11植物组织培养HXY

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1、植物细胞工程植物细胞工程n以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。 1植物细胞工程的主要内容植物细胞工程的主要内容n 植物细胞、组织和器官的培养植物细胞、组织和器官的培养 n 花药培养技术花药培养技术 n 植物原生质体的融合植物原生质体的融

2、合n 转基因植物的制作转基因植物的制作n 染色体（组）的操作技术染色体（组）的操作技术 2植物细胞工程的发展史植物细胞工程的发展史n1902年，德国植物学家哈伯兰特（年，德国植物学家哈伯兰特（G.Haberlandt）提出植）提出植物细胞具有全能性物细胞具有全能性 n 1904年，年， Hanning，在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和，在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚辣根菜的胚,最先将幼胚培养技术应用于育种实践的植物细胞最先将幼胚培养技术应用于育种实践的植物细胞工程。工程。n19341939年，先后发现了各种生长素，并利用番茄、胡年，先后发现了各种生长素，并利用番茄、胡萝卜的离体培养

3、，初步建立起较为成熟的细胞培养方法，使萝卜的离体培养，初步建立起较为成熟的细胞培养方法，使植物细胞培养进入一个崭新的时代；植物细胞培养进入一个崭新的时代；n1948.中国植物生理学家崔徵和美国科学家合作发现腺嘌呤中国植物生理学家崔徵和美国科学家合作发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 3植物细胞工程的发展史植物细胞工程的发展史n1954.skoog发现发现DNA降解物中含有细胞分裂和生长的活性物降解物中含有细胞分裂和生长的活性物质。后被命名为激动素。质。后被命名为激动素。n50年代主要在培养方法方面做了一系列卓有成效的工作，使细

4、年代主要在培养方法方面做了一系列卓有成效的工作，使细胞培养技术日臻成熟胞培养技术日臻成熟n 1960年，年，Morel提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法，提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。和社会效益。n1965年，年，Vasil等用单个胡萝卜细胞培养获得整个植株，细胞等用单个胡萝卜细胞培养获得整个植株，细胞全能性理论得到科学的验证。全能性理论得到科学的验证。 4植物细胞工程的发展史植物细胞工程的发展史n1971年，年，Takebe等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得等

5、从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。原生质体植株再生成功。n 1972年，年，Carlson等通过两个烟草物种原生质体的融合，获等通过两个烟草物种原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。得了第一个体细胞杂种植株。n 1973年，年，Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。粉植株。 n1978年，年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株第一个属间杂种植株 到目前为止，组织培养、原生质体培养、到目前为止，组织培养、原生质体培养、细胞融合已在许多植物上

6、获得再生成功。细胞融合已在许多植物上获得再生成功。 5第第1111章章 植物组织培养植物组织培养611.1 11.1 植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础7植物组织培养植物组织培养n概念：在无菌和人为控制外因的条件下，概念：在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。中分化、发育出整个植株的技术。n理论基础：理论基础：植物细胞的全能性植物细胞的全能性在适宜在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其

7、亲本一样的完整植株。育成同其亲本一样的完整植株。8植物组织培养技术：植物组织培养技术：9植物的无性繁殖植物的无性繁殖11.1.1 植物的无性繁殖植物的无性繁殖n被子植物的两种繁殖方式：有性繁殖和被子植物的两种繁殖方式：有性繁殖和无性繁殖。无性繁殖。n无性繁殖特点：无性繁殖特点：n A、不发生遗传重组，后代与亲代在遗传、不发生遗传重组，后代与亲代在遗传上完全一致；上完全一致；n B、可短期内获得大量后代；、可短期内获得大量后代；n C、 繁殖方式多样化：营养器官再生、营繁殖方式多样化：营养器官再生、营养器官变态、落地生根等养器官变态、落地生根等1011.1.2 植物细胞全能性理论植物细胞全能性理

