 7 7个个个个约约约约100 100 ggLiver tissueLiver tissue1g1g约约约约5000 5000 ggCulture cellsCulture cells1 1101010107 7 7 7个个个个约约约约100100ggRenal tissueRenal tissue1g1g约约约约30003000ggSkeleton tissueSkeleton tissue1g1g约约约约15001500ggCerebral tissueCerebral tissue1g1g约约
39、约约15001500gg二、二、 RNA提取的独特性提取的独特性关于关于RNase酶l l临临床床标标本本及及实实验验室室环环境境中中, ,存存在在大大量量对对RNARNA具具有有剧剧烈烈降降解解作作用用的的RNaseRNase，而而RNaseRNase较较耐耐高温高温, ,不易失活不易失活l l如如何何防防止止RNaseRNase对对标标本本的的污污染染及及防防止止RNaseRNase对对提提取取的的RNARNA的的降降解解, ,是是保保证证RNARNA胜胜利利提提取取的的关键之所在关键之所在RNase酶酶l lRNARNARNARNA易易易易被被被被RNaseRNaseRNaseRNase
40、水水水水解解解解，RNaseRNaseRNaseRNase除除除除胞胞胞胞内内内内还还还还广广广广泛泛泛泛存存存存在在在在于于于于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中l lRNaseRNaseRNaseRNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键具有水解核糖残基和磷酸二酯键l lRNaseRNaseRNaseRNase分分分分子子子子构构构构造造造造中中中中的的的的二二二二硫硫硫硫键键键键使使使使其其其其生生生生物物物物学学学学活活活活性性性性非
41、非非非常常常常稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，稳定，去除变性剂后，RNaseRNaseRNaseRNase的活性又可恢复的活性又可恢复的活性又可恢复的活性又可恢复l l去去去去除除除除RNaseRNaseRNaseRNase的的的的污污污污染染染染及及及及强强强强有有有有力力力力地地地地抑抑抑抑制制制制其其其其活活活活性性性性是是是是RNARNARNARNA制备胜利与否的关键制备胜利与否的关键制备胜利与否的关键制备胜利与否的关键l l必必必必需需需需在在在在总总总总RNARNARNARNA提提提提取取取取分分分分别别别别的的的的最最最最初初初初阶阶阶阶段段段段，尽尽
42、尽尽能能能能够够够够地地地地灭活胞内灭活胞内灭活胞内灭活胞内RNaseRNaseRNaseRNase的活性的活性的活性的活性1. 内源性内源性RNA酶酶intrinsic RNase2. 外源性外源性RNA酶酶(extrinsic RNase)主要来源：主要来源： 被污染的缓冲液被污染的缓冲液 细菌或微生物污染，高压不能去除细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶酶 自动移液安装自动移液安装3. 实验室采取防止实验室采取防止RNA酶污染的措施酶污染的措施设置专门设置专门RNA移液安装移液安装小份保管缓冲液小份保管缓冲液设置专门的设置专门的RNA电泳安装电泳安装预备溶液或缓冲液时，运用无预备溶液或
43、缓冲液时，运用无RNA酶的器酶的器皿、皿、 DEPC处置水等处置水等分别分别RNA过程中运用过程中运用RNA酶抑制剂酶抑制剂4. RNA酶的去除酶的去除l lDEPC焦碳酸二乙酯l l高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。l lOC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处置1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C处置1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液，且与一些缓冲液不相容，故在分别和纯化不相容，故在分别和纯化R
