工业发酵菌种选育

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1、工业发酵菌种选育工业发酵菌种选育工业发酵菌种选育工业发酵菌种选育诱变育种诱变育种以以微微生生物物的的自自然然变变异异作作为为基基础础的的生生产产选选种种的的机机率率并并不不很很高高，一一个个基基因因的的自自然然突突变频率仅变频率仅1010-6-6-10-10-10-10左右。左右。诱诱变变育育种种：以以诱诱发发突突变变为为基基础础的的育育种种，是是迄迄今今为为止止国国内内外外提提高高菌菌种种产产量量、性性能能的主要手段。的主要手段。*适于改良品种的个别性状适于改良品种的个别性状*育种程序简单，年限短育种程序简单，年限短*变异的方向和性质不定变异的方向和性质不定*与其它育种方法结合使用，将发挥巨

2、大与其它育种方法结合使用，将发挥巨大作用作用*提高突变率，扩大提高突变率，扩大“变异谱变异谱”、创造新、创造新类型类型诱变育种的意义及特点诱变育种的意义及特点概念概念以以人工诱变人工诱变手段诱发微生物基因手段诱发微生物基因突变突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出异体中找出产量高产量高、性状优良性状优良的突变株，的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的环境条见下合成有效产物。使其在最适的环境条见下合成有效产物。 诱变育种步骤诱变育种步骤出发菌株的选择出发菌株的选择处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱变

3、处理诱变处理中间培养中间培养分离和筛选分离和筛选( (一一) )出发菌株的选择出发菌株的选择1自自然然界界新新分分离离的的野野生生型型菌菌株株，对对诱诱变变处处理较敏感，容易达到好的效果。理较敏感，容易达到好的效果。2 2在在生生产产中中经经生生产产选选种种得得到到的的菌菌株株与与野野生生型较相像，也是良好的出发菌株。型较相像，也是良好的出发菌株。3 3每每次次诱诱变变处处理理都都有有一一定定提提高高的的菌菌株株，往往往多次诱变能积累较多的提高。往多次诱变能积累较多的提高。 ( (二二) )处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备诱诱变变育育种种要要求求所所处处理理的的细细胞胞必必须须是是对对数数生生

4、长长期期同同步步生生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。为什么不选择多细胞的菌悬液？为什么不选择多细胞的菌悬液？为什么选择对数生长期的菌？为什么选择对数生长期的菌？( (三三) )诱变处理诱变处理 根根据据后后面面有有关关诱诱变变剂剂及及诱诱变变处处理理的的介介绍绍，结结合合诱诱变变对对象象的的实实际际，设设计诱变处理方案。计诱变处理方案。( (四四) )中间培养中间培养 由由于于在在发发生生了了突突变变尚尚未未表表现现出出来来之之前前，有有一一个个表表现现延延迟迟的的过过程程，即即细细胞胞内内原原有有酶酶量量的的稀稀释释过过程程( (生生理理延延迟迟)

5、 )，需需3 3代代以以上上的的繁繁殖殖才才能能将将突突变变性性状状表表现现出出来来。这这个个过过程程对对今今后后的的筛筛选选和和获获得得稳稳定定菌菌株株都都是是极为重要的。极为重要的。( (五五) )分离和筛选分离和筛选筛筛选选分分初初筛筛和和复复筛筛。初初筛筛以以迅迅速速筛筛出出大大量量的的达达到到初初步步要要求求的的分分离离菌菌落落为为目目的的，以以量量为主。为主。复复筛筛则则是是精精选选，以以质质为为主主，也也就就是是以以精精确确度度为主。因此在具体方法上就有差异。为主。因此在具体方法上就有差异。（二）诱变育种应注意的问题（二）诱变育种应注意的问题诱变成功的关键：诱变成功的关键：出发菌

6、株的选择出发菌株的选择诱变因素的选择诱变因素的选择诱变剂量的选择诱变剂量的选择单孢子（或单细胞）悬液的制备单孢子（或单细胞）悬液的制备出发菌株的选择出发菌株的选择1 1自自然然界界新新分分离离的的野野生生型型菌菌株株，对对诱诱变变处理较敏感，容易达到好的效果。处理较敏感，容易达到好的效果。2 2在在生生产产中中经经生生产产选选种种得得到到的的菌菌株株与与野野生型较相像，也是良好的出发菌株。生型较相像，也是良好的出发菌株。3 3已已经经诱诱变变过过的的菌菌株株，再再诱诱变变易易产产生生负负突突变变，再再度度提提高高产产量量比比较较困困难难，但但也也有有可能会发生正的突变。可能会发生正的突变。诱变

7、因素的选择诱变因素的选择诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂剂主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。亚硝基甲醛尿等。诱变方法：单一诱变剂处理诱变方法：单一诱变剂处理 复合诱变剂处理复合诱变剂处理物理诱变剂：物理诱变剂：射线如紫外线射线如紫外线、X-X-射线、射线、-射线，快中子；射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全