8、论n概念：植物体的每一个细胞都包含有该整个植概念：植物体的每一个细胞都包含有该整个植株所特有的全套遗传信息，都有发育成一个完株所特有的全套遗传信息，都有发育成一个完整植株的潜在能力。整植株的潜在能力。n表现全能性的基础和条件表现全能性的基础和条件n基础：基础： 生物体的每一个细胞都包含相同的生物体的每一个细胞都包含相同的DNADNA，理，理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性n条件：离体，提供营养物质，激素，其他适宜条件条件：离体，提供营养物质，激素，其他适宜条件（如温度等）（如温度等）1111.1.2 植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论n

9、几乎所有植物的体细胞、雌、雄配子体都具有全能性，都能几乎所有植物的体细胞、雌、雄配子体都具有全能性，都能发育成胚和植株发育成胚和植株n全能性大小：受精卵全能性大小：受精卵生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞n植物细胞全能性的差异：植物细胞全能性的差异：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 居居间分生组织间分生组织 侧生分生组织侧生分生组织 薄壁组织薄壁组织(基本组织基本组织) 厚角组织厚角组织 输导组织输导组织 厚壁组织。厚壁组织。1211.1.2 植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论n在生物体内，由于基因的选择性表达，细胞不能表在生物体内，由于

10、基因的选择性表达，细胞不能表现出全能性，而是现出全能性，而是分化分化成为不同的组织器官。成为不同的组织器官。n当已分化的植物器官、组织或细胞脱离母体后，在当已分化的植物器官、组织或细胞脱离母体后，在一定的营养物质、激素等外界条件作用下分化形成一定的营养物质、激素等外界条件作用下分化形成愈伤组织愈伤组织（一种相对没有分化的细胞团），继而在（一种相对没有分化的细胞团），继而在植物激素等诱导下发生植物激素等诱导下发生再分化再分化，才能表达出全能性，才能表达出全能性，发育成完整植株。发育成完整植株。1311.1.3植物细胞的脱分化和再分化植物细胞的脱分化和再分化n（1）细胞分化：）细胞分化：细胞后代在

11、形态结构和功能上发细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程。也可以说是相同基因型的细胞所具生差异的过程。也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。有的各个不同的表现型。 它包括：它包括：n时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；同的形态结构和功能；n空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。n细胞分化是一个复杂的生物化学过程，有复杂的调细胞分化是一个复杂的生物化

12、学过程，有复杂的调控机制。控机制。营养物质营养物质和和激素的种类和配比激素的种类和配比能深刻影响能深刻影响分化过程，分化过程，光照光照则是许多细胞分化的必需条件则是许多细胞分化的必需条件14n（2）细胞的脱分化：）细胞的脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞状态的过程就是细胞脱分化胞状态的过程就是细胞脱分化n愈伤组织愈伤组织是细胞脱分化的结果是细胞脱分化的结果n脱分化的条件：离体、避光、一定的营养物质、激素和脱分化的条件：离体、避光、一定的营养物质、激素和其他外界条件

13、其他外界条件(无菌、适宜的温度等无菌、适宜的温度等)。15细胞排列疏松而无规则，无组织结构细胞排列疏松而无规则，无组织结构高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞n（3）细胞的再分化和器官发生）细胞的再分化和器官发生 n再分化：脱分化后的分生细胞（再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织愈伤组织）在特定的）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，发育成完整生物体，条件下，重新恢复细胞分化能力，发育成完整生物体，这一过程称为细胞再分化。这一过程称为细胞再分化。n再分化需要的条件：离体、光照、一定的营养物质、再分化需要的条件：离体、光照、一定的营养物质、激素和其他外界条件激素

14、和其他外界条件(无菌、适宜的温度等无菌、适宜的温度等)1719高等植物细胞脱分化与再分化示意图高等植物细胞脱分化与再分化示意图愈伤愈伤组织组织器官发器官发生（根生（根和芽）和芽）再再生生植植株株脱分化脱分化再分化再分化离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞（外或细胞（外植体）植体）胚状体胚状体发生发生n植物愈伤组织再分化的植物愈伤组织再分化的两条途径两条途径：n器官发生器官发生途径：由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽途径：由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株。个完整的植株。n胚状体