44、NA的过程中不运用的过程中不运用DEPC5. RNA提取所用器皿的处置提取所用器皿的处置l l经经高高高高压压灭灭菌菌菌菌的的的的一一一一次次次次性性性性运运运运用用用用的的的的塑塑塑塑料料料料制制制制品品品品如如如如试试管管管管, , , ,离离离离心心心心管管管管等等等等根根根根本上无本上无本上无本上无RNase,RNase,RNase,RNase,可以不可以不可以不可以不经预处经预处置直接用于制置直接用于制置直接用于制置直接用于制备备和和和和储储存存存存RNA RNA RNA RNA l l实实验验室室室室用用用用的的的的普普普普通通通通玻玻玻玻璃璃璃璃器器器器皿皿皿皿经经常常常常有有有
45、有RNaseRNaseRNaseRNase污污染染染染, , , ,运运运运用用用用前前前前必必必必需需需需于于于于180180180180干干干干烤烤烤烤8 8 8 8小小小小时时以以以以上上上上, , , ,或或或或用用用用0.1%0.1%0.1%0.1%焦焦焦焦碳碳碳碳酸酸酸酸二二二二乙乙乙乙酯酯(DEPC)(DEPC)(DEPC)(DEPC)的的的的水水水水溶液浸泡用于制溶液浸泡用于制溶液浸泡用于制溶液浸泡用于制备备RNARNARNARNA的的的的烧烧杯杯杯杯, , , ,试试管和其它用品管和其它用品管和其它用品管和其它用品l lDEPCDEPCDEPCDEPC是是是是RNaseRNa
46、seRNaseRNase的的的的剧剧烈烈烈烈抑抑抑抑制制制制剂剂。灌灌灌灌满满DEPCDEPCDEPCDEPC的的的的器器器器皿皿皿皿于于于于37373737下下下下放放放放置置置置2 2 2 2小小小小时时，然然然然后后后后用用用用灭灭菌菌菌菌水水水水淋淋淋淋洗洗洗洗数数数数次次次次，并并并并于于于于100100100100干干干干烤烤烤烤15151515分分分分钟钟，最最最最后后后后高高高高压压蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽下下下下15151515分分分分钟钟。上上上上述述述述处处置置置置可可可可除除除除去去去去器器器器皿皿皿皿上上上上痕痕痕痕量量量量的的的的DEPC,DEPC,DEPC,DEPC,以以
47、以以防防防防DEPCDEPCDEPCDEPC经经过过羧羧甲甲甲甲基基基基化化化化作作作作用用用用对对RNARNARNARNA的的的的嘌嘌呤呤呤呤碱碱碱碱基基基基进进展展展展修修修修饰饰6. RNA提取所用溶液的预备提取所用溶液的预备 l l对对于于于于RNARNARNARNA提提提提取取取取所所所所需需需需溶溶溶溶液液液液的的的的配配配配制制制制, , , ,必必必必需需需需用用用用高高高高压压灭灭菌菌菌菌的的的的水水水水和和和和RNARNARNARNA研研研研讨讨公公公公用用用用的的的的化化化化学学学学试试剂剂配配配配制制制制溶溶溶溶液液液液, , , ,用用用用干干干干烤烤烤烤过过的的的的
48、药药匙匙匙匙称称称称取取取取试试剂剂, , , ,将将将将溶溶溶溶液液液液装装装装入入入入无无无无RNaseRNaseRNaseRNase的的的的玻玻玻玻璃璃璃璃器器器器皿皿皿皿。能能能能够够的的的的话话, , , ,溶溶溶溶液液液液均均均均运运运运用用用用0.1%DEPC0.1%DEPC0.1%DEPC0.1%DEPC于于于于37373737至至至至少少少少处处置置置置12121212小小小小时时, , , ,然然然然后后后后于于于于100100100100加加加加热热15151515分分分分钟钟或或或或高高高高压压蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽灭灭菌菌菌菌15151515分分分分钟钟l l须须留留留留意
49、意意意的的的的是是是是,DEPC,DEPC,DEPC,DEPC可可可可与与与与胺胺胺胺类类迅迅迅迅速速速速发发生生生生化化化化学学学学反反反反响响响响, , , ,因因因因此此此此不不不不能能能能用用用用来来来来处处置置置置含含含含有有有有TrisTrisTrisTris一一一一类类的的的的缓缓冲冲冲冲液液液液, , , ,因因因因此此此此可可可可存存存存几几几几瓶瓶瓶瓶新新新新的的的的, , , ,未未未未开开开开封封封封的的的的TrisTrisTrisTris试试剂剂以以以以制制制制备备无无无无RNaseRNaseRNaseRNase的的的的溶溶溶溶液液液液7. RNA提取中提取中RNas
