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1、培养基的灭菌培养基的灭菌1灭菌的原理及方法灭菌的原理及方法培养基和发酵设备的灭菌工艺培养基和发酵设备的灭菌工艺 2灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。艺过程。 消毒：消除病原微生物的措施。消毒：消除病原微生物的措施。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。3生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产生产菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力。能力。杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应杂菌的生长速度有时比生产菌生长得快，结果使反应器
2、中以杂菌为主。器中以杂菌为主。杂菌会污染最终产品。杂菌会污染最终产品。杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。杂菌所产生的物质，使提取产物时发生困难。杂菌降解所需要的产物。杂菌降解所需要的产物。发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。发酵如污染了噬菌体，可使生产菌株发生溶菌现象。如有杂菌，可引起以下的后果：如有杂菌，可引起以下的后果：4第一节第一节灭菌的原理及方法灭菌的原理及方法一一.几种常见的灭菌方几种常见的灭菌方法法 1.化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性、酶失活。蛋白质变性、酶失活。使用范围：使用范围：
3、器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌不能用于培养基灭菌。常用的灭菌剂常用的灭菌剂:5常用的灭菌剂常用的灭菌剂化学物质名称化学物质名称 有效浓度有效浓度化学物质名称化学物质名称 有效浓度有效浓度新洁尔灭新洁尔灭(苯扎溴铵苯扎溴铵)0.25%甲醛甲醛37%杜灭芬杜灭芬0.25%戊二醛戊二醛2%高锰酸钾高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚苯酚0.1-0.15%漂白粉漂白粉5%过氧乙酸过氧乙酸0.02%-0.2%酒精酒精75%焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1%煤酚皂（来苏煤酚皂（来苏尔）尔）1%-5%62.辐射灭菌辐射灭菌原理：利用高能
4、量的电磁辐射与菌体核酸原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。的光化学反应造成菌体死亡。常用：紫外线、常用：紫外线、X射线和射线和射线。射线。使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。73干热灭菌法干热灭菌法原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：灼烧和电热箱加热，常用方法：灼烧和电热箱加热，140-1801-2小时。小时。使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌84湿热灭菌法湿热灭菌法原理：蒸汽冷凝
5、放出大量潜热，具有穿透力，原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。常用方法：常用方法：水煮常压灭菌：水煮常压灭菌：100饱和蒸汽灭菌：一般饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟分钟使用范围：培养基和发酵设备灭菌使用范围：培养基和发酵设备灭菌95过滤除菌法过滤除菌法 原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。方法方法:0.010.45 m孔径滤膜。孔径滤膜。使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。热化合物溶液除菌。 106火焰灭菌法火焰灭菌法原理
6、：利用火焰直接杀死微生物。原理：利用火焰直接杀死微生物。使用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口使用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口111.微生物热死动力学（对数残存定律）微生物热死动力学（对数残存定律） - dN / dt =K NN：菌体个数（个）菌体个数（个）t:灭菌时间（灭菌时间（S）k：反应速度常数（反应速度常数（S-1）dN / dt:菌体受热死亡速率菌体受热死亡速率12LnN/N0=- K t N= N0e- K t 以菌体的残留数以菌体的残留数LnN/N0的对数与时间的对数与时间t作图，得出一条直线，其斜率为作图，得出一条直线，其斜率为-K 。132.反应速率常数反应速率常数K如何通过
7、实验根据对数残存定律确定某一温度如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度,某一微生物的某一微生物的K ？ 1).K 与菌种的特性有关与菌种的特性有关相同温度下，微生物越耐热，相同温度下，微生物越耐热，k值越小。值越小。相同温度下，微生物越不耐热，相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。值越大。14n2).K 与灭菌温度有与灭菌温度有关关nK=Ae E/RTn（阿累尼乌斯方程）阿累尼乌斯方程）nLnK=LnA- E/RTnA：比例常数比例常数nR：气体常数气体常数(J/molK)nT：绝对温度绝对温度(K)n E：杀死细菌所需的活杀死细菌所需的活化能（化能（J/mol）12111811511010
8、515第二节第二节培养基和发酵设备的灭菌工艺培养基和发酵设备的灭菌工艺 一培养基灭菌时间的选择一培养基灭菌时间的选择 t=1/k *Ln(N0/N) 其中其中K：一般耐热的细菌芽孢的一般耐热的细菌芽孢的K值值N0：细菌及芽孢数之和细菌及芽孢数之和N：10-316二二. 培养基灭菌温度的选择培养基灭菌温度的选择选择即能达到灭菌要求，选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度。又保证营养成分不被破坏的温度。17三三影响灭菌效果的因素影响灭菌效果的因素 微生物种类：不同的微生物微生物种类：不同的微生物k值不同。值不同。初始菌量：在保持初始菌量：在保持N值不变的前提下，值不变的前提下，t 与初