15、胚状体/体细胞胚发生体细胞胚发生途径：在愈伤组织中产生出一些与途径：在愈伤组织中产生出一些与种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极种子胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，这性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似。似。20愈伤愈伤组织组织器官发器官发生（根生（根和芽）和芽）再再生生植植株株脱分化脱分化再分化再分化离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞（外或细胞（外植体）植体）胚状体胚状体发生发生小结：几个重

16、要概念小结：几个重要概念n外植体外植体explant：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。n分化分化differentiation：细细胞在分裂胞在分裂过过程中程中发发生生结结构和功能上的改构和功能上的改变变，从而在个，从而在个发发育中形成各育中形成各类组织类组织和器官完成整个生活周期。和器官完成整个生活周期。n脱分化脱分化dedifferentiation:已分化好的已分化好的细细胞在人工胞在人工诱导诱导条件下，条件下，恢复分生能力，回复到分化恢复分生能力，回复到分化组织组织状状态态的的过过程。程。n再分化再分化redifferentiation

17、:脱分化后具有分生能力的脱分化后具有分生能力的细细胞再胞再经过经过与原来相同的分化与原来相同的分化过过程，重新形程，重新形成各成各类组织类组织和器官的和器官的过过程。程。n愈愈伤组织伤组织callus:在离体培养在离体培养过过程中形成的具有分生能力的一程中形成的具有分生能力的一团团不不规则细规则细胞，多在外植体切面上胞，多在外植体切面上产产生。生。n胚状体胚状体embroid）：）：在离体培养在离体培养过过程中程中产产生一种形似胚（具有明生一种形似胚（具有明显显的根端和芽端），功能与胚相同的的根端和芽端），功能与胚相同的结结构。构。n继继代培养：代培养：更更换换新新鲜鲜培养基来繁殖同种培养基来

18、繁殖同种类类型的材料（愈型的材料（愈伤组织伤组织.芽等）芽等）。21n（4）影响植物细胞脱分化和再分化因素：）影响植物细胞脱分化和再分化因素：n内部因子：植物的遗传性状、生理状况。内部因子：植物的遗传性状、生理状况。n外部因子：营养条件（外部因子：营养条件（植物激素植物激素、无机盐、有、无机盐、有机营养成分等）、环境条件（培养基的机营养成分等）、环境条件（培养基的pH、渗透压、温度、湿度、光照等）。渗透压、温度、湿度、光照等）。n当当细胞分裂素细胞分裂素/生长素生长素浓度比浓度比高高时，有利于时，有利于芽芽的的发生；浓度比发生；浓度比低低时，有利于时，有利于根根的发生。的发生。 n愈伤组织再分

19、化过程应先诱导生愈伤组织再分化过程应先诱导生芽芽，再诱导生，再诱导生根根 22 脱分化和再分化的比较：脱分化和再分化的比较：比较内容比较内容比较内容比较内容脱分化脱分化脱分化脱分化再分化再分化再分化再分化过程过程过程过程外植体外植体外植体外植体愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗幼苗幼苗形成体特形成体特形成体特形成体特点点点点排列疏松、高度液泡排列疏松、高度液泡排列疏松、高度液泡排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞化的薄壁细胞化的薄壁细胞化的薄壁细胞有根、芽有根、芽有根、芽有根、芽需要条件需要条件需要条件需要条件a.a.a.a.离体离体离体离体b.b.b.b.适宜

20、的营养适宜的营养适宜的营养适宜的营养c.c.c.c.生长素生长素生长素生长素/ / / /细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素的比例适中的比例适中的比例适中的比例适中d.d.d.d.不需光不需光不需光不需光a.a.a.a.离体离体离体离体b.b.b.b.适宜的营养适宜的营养适宜的营养适宜的营养c.c.c.c.生长素生长素生长素生长素/ / / /细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素的比例高或低诱素的比例高或低诱素的比例高或低诱素的比例高或低诱导生芽或生根导生芽或生根导生芽或生根导生芽或生根d.d.d.d.光照光照光照光照n（5）其他影响植物细胞脱分化与再分化）其他影响植物细胞脱分化与再分化的