50、e 污染的控制污染的控制l l实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。 l l战略是：l l在预备用于RNA纯化的实验资料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套l l在RNA提取实验中，应勤换手套三、用于提取三、用于提取RNA的血样的处置的血样的处置1.1.取新取新取新取新颖颖抗凝血抗凝血抗凝血抗凝血2 23ml3ml入入入入15ml15ml无菌塑料管，无菌塑料管，无菌塑料管，无菌塑料管，600g600g离心离心离心离心5 5分分分分钟钟，弃上清。弃上清。弃上清。弃上清。 2.2.参与参与参与参与6 6倍倍倍倍细细胞体胞体胞体胞体积积的的的的红细红细胞裂解液
51、胞裂解液胞裂解液胞裂解液约约12ml12ml，悄然吹打混，悄然吹打混，悄然吹打混，悄然吹打混匀，本步匀，本步匀，本步匀，本步骤骤在室温或在室温或在室温或在室温或4 4度操作均可。裂解度操作均可。裂解度操作均可。裂解度操作均可。裂解时间时间至至至至4-54-5分分分分钟钟，并，并，并，并且裂解且裂解且裂解且裂解过过程中宜适当偶程中宜适当偶程中宜适当偶程中宜适当偶尔摇动尔摇动以促以促以促以促进红细进红细胞裂解。胞裂解。胞裂解。胞裂解。3.3.600g600g离心离心离心离心5 5分分分分钟钟，弃，弃，弃，弃红红色上清。色上清。色上清。色上清。4 4离心效果更佳。离心效果更佳。离心效果更佳。离心效果
52、更佳。4.4.普通情况下，普通情况下，普通情况下，普通情况下， 裂解裂解裂解裂解1 1次次次次红细红细胞胞胞胞应该应该裂解的差不多，假裂解的差不多，假裂解的差不多，假裂解的差不多，假设设有有有有较较多多多多红细红细胞没有裂解的胞没有裂解的胞没有裂解的胞没有裂解的话话，可以再加点，可以再加点，可以再加点，可以再加点红细红细胞裂解液胞裂解液胞裂解液胞裂解液约约5ml5ml裂裂裂裂解解解解1 1次。步次。步次。步次。步骤骤同同同同3 3。5.5.向得到的向得到的向得到的向得到的细细胞胞胞胞团团中加中加中加中加Trizol 1.0mlTrizol 1.0ml，弹弹匀，将匀，将匀，将匀，将细细胞胞胞胞团
53、团打散，打散，打散，打散，转转入入入入1.5ml1.5ml无菌塑料管，封好盖。无菌塑料管，封好盖。无菌塑料管，封好盖。无菌塑料管，封好盖。标标上号，上号，上号，上号，缠缠上封口膜，上封口膜，上封口膜，上封口膜，20 20 或或或或70 70 保管。保管。保管。保管。四、四、RNA提取的常用方法提取的常用方法 外表活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法胍盐提取结合氯仿-酚抽提法胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等RNA提取实验前的预备提取实验前的预备【运用器具】【运用器具】【运用器具】【运用器具】 尽量运用一次性塑料器皿，假尽量运用一次性塑料器皿，假尽量运用一次性塑料器皿，假尽量运用一次性塑
54、料器皿，假设设运用玻璃器皿，那么运用玻璃器皿，那么运用玻璃器皿，那么运用玻璃器皿，那么运用运用运用运用0.1%DEPC0.1%DEPC0.1%DEPC0.1%DEPC水溶液在水溶液在水溶液在水溶液在37373737处处置置置置12h12h12h12h，后，后，后，后120120120120高高高高压压30min30min30min30min，去除残留，去除残留，去除残留，去除残留DEPCDEPCDEPCDEPC【试剂试剂配制】配制】配制】配制】 无菌水无菌水无菌水无菌水须须用用用用0.1%DEPC0.1%DEPC0.1%DEPC0.1%DEPC处处置后高温高置后高温高置后高温高置后高温高压灭压
