细胞分离与胞内产物的溶解生物分离工程

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1、第十五章第十五章细细 胞胞 破破 碎碎1生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程本章内容2常见的细胞壁结构细胞破碎技术包涵体的纯化方法本章的主要内容3概述概述不同类型的细胞分泌目标产物的类型：不同类型的细胞分泌目标产物的类型：l动物细胞多分泌到细胞外培养液动物细胞多分泌到细胞外培养液l植物细胞多为胞内产物植物细胞多为胞内产物l微生物（细菌微生物（细菌/酵母酵母/真菌）胞内、胞外真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。破碎。4概述概述(大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发

2、酵液中。及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤尤其其是是由由基基因因工工程程菌菌产产生生的的大大多多数数蛋蛋白白质质是是在细胞内沉积。在细胞内沉积。l脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。5概概 述述细胞破碎细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌

3、型生化物质（产品）的基础。型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。解各种微生物细胞壁的组成和结构。615.1 15.1 细胞壁结构对破碎的影响细胞壁结构对破碎的影响Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来

4、自于细胞壁。胞壁。Z不不同同细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成不不完完全全相相同同，故故细细胞胞壁壁的的机机械械强强度度不不同同，细细胞胞破破碎碎的的难难易易程程度度也也就就不不同。同。7细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构Z几几乎乎所所有有细细菌菌的的细细胞胞壁壁都都是是由由肽肽聚聚糖糖组组成成，它它是是难难溶溶性性的聚糖链；的聚糖链；Z相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁壁的的三三维维网状结构，网状结构，包围在细胞周围；包围在细胞周围；Z使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状状和和强强度。度。8细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构u破碎细菌的主要阻力是来自于破

5、碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。的肽键的数量和其交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。不同。 u革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠肠杆杆菌菌，通通过过这这种种细细胞生产了很多细胞重组的产物。胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病- -干扰素

6、干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等9u最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的形状，形状，u上面的是一层糖蛋白，上面的是一层糖蛋白，u最最外外层层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,61,6- -磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接成成网网状状。在在该该层层的的内内部部，有有甘甘露露聚聚糖糖- -酶酶的复合物。的复合物。u破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的的紧紧密密程程度和它的厚度。度和它的厚度。10真菌的细胞壁真菌的细胞壁l真菌的细

7、胞壁较厚，主要由多糖组成，其次真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。还含有较少量的蛋白质和脂类。l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。糖构成，少数含纤维素。l与与酵酵母母和和细细菌菌的的细细胞胞壁壁一一样样，真真菌菌细细胞胞壁壁的的强强度度和和聚聚合合物物的的网网状状结结构构有有关关，不不仅仅如如此此，它它还还含含有有几几丁丁质质或或纤纤维维素素的的纤纤维维状状结结构构，所所以强度有所提高。以强度有所提高。11l红红面面包包霉霉菌

8、菌细细胞胞壁壁具具有有同同心心圆圆层层状结构主要存在三种聚合物状结构主要存在三种聚合物l最最外外层层(a)(a)是是- -和和- -葡葡聚聚糖糖的的混合物，混合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图12微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100

9、-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生微生物物革兰

10、氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-

11、8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构13植物细胞壁的结构植物细胞壁的结构l对对于于已已生生长长结结束束的的植植物物细细胞胞壁壁可可分分为为初初生生壁壁和和次次生生壁两部分。壁两部分。l初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 13m3m），富有弹性。），富有弹性。l由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D

12、-D-葡聚糖，许葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。多这样的长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。自于微纤丝。14植物次生细胞壁植物次生细胞壁 某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间形形成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁一一般般较较厚厚(4(4m m以上以上) )，常有三层组成。，常有三层组成。n在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁增增加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密密和和有

13、有规规则则，而且存在木质素的沉积。而且存在木质素的沉积。 因因此此次次生生壁壁的的形形成成提提高高了了细细胞胞壁壁的的坚坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。15研研 磨磨15.2 15.2 细胞破碎技术细胞破碎技术16机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏

14、，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理17一机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicat

15、ionultrasonication）18采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1.高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细撞及压力骤降，造成细胞破碎。胞破碎。1920高压匀浆器

16、的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多高压匀浆器的种类较多：pWABWAB公司的公司的AVP AVP GaulinGaulin 31MR 31MR型型pBran and Bran and luebbeluebbe 公司公司SHL40SHL40型型p意大利意大利NiroNiro SoaviSoavi高压匀浆机高压匀浆机21高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约- -/10MPa/10MPa为了为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在温度，使出口温度调节在2020左右。左右