21、条件的条件n物理因素：切割造成的机械和生理隔离，切物理因素：切割造成的机械和生理隔离，切割创伤产生的物质。割创伤产生的物质。n化学因素：化学试剂，辐射处理。化学因素：化学试剂，辐射处理。2411.2 11.2 植物组织培养植物组织培养25切取切取外植体外植体无菌无菌接种接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成培养室培养室移栽移栽脱分化脱分化再分化再分化n植物组织培养不能有任何杂菌污染，因此，植物组织培养不能有任何杂菌污染，因此，实验器材、培养基和工作场所都要实验器材、培养基和工作场所都要严格消严格消毒和灭菌毒和灭菌。在取材。接种和培养过程中要。在取材。接种和培养过程中要

22、严格无菌操作规范严格无菌操作规范。2711.2.1 实验材料的清洗和消毒实验材料的清洗和消毒n（1）清洗）清洗n 实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。n（2）消毒）消毒n 清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。外植体在清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。外植体在接种之前，须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌接种之前，须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因此选择消毒剂，既要考虑力不同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作具有良好的消毒杀菌作用用，同时，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解又易被蒸馏水冲洗掉或能自行

23、分解的物质，且不会的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长不影响生长。在使用不同的药。在使用不同的药剂时，需要考虑使用剂时，需要考虑使用浓度浓度和和处理时间处理时间。2829外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等都需清外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等都需清洗和消毒。几种常用消毒剂的效果比较：洗和消毒。几种常用消毒剂的效果比较：消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min.)(min.)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化

24、汞0.10.11 12 21515最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/ /纳纳9 9 10105 53030好好易易n对一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的处理。对一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的处理。n表面具较厚蜡质和角质层的，灭菌剂不易粘着，可加入少量表面活性表面具较厚蜡质和角质层的，灭菌剂不易粘着，可加入少量表面活性剂。剂。n对器官外植体的灭菌，一般采用多种药剂配合使用的方法。对器官外植体的灭菌，一般采用多种药剂配合使用的方法。外植体的选择：外植体

25、的选择：一般有一般有3种来源：一是种来源：一是生长在自生长在自然环境下的植物然环境下的植物；二是；二是在温室控制环境条件下生在温室控制环境条件下生长的植物长的植物；三是；三是无菌环境下已经过离体培养的植无菌环境下已经过离体培养的植物物。301 1、取材：、取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。试验容易成功。2 2、外植体大小选择、外植体大小选择 ：因外植体不同而不同。如利：因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。用茎尖培养，茎尖大小对

26、脱毒效果非常明显。3 3、选择外植体的时期、选择外植体的时期 ：外植体的生长动态往往与外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养，会得到较好的结植物生长的最适宜时期取材培养，会得到较好的结果。果。 外植体的选择31n (1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗-75%酒精浸泡酒精浸泡10-20min-无菌水洗无菌水洗2-3次次-NaClO或升汞溶液泡或升汞溶液泡10-15min-无菌水洗无菌水洗3-4次次n（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗）果实和种子的消毒：

27、自来水冲洗10-30min-70%酒精漂洗酒精漂洗-2%NaClO液浸液浸10min-无菌水无菌水2-3次次-取出种子培养取出种子培养n （3）根及地下部器官的消毒：自来水冲洗）根及地下部器官的消毒：自来水冲洗-纯酒精漂洗纯酒精漂洗-升汞升汞浸浸5-10min或或2%NaClO液浸液浸10-15min-无菌水洗无菌水洗3次次n（4）花药的消毒：）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟酒精浸泡数秒钟-无菌水洗无菌水洗2-3次次-漂漂白粉上清液浸白粉上清液浸10min-无菌水洗无菌水洗2-3次次.32外植体的灭菌n一般情况下，如果外植体较大而且硬，可直接用消毒剂处理，一般情况下，如果外植体较大而且硬，可

28、直接用消毒剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒；如果是幼嫩的茎尖，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒；如果是幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜剖显微镜n取出需要的茎尖大小培养；如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、取出需要的茎尖大小培养；如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条件下剥出需要的外植体；如果是细胞，应按培养目的，选择件下剥出需要的外植体；如果是细胞，应按培养目的，选择合适的起始材料进行相应的外植体消毒。合适的起