8、。型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。的设备中使用，否则有一定危险性。化化学学诱诱变变剂剂：碱碱基基类类似似物物、55氟氟尿尿嘧嘧啶啶、烷化剂等。烷化剂等。化化学学诱诱变变剂剂中中使使用用最最多多、最最有有效效的的是是烷烷化化剂。剂。使用化学诱变剂的优缺点：使用化学诱变剂的优缺点：1 1、大大多多数数情情况况下下，就就突突变变数数量量而而言言，要要比电离辐射更有效。比电离辐射更有效。 2 2、化化学学诱诱变变剂剂是是很很经经济济的的，因因为

9、为只只需需要要少少量量的的合合适适的的诱诱变变剂剂，设设备备是是实实验验室室的的一一般般玻玻璃璃器器皿皿，一一个个蒸蒸气气罩罩。而而用用电电离离辐辐射射进进行行工工作作时时，设设备备费用大，并要注意安全性。费用大，并要注意安全性。3 3、大大部部分分诱诱变变剂剂是是致致癌癌剂剂，所所以以在在使使用用中中必必须须非非常常谨谨慎慎，要要避避免免化化学学诱诱变变剂剂与与皮皮肤肤接接触触，且且切切勿勿吸吸入入其其蒸蒸气气，有有人人对对某某些些诱诱变变剂剂极极其其敏敏感感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。不同的菌株选用不同的诱变剂！不同的菌株选用不同的诱变剂！

10、野生型菌株野生型菌株( (遗传性不稳定遗传性不稳定):):用缓和的诱用缓和的诱变剂。变剂。 遗传性稳定的菌株遗传性稳定的菌株: :先要用强烈的不常用先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。处理或多次自然分离。单孢子悬液的制备单孢子悬液的制备细胞的要求：处于对数生长期，并细胞的要求：处于对数生长期，并且是均匀状态的单细胞悬液。且是均匀状态的单细胞悬液。获得单细胞悬液的方法必须要有针获得单细胞悬液的方法必须要有针对性。对性。 例如：诱变霉菌或放线菌时，应处理它们例如

11、：诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。（三）常用的物理（三）常用的物理 诱变剂处理方法诱变剂处理方法紫外线诱变紫外线诱变紫外线的主要作用紫外线的主要作用光复活作用光复活作用光谱范围与有效光谱范围光谱范围与有效光谱范围 40-390nm40-390nm 200-300nm 200-300nm；260nm260nm如何避免光复活作如何避免光复活作用？用？ 紫紫外外线线诱诱变变一一般般采采用用15W15W紫紫外外线线杀杀菌菌灯灯灯灯与与处处理理物物的的距距离离为为151530cm30cm，照照射射时时间间依依菌菌种种而而异

12、异，一一般般为为几几秒秒至至几几十十分分钟钟。一一般般我我们们常常以以细细胞胞的的死死亡亡率率表表示示，希希望望照照射射的的剂剂量死亡率控制在量死亡率控制在707080%80%为宜为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为被照射的菌悬液细胞数，细菌为106106个个mlml左右，霉菌孢子和酵母细胞为左右，霉菌孢子和酵母细胞为106106107107个个mlml。由于。由于紫外线穿透力紫外线穿透力不强，要不强，要求照射液不要太深，约厚，同时要用求照射液不要太深，约厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。匀。由于紫外线照射后有由于紫外线照射后有光复活效应光复活

13、效应，所以，所以照射时和照射后的处理应在照射时和照射后的处理应在红灯红灯下进行。下进行。 ( (二二) )操作步骤操作步骤 1 1将将细细菌菌培培养养液液以以3000r3000rminmin离离心心5min5min，倾倾去去上上清清液液，将将菌菌体体打打散散加加入入无无菌菌生生理理盐盐水水再离心洗涤。再离心洗涤。 2 2将将菌菌悬悬液液放放入入一一巳巳灭灭菌菌的的，装装有有玻玻璃璃珠珠的的三三角角瓶瓶内内用用手手摇摇动动，以以打打散散菌菌体体。将将菌菌液液倒倒入入有有定定性性滤滤纸纸的的漏漏斗斗内内过过滤滤，单单细细胞胞滤滤液液装装入入试试管管内内，一一般般处处于于浑浑浊浊态态的的细细胞胞液液

14、含含细细胞数可达胞数可达108108个个mlml左右，作为待处理菌悬液。左右，作为待处理菌悬液。3 3取取2 24m14m1制制备备的的菌菌液液加加到到直直径径9cm9cm培培养养皿皿内内，放放入入一一无无菌菌磁磁力力搅搅拌拌子子，然然后后置置磁磁力力搅搅拌拌器器上上、15W15W紫紫外外线线下下30cm30cm处处。在在正正式式照照射射前前，应应先先开开紫紫外外线线10min10min，让让紫紫外外灯灯预预热热，然然后后开开启启皿皿盖盖正正式式在在搅搅拌拌下下照照射射101050s50s。操操作作均均应应在在红红灯灯下下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4 4取未照射的制备菌液和照射菌液各进行取未照射的制备菌液和照射菌液各进行稀释分离，计数活菌细胞数。稀释分离，计数活菌细胞数。5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液体培养基中于液体培养基中(300ml(300ml三角瓶内装三角瓶内装30ml30ml培养液培养液) )，120r120rminmin振振荡培养荡培养4 46h6h。6 6取中间培养液稀释分离、培养。取中间培养液稀释分离、培养。7 7挑取菌落进行筛选。挑取菌落进行筛选。