17、。u可可以以采采用用单单次次通通过过匀匀浆浆器器或或多多次次循循环环通通过过等等方方式。式。u在在工工业业规规模模的的细细胞胞破破碎碎中中，对对于于酵酵母母等等难难破破碎碎的的及及浓浓度度高高或或处处于于生生长长静静止止期期的的细细胞胞，常常采采用用多次循环的操作方法。多次循环的操作方法。22高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞

18、的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）浆阀）23影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=ln1/(1-R)=KNPKNP (15-1)(15-1) 式中式中 R R 破碎率，为破碎率，为N N次循环后，蛋次循环后，蛋白质的释放量白质的释放量RnRn与最大释放量与最大释放量RmRm之比；之比； K K 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； P P 操作

19、压力，操作压力，MPaMPa； 与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。24l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p p超生一定值时，超生一定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同

20、而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素25高压匀浆法高压匀浆法-X-X-挤压器挤压器l改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至- -2525至至-30-30形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa500MPa以上的以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。l细胞

21、破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。在冰中的细胞变形所引起的。l主要用于实验室中。主要用于实验室中。l优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高粉碎程度低以及活性的保留率高l对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。262）珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于剂（直径小于1mm1mm）一起快速）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、

22、珠子搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内撞，使细胞破碎，释放出内含物。含物。u在工业规模的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机27高速珠磨机工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起l在出口处，旋转园盘和出口平在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻

23、板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。离小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。却细胞悬浮液和玻离小珠。28Netzsch LM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口l园盘以两种位置交错地安装在轴上，l一种处于径向，一种与轴倾斜，l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。l由于交错的运动，提高了破碎效率。29珠磨机破碎作用方程u破碎作用是

24、相对于时间的一级反应速度过程，破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：符合下列公式： ln1/(1-ln1/(1-R)=Kt 15-2R)=Kt 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一级反应速度常数；一级反应速度常数；t t一一 时间。时间。uK K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。装量和珠体直径，以及温度等相关。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%80%以下：降低能耗、减少大分以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不子目的产

25、物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。易分离而给后续操作带来的困难。303）超声波破碎l超声波破碎法（超声波破碎法（UltrasonicationUltrasonication) )利用超声波利用超声波振荡器发射的振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞的超声波探头处理细胞悬浮液。悬浮液。l超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频

26、、声能有关。声波的声频、声能有关。31超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机(一般认为在超声波作用下液体发生空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitationcavitation),),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进

27、行。外部冷却的容器中进行。32超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但但在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常

28、用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用。33技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中

29、 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同机械破碎方法的比较34非机械破碎方法非机械破碎方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme enzyme lysislysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢剂破碎法（去垢剂破碎法（detergentsdetergents）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and th

30、awing）35二二 非机械法非机械法非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法n渗透压冲击n冻结和融化n干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。二36 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等37外加酶法n酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时

31、，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。须根据细胞的结构和化学组成来选择。l溶菌酶（溶菌酶（lysozymelysozyme) )能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂效果，必须与螯合剂EDTAEDTA一起使用。一起使用。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖放线菌的细胞

32、壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，为主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。半纤维素酶裂解。38外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作对酵母细胞采

33、用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质用蛋白质- -甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。39酶解法的特点 优点：u发生酶解的条件温和u能选择性地释放产物u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：缺点：溶酶价格高，溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) )产物抑制的存在。产物抑制的存在。 40酶解-自溶作用 l 自溶作

34、用是酶解的另一种方法，自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。生其它的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细缺点是：易引起所需蛋白

35、质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。41某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。2 化学渗透法化学渗透法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 42n酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。n

36、碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法）酸、碱处理法43细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。（2 2）表面活性

37、剂）表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解44能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3 3）有机溶剂）有机溶剂（4 4）EDTAEDTA螯合剂螯合剂处理处理G-G-细菌，对细胞壁

38、外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或或MgMg2+2+结合脂多糖结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。45u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的加入常

39、会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度化学渗透法特点：化学渗透法特点：缺点缺点l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。分离和进一步提取。优点优点463 3 物理法物理法u渗透压冲击法渗透压冲击法u冻结冻结-融化法融化法u干燥法干燥法471）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种

40、破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑

41、制剂（如抗生素等），使或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。细胞壁有缺陷，强度减弱。48 2）冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在室温中），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反

42、复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 49使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3 3）干燥法）干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥

43、喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥5051选择破碎方法的依据：选择破碎方法的依据：u细胞处理量；细胞处理量； u细胞壁强度和结构细胞壁强度和结构( (高聚物交联程度、种高聚物交联程度、种类和壁厚度类和壁厚度) )；u目标产物对破碎条件的敏感性；目标产物对破碎条件的敏感性； u破碎程度；破碎程度；u目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放52选择性释放目标产物的一般原则仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围l当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞

44、质内时，则需采用强烈的机当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法械破碎法l当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液调节溶液PHPH值，离子强度或添加与目标产物具有亲值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。物容易溶解释放。(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。53 讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一一. 化学法化学法 20%(W/V)

45、大肠杆菌悬浮液大肠杆菌悬浮液 + B.A 37搅拌搅拌 高高速离心速离心 测上清液酶活。测上清液酶活。1.处理时间处理时间 R% 2.5h2. 丁酯用量丁酯用量条件：条件：37 ，搅拌搅拌3小时小时适宜的适宜的B.A加量为加量为12% ，释放率释放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活54二二. 化学法化学法冻融法结合冻融法结合 加加B.A(12%,37B.A(12%,37搅拌搅拌3h3h） 菌悬液菌悬液 冻融冻融( (冻结冻结14h 14h 融化融化) ) 释放率释放率70%70%；比活；比活2.69 u/mg2.69 u/mg 三三. 化学化学超声波振荡法结合超声波振荡法结合

46、 先丁酯处理，再超声波（先丁酯处理，再超声波（9090秒），秒），释放率释放率72%72% 小型设备，不能工业大规模生产。小型设备，不能工业大规模生产。四四. 高压匀浆法高压匀浆法 20%(W/V)20%(W/V)菌悬液，菌悬液，P=P=50MPa50MPa，N=3N=3。释放率释放率R=38.4%R=38.4%， 原因原因: :细胞破碎后细胞破碎后, ,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。仍有较多酶吸附在细胞碎片上。五五. 高压匀浆高压匀浆化学法结合化学法结合 先高压匀浆，再加先高压匀浆，再加10%10%丁酯，丁酯，3737搅拌搅拌3h3h，高速离心高速离心(3(3万万rpm)rpm)，释放率释放率

47、：R=60%R=60%六六. 珠磨珠磨 直径直径0.4mm0.4mm玻璃珠。玻璃珠。释放率释放率：R=95%R=95%55破碎率的测定破碎率的测定细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水水相相，使导电率上升。使导电率上升。 1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫采用革兰氏染色

48、法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与或活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破碎率。56破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向1)1)多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然

49、后高压匀浆，95MPa95MPa压压力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有浆法，同样条件下破碎率只有32%32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合有机溶剂与冻融法、干燥法结合57破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向- -与上游过程相结合与上游过程相结合v在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pHpH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。膜的结构与组成有一定的影响

50、。v在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂制剂( (如青霉素如青霉素) )，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；细胞壁有缺陷，利于破碎；v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；v用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放

51、出内含物。噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。58破碎技术研究方向破碎技术研究方向-与下游工程相结合与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶59（ inclusion bodies IBs)15.4 15.4 基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化纯化l胞内

52、周质表达：离心胞内周质表达：离心, ,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心, ,收集上清液收集上清液纯化。纯化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心, ,收集收集沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。60外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区- -人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体

53、形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体61Z包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。物活性。Z包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集

54、在细胞内，形成不溶性的包涵体。代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。Z高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。蛋白质自身不稳定。包含体的构成

55、62收集菌体细胞细胞破碎包涵体包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。出了新的课题。欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活标蛋白恢复应有的天然活性。性。63包涵体获得几种常见的工艺路线(一)机械破碎机械破碎( (高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨）离心提取包含体离心提取包含体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性6

56、4特点特点: :是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。性。优点：优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。缺点缺点: :要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时

57、间较长。片，加工时间较长。路线路线1 的特点的特点65包涵体获得几种常见的工艺路线（二）机械破碎膜分离获得包涵体加变性剂溶解包含体除变性剂复性除变性剂复性66 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。膜除去可溶性蛋白质。u优点是封闭式操作，不污染环境也不受优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。环境污染，能量消耗也比离心法少。u缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。常导致可溶性蛋白质的滞留。路线

58、路线2 的特点的特点67包涵体获得几种常见的工艺路线（三）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片除变性剂复性68l用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。验室操作。l缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。杂在产物中间，给后续分离带来困难。 路线三：路线三：691）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈

59、颗粒状，致密。l洗涤的重要性：洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困难。l洗涤剂：洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达以溶解杂质，不溶解

60、包涵体中表达产物为原则。产物为原则。70 2）目标蛋白的变性溶解）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂：常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子间相互作用；作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如表面活性剂如1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。

61、 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和浓度。浓度。71原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。过程称复性。复性方法：复性方法：l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。加入