29、始材料进行相应的外植体消毒。n如果外植体表面污染严重，需流水冲洗如果外植体表面污染严重，需流水冲洗1h或更长时间，或者或更长时间，或者先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其他各个部分建立先通过种子培养得到无菌种苗，然后再用其他各个部分建立组织培养。组织培养。33外植体的灭菌11.2.2 培养基培养基34一、培养基的成分及其作用一、培养基的成分及其作用（一）无机营养物质（一）无机营养物质 培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了要连续的供给某些无机化学物质，除了C C、H H、O O之外，之外，需要量比较多的元素叫需要量比

30、较多的元素叫大量元素大量元素，需要量比较少的，需要量比较少的元素叫元素叫微量元素微量元素。1.无机营养物质无机营养物质2.有机营养物质有机营养物质3.植物激素类植物激素类4.固化剂和悬浮剂固化剂和悬浮剂培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括毫克。大量元素包括N, SN, S， P, K, Ca, Mg P, K, Ca, Mg。培养基中加入量最多的是培养基中加入量最多的是N N，N N一般以硝酸盐或氨一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供盐，或者两者结合的盐提供大量元素大量元素35微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所微量

31、元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、 MoMo、MnMn、CoCo，ClCl其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。毒害现象。微量元素微量元素36（二）（二）. .有机营养物质有机营养物质有机物质包括糖类、维生素类、氨基酸类、和一些其有机物质包括糖类、维生素类、氨基酸类、和一些其它的有机添加物它的有机添加物n1 1、糖类（碳源）、糖类（碳源）糖在培养基的作用：糖在培养基的作用：1

32、1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架）、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2 2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3 3）、维持渗透压）、维持渗透压蔗糖蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源常用的碳源372、氨基酸类物质、氨基酸类物质 绝大多数氨基酸适量时对培养效果都有正象效应。常绝大多数氨基酸适量时对培养效果都有正象效应。常用的有用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、维生素类物质、维生素类物质 维生素类物质在是

33、多种酶的辅酶或辅基。维生素类物质在是多种酶的辅酶或辅基。 硫胺素（硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（醇（VB6）促进根的生长，烟酸（）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素，又称维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（VB5）、生物素（）、生物素（VH）、钴胺素（）、钴胺素（VB12）、叶酸）、叶酸（VBc），），Vc等。等。38（二）（二）. .有机营养物质有机营养物质4、其它有机物质、其它有机

34、物质1）肌醇（环己六醇）肌醇（环己六醇） 肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成2）天然有机物天然有机物一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。现出了良好的促进作用。39（二）（二）. .有机营养物质有机营养物质n植物激素是在植物体内合成的，对植物生长

35、发植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长植物生长调节调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。剂是外源的调节植物生长发育的物质。n无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。化。（三）、植物激素（三）、植物激素40 1 1、生长素类：、生长素类：1 1）吲哚类：）吲哚类：IAAIAA（吲哚乙酸）、（吲哚乙酸）、 IBAIBA（吲

36、哚丁酸）（吲哚丁酸） 、IPAIPA（吲哚丙酸）（吲哚丙酸）2 2）萘酸类：）萘酸类： NAANAA（萘乙酸）（萘乙酸）3 3）苯氧羧酸类：）苯氧羧酸类：2,4-D2,4-D（2,4-2,4-二氯苯氧乙酸）、二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T2,4,5-T（ 2,4,5-2,4,5-三氯苯氧乙酸）、三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-T2,4,5-TP P（ 2,4,5-2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。强的生长素。41 生长素的生理作用生长素的生理作用1 1、促进细胞生长和细胞分裂、促进细

37、胞生长和细胞分裂2 2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力3 3、形成愈伤组织，促进生根、形成愈伤组织，促进生根4 4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。导。42A A：NAA 0.1mg/LNAA 0.1mg/L，芽（多），根（无），愈伤组织（少量），芽（多），根（无），愈伤组织（少量） B B：NAA 5.0mg/LNAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量432、细胞分裂素、细胞分裂