9、始与初始菌量菌量N0的对数成正比。的对数成正比。培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。性。传热与混合状况：影响受热均匀度。传热与混合状况：影响受热均匀度。培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。pH：酸性酸性pH下可加快微生物热死速率下可加快微生物热死速率。 18四四.培养基和发酵设备的灭菌方法培养基和发酵设备的灭菌方法（一）实验室种子培养基灭菌方法（一）实验室种子培养基灭菌方法 手提式灭菌锅。手提式灭菌锅。容量小。容量小。使用高压蒸汽灭菌锅
10、使用高压蒸汽灭菌锅19立式或卧式灭菌锅。立式或卧式灭菌锅。容量较大，容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。一般能装几十瓶或几百瓶。20灭菌柜。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，用于大要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶能装几百至几千瓶(袋袋)。21（二）分批灭菌（二）分批灭菌(batchsterilization） 1定义：定义：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。式。222操作过程：操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。空罐准备：清洗
11、、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷冷却却保保压压：把把培培养养基基的的温温度度降降低低到到接接种种的的温温度。度。2324温度随灭菌时间的变化温度随灭菌时间的变化25四路出汽：四路出汽：直接蒸汽直接蒸汽从排气、接种、进料从排气、接种、进料和消沫剂管排气和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图分批灭菌设备示意图三路进汽：三路进汽：直接蒸汽从直接蒸汽从通风、取样和出料口进通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持所规定的温度，并维持一定
12、的时间。这就是所一定的时间。这就是所谓的谓的“三路进气三路进气”。26（三）连续灭菌（三）连续灭菌（continuoussterilization） 1定定义义：将将培培养养基基通通过过专专门门设设计计的的灭灭菌菌器器，进进行行连连续续流流动动灭灭菌菌后后，进进入入预预先先灭灭过过菌菌的的发发酵酵罐罐中中的的灭灭菌菌方方式。式。2流程：流程：1)由热交换器组成的灭菌系统由热交换器组成的灭菌系统2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统3)由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统271)由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图由热交换器组成的灭
13、菌系统工艺流程图28温度随时间的变化温度随时间的变化292)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统30温度随灭菌时间的变化温度随灭菌时间的变化313)由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统32（四）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择（四）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌分批灭菌优点：优点：1. 不需附加设备不需附加设备2. 蒸汽利用率高蒸汽利用率高3. 节约劳动力节约劳动力缺点缺点1.培养基质量比较差培养基质量比较差2.罐的利用率低罐的利用率低3.冷却水用量大冷却水用量大 连续灭菌连续灭菌优点优点:1.采用高温快速灭菌法采用高温快速
14、灭菌法2.可以把培养基按性质分开灭菌可以把培养基按性质分开灭菌3.有利于自动控制有利于自动控制4.节省冷却水节省冷却水缺点缺点 1.投资费用高投资费用高2.对物料要求高对物料要求高33选择原则：选择原则：1培养基成份（易降解成分、液化情况等培养基成份（易降解成分、液化情况等 )2设备状况（冷却面积、传动装置等）设备状况（冷却面积、传动装置等） 3.动力条件动力条件34(五)、发酵罐的灭菌n培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从通常是用蒸汽加
15、热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持保持1公斤，公斤，20分钟。在保温结束后，关键分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。止形成真空而吸入带菌的空气。35(六)、补料液的灭菌n在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。同的料液。这些料液都必需经过灭菌。n灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率灭
16、菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。而定。n如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。续灭菌较为合适。n也有利用过滤法对另补料液进行除菌。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。n补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。中直接通入蒸汽。n所有的附属设备和管道都要经过灭菌。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。36四、高温对培养基成分的有害影响及其防止四、高温对培养基成分的有害影响及其防止37消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施 (1 (1）采用特殊加热灭菌法）采用特殊加热灭菌法( (连续灭菌方法）连续灭菌方法）（2 2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3 3）对含）对含Ca2+或或Fe3+的培养基与磷酸盐先作的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；淀； (4(4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌。含糖组合培养基）可进行低压灭菌。38