62、大量水或缓冲液。l膜分离法除变性剂膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。l层析法：凝胶层析，层析法：凝胶层析，高效疏水层析高效疏水层析 3） 目标蛋白的复性目标蛋白的复性72 蛋白质复性影响因素：蛋白质复性影响因素：u变性剂浓度变性剂浓度u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度；upH和离子强度；和离子强度； u氧化还原条件。氧化还原条件。 还原剂：还原剂： 二硫苏糖醇、二硫苏糖醇、-巯基乙醇、还原巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；型谷胱甘肽；氧化剂：氧化剂： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。碱性下通空气。 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐酸胍浓度盐

63、酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L73肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coliE.coli中的高密度发酵中的高密度发酵过程中以两种形式表达：过程中以两种形式表达： 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的30%30%） 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%70%）。）。 悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换

64、层析阳离子交换层析溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析湿菌体湿菌体发酵液发酵液干净菌体干净菌体上清液上清液包涵体包涵体纯品纯品活性检测活性检测破壁液破壁液离心离心离心液离心液洗涤洗涤举例：举例：TRAIL的分离纯化的分离纯化741. 1. 包涵体的洗涤包涵体的洗涤 粗制包涵体用粗制包涵体用 50mM50mM磷酸盐缓冲液，含磷酸盐缓冲液，含150mM 150mM NaClNaCl pH=7.4 (1:3 pH=7.4 (1:3 w/vw/v) ) 洗涤洗涤2-32-3次；次； 用含有用含有1M 1M NaClNaCl的磷酸缓冲液洗涤的磷酸缓冲液洗涤1 1次次 (1:3 (1:3 w/vw/v) )，

65、将粘附其表面的大部，将粘附其表面的大部 分蛋白及水溶性杂质除去；分蛋白及水溶性杂质除去； 用用6M6M尿素及尿素及0.5%TritonX-100 0.5%TritonX-100 联合洗涤联合洗涤1 1次次 (1:3 (1:3 w/vw/v) )，去除另一些，去除另一些 杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%80%左右）；左右）； 用用SDS-PAGESDS-PAGE电泳检测纯度。电泳检测纯度。 2. 2. 包涵体的变性溶解包涵体的变性溶解 洗涤后包涵体用含有洗涤后包涵体用含有30mM DTT30mM DTT及及5mol/l5mol/l盐酸胍的盐酸胍的TrisTr

66、is 缓冲液缓冲液 pH =8.0 pH =8.0 (1:5 (1:5 w/vw/v) )变性溶解变性溶解 室温搅拌室温搅拌2h2h，95%95%以上的包涵体可被溶解；以上的包涵体可被溶解； 离心，离心，13000rpm13000rpm，20min 20min 弃沉淀得到溶解液。弃沉淀得到溶解液。753. 3. 包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）l以含以含DTTDTT和和ZnSO4ZnSO4的的Tris-HClTris-HCl为复性缓冲液，再添加为复性缓冲液，再添加0.4M L-0.4M L-ArgArg，0.5M0.5M尿素，尿素，0.5M 0.5M NaC

67、lNaCl作为蛋白聚集抑制剂，作为蛋白聚集抑制剂，l变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为90min90min，每次流加浓度为，每次流加浓度为150mg/L150mg/L，变性液流加次数可高达，变性液流加次数可高达6 6次，次，最终浓度可达到最终浓度可达到1mg/ml1mg/ml，44缓慢搅拌一段时间，缓慢搅拌一段时间，l对对50mM 50mM Tris-HClTris-HCl，300mM 300mM NaClNaCl，0.1M0

68、.1M尿素及尿素及0.2mM ZnSO4 0.2mM ZnSO4 混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，l超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。76 5. 复性后纯化复性后纯化 复性浓缩后蛋白复性浓缩后蛋白 金属亲和层析金属亲和层析 吸附吸附 洗涤：洗涤： 40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白 洗脱：洗脱： 100mmol/L咪唑咪唑 目标蛋白目标蛋白 纯度达纯度达95%以上（由以上（由SDS-PAGE和和RP-HPLC鉴定）鉴

69、定） 收率收率75%77包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）78 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、再添加溶菌酶、EDTAEDTA和促进剂以除去脂蛋白和和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为行变性溶解，溶解剂为6mol/L6mol/L盐酸胍。溶解的盐酸胍。溶解的同时通

70、入空气氧化以打断错误连接的双硫键。同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。用离心除去。包含体产物分离工艺包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）（牛生长激素分离提取）791.1.常用的细胞破碎方法有哪些常用的细胞破碎方法有哪些2.2.在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？因素？3.3.基因工程包含体的纯化方法。基因工程包含体的纯化方法。80