38、素n是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-6-糠糠基氨基嘌呤基氨基嘌呤KTKT）、）、6-6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-BA6-BA）和）和玉米素（玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是6 6苄基氨苄基氨基嘌呤。基嘌呤。n功能：功能：1 1、促进细胞的分裂和分化、促进细胞的分裂和分化2 2、诱导芽的分化、诱导芽的分化3 3、促进侧芽的萌发和生长、促进侧芽的萌发和生长4 4、抑制衰老、抑制衰老44ABA A：BA(0mg/L) BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量），芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B B

39、：BA(0.1mg/L)BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量），芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）45控制植物细胞分化控制植物细胞分化n分裂素分裂素/ /生长素的比例是控制芽和根形成生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件的一个重要条件n比例高时比例高时产生芽产生芽, ,比例低时比例低时产生产生根根46生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素利于利于根根的分化的分化生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素利于利于芽芽的分化的分化生长素生长素=细胞分裂素细胞分裂素促进愈伤组织形成促进愈伤组织形成促进根的分化促进根的分化促进芽的分化促进芽的分化生理作用：生理作用：1 1、诱导茎的

40、细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效型特别有效，对根无效2 2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。协同作用。IAA/GAIAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。比值低有利于韧皮部的分化。3 3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。4 4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用注：不耐热，应采用过滤灭菌加入注：不耐热，应采用过滤灭菌加入3 3、赤霉素（

41、、赤霉素（GAGA3 3）不常用不常用481 1、固化剂、固化剂 琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养）些作物的花药培养） 琼脂的用量一般在琼脂的用量一般在7-10g/L7-10g/L，所购回的琼脂要，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。2 2、悬浮剂、悬浮剂FicollFicoll（聚蔗糖）（聚蔗糖） （四）固化剂和悬浮剂（四）固化剂和悬浮剂49培养基的种类（培养基的种类（根据

42、无机盐的浓度根据无机盐的浓度）：）：1、高无机盐含量培养基、高无机盐含量培养基 钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。培养基。 2、高硝态氮培养基、高硝态氮培养基 硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。主要适合与木本植物

43、、十字花科植物和单子叶植物的组织主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。培养基。 二、培养基的配方及培养基的选择二、培养基的配方及培养基的选择50培养基的种类（培养基的种类（根据无机盐的浓度根据无机盐的浓度）：）：3 、中等无机盐含量培养基、中等无机盐含量培养基 大量元素约为大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较含量较MS的高，维生素种类比的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，N

44、T、H、Miller培养培养基。基。 4、低无机盐含量培养基、低无机盐含量培养基 大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。 51根据根据培养物的培养过程培养物的培养过程，培养基分为：，培养基分为：初代培养基初代培养基：用来第一次接种外植体的培养基：用来第一次接种外植体的培养基继代培养基继代培养基：用来接种继初代培养物的培养基。：用来接种继初代培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为：根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基，增殖

45、培养基，生根培养基诱导培养基，增殖培养基，生根培养基52根据根据营养水平营养水平不同，培养基可分为基本培养基和不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。完全培养基。基本培养基基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有（就是通常称呼的培养基）主要有MSMS、WhiteWhite、 N6N6、B5 B5 、改良、改良MSMS、HellerHeller、NitshNitsh、SHSH、 MillerMiller等。等。完全培养基完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长激素和其他的不同需要，附加一些物质，如生长激素和其他复杂有机物质等。复

46、杂有机物质等。例如：例如：MS + 2,4-DMS + 2,4-D MS + NAA + 6-BA MS + NAA + 6-BA531 1. .无机营养成分无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：前人的经验，例如：MSMS是广谱性培养基，是广谱性培养基，N6N6用于单子叶植物用于单子叶植物的培养。豆科多用的培养。豆科多用B5B5培养基。培养基。2 2、植物生长调节剂植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则：必须进行筛选试验。总体原则- -当诱导当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分愈伤组织形成时，细胞分裂