55、灭菌菌菌菌 RNA RNA RNA RNA实验试剂应实验试剂应RNARNARNARNA提取公用，防止其他提取公用，防止其他提取公用，防止其他提取公用，防止其他试剂试剂交叉交叉交叉交叉污污染染染染【其他】【其他】【其他】【其他】 实验过实验过程中运用一次性手套，并程中运用一次性手套，并程中运用一次性手套，并程中运用一次性手套，并经经常改常改常改常改换换；在；在；在；在RNARNARNARNA公用公用公用公用区操作，操作区操作，操作区操作，操作区操作，操作过过程中防止交程中防止交程中防止交程中防止交谈谈 外表活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法：1.1.1.1.每每每每mgmgmgmg组织组织中参与中
56、参与中参与中参与1mlTrizol1mlTrizol1mlTrizol1mlTrizol试剂试剂，高速破碎，高速破碎，高速破碎，高速破碎组织组织运用运用运用运用高速高速高速高速组织捣组织捣碎器碎器碎器碎器2.2.2.2.参与参与参与参与氯氯仿仿仿仿0.2ml,0.2ml,0.2ml,0.2ml,悄然悄然悄然悄然颠颠倒混匀，室温静置分倒混匀，室温静置分倒混匀，室温静置分倒混匀，室温静置分层层。3.3.3.3.高速离心高速离心高速离心高速离心12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm，4-8 C 4-8 C 4-8 C 4-8 C ，10101010分分分分钟钟4.4.4.4
57、.吸上清液至新离心管中，吸上清液至新离心管中，吸上清液至新离心管中，吸上清液至新离心管中，约约600ul600ul600ul600ul5.5.5.5.参与参与参与参与500ul500ul500ul500ul异丙醇，混匀，室温静置异丙醇，混匀，室温静置异丙醇，混匀，室温静置异丙醇，混匀，室温静置10101010分分分分钟钟6.6.6.6.高速离心高速离心高速离心高速离心12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm，4-8 C 4-8 C 4-8 C 4-8 C ，10101010分分分分钟钟7.7.7.7.弃上清液，沉淀弃上清液，沉淀弃上清液，沉淀弃上清液，沉淀为为RNARN
58、ARNARNA8.8.8.8.参与参与参与参与1mlDEPC1mlDEPC1mlDEPC1mlDEPC处处置的置的置的置的75%75%75%75%乙醇，混匀，乙醇，混匀，乙醇，混匀，乙醇，混匀，7500rpm7500rpm7500rpm7500rpm离心，离心，离心，离心， 4- 4- 4- 4-8C8C8C8C，5 5 5 5分分分分钟钟9.9.9.9.参与参与参与参与DEPCDEPCDEPCDEPC处处置水置水置水置水30ul30ul30ul30ul，混匀，混匀，混匀，混匀，55-60 C55-60 C55-60 C55-60 C水浴水浴水浴水浴10.10.10.10.3ul3ul3ul3
59、ul参与参与参与参与297ulDEPC297ulDEPC297ulDEPC297ulDEPC水，水，水，水，测测定定定定浓浓度和度和度和度和纯纯度度度度异硫氰酸胍GuSCN结合氯仿-酚提取法 试剂的作用：试剂的作用：l l参参与与-疏疏基基乙乙醇醇、二二硫硫苏糖糖醇醇DTTDTT等等复复原原剂可可以以复复原原RNaseRNase中中的的二二硫硫键，有有利利于于RNaseRNase的的变性、水解与性、水解与灭活活四、四、mRNA的分别纯化的分别纯化l l除除除除血血血血红红蛋蛋蛋蛋白白白白及及及及组组蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的mRNAmRNAmRNAmRNA外外外外，绝绝大大大大多多多多数数数数m
60、RNAmRNAmRNAmRNA在在在在其其其其3333末端末端末端末端带带有有有有长长短不同的短不同的短不同的短不同的polypolypolypolyA A A A尾巴尾巴尾巴尾巴l l利利利利用用用用碱碱碱碱基基基基配配配配对对原原原原那那那那么么么么，经经过过oligooligooligooligodTdTdTdT- - - -纤纤维维素素素素或或或或polypolypolypolyU U U U- - - -琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的亲亲和和和和层层析析析析，可可可可以以以以很很很很容容容容易易易易地地地地从从从从总总RNARNARNARNA制品中分制品中分制品中分制品中分别纯别纯化化化化mRNAmRNAmRNAmRNA