47、素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3 3、有机成分有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。培养基的选择：培养基的选择：54 （一）、贮备液（母液）的配制（一）、贮备液（母液）的配制 母液有：大量元素，微量元素，铁盐，有机成分母液有：大量元素，微量元素，铁盐，有机成分为什么要配制母液？为什么要配制母液？ 1 1）、方便）、方便 2 2）、准确（有些成分

48、量太小）、准确（有些成分量太小） 三、培养基的配制三、培养基的配制551、大量元素母液的配制、大量元素母液的配制各成分按照表各成分按照表1培养基浓度含量扩大培养基浓度含量扩大10倍，按顺序逐步混合。倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为的容量瓶中，即为10倍的大量元素倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配每配1L培养基取此液培养基取此液100ml。 56注意：注意：(1) 某些无机成分如某些无机成分如Ca2+、SO42一一、Mg 2十十和和H2PO4一一等在一等在一起

49、可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的配制时要用纯度高的重蒸馏水重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的溶解，药品采用等级较高的分析分析纯纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序混合，混合时应注意先后顺序。特别应将。特别应将Ca2+、SO42一一、Mg 2十十和和H2PO4一一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl22H2O要在最后单独加入，在溶解要在最后单独加入，在溶解C

50、aCl22H2O时，时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。57、微量元素母液的配制、微量元素母液的配制MSMS培养基的微量元素无机盐由培养基的微量元素无机盐由7 7种化合物（除种化合物（除FeFe）组成。）组成。微量元素用量较少，特别是微量元素用量较少，特别是CuSOCuSO4 45H5H2 2O O、CoClCoCl2 26H6H2 2O O，因此在配制中分微量，因此在配制中分微量、配制。配制。按照表按照表2 2，表，表3 3配方，用感量

51、为配方，用感量为0.0001g0.0001g的分析天平称量，的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L1L培养基，培养基，取微量取微量10ml10ml，微量，微量mlml58593 3、铁盐母液的配制、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，配成母液。这种螯合物使用

52、起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制搅拌溶解。配制培养基时，配制1L1L取此液取此液10ml10ml。60在在配配制制铁铁盐盐时时，如如果果加加热热搅搅拌拌时时间间过过短短，会会造造成成Fe Fe S0S04 4和和NaNa2 2EDTAEDTA鳌鳌合合不不彻彻底底，此此时时若若将将其其冷冷藏藏，FeS0FeS04 4会会结结晶晶析析出出。为为避避免免此此现现象象发发生生，配配制制铁铁盐盐母母液液时时，FeS0FeS04 4和和NaNa2 2EDTAEDTA应应分分别别加加热热溶溶解解后后混混

53、合合，并并置置于于加加热热搅搅拌拌器器上上不不断断搅搅拌拌至至溶溶液液呈呈金金黄黄色色( (约约加加热热20 20 - - 30 30 min)min)，调，调pHpH值至值至5 .55 .5，室温放置冷却后，再冷藏。，室温放置冷却后，再冷藏。614 4、有机成分母液的配制、有机成分母液的配制 MSMS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。并贮馏水溶解，注意称量时用电子分

54、析天平。并贮存在棕色无菌瓶中存在棕色无菌瓶中 。 配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。容。625 5、植物生长调节剂母液配制、植物生长调节剂母液配制 一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以0.5mg/ml0.5mg/ml为好，需要注意的是：为好，需要注意的是：（）配制生长素类，例如（）配制生长素类，例如IAAIAA、NAANAA、2.4-D2.4-D、IBAIBA，应先，应先用少量用少量95%95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶解，然后用

55、蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。（）细胞分裂素，例如（）细胞分裂素，例如KTKT，应先用少量，应先用少量95%95%乙醇或无水乙乙醇或无水乙醇加醇加3434滴滴1mol/L1mol/L的盐酸溶解，或直接用的盐酸溶解，或直接用1mol/L HCl1mol/L HCl溶解，溶解，再用蒸馏水定容。再用蒸馏水定容。63注意：注意：所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都应保存在日期，所有的母液都应保存在0-40-4冰箱中，若母冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。液出现沉淀或霉团

56、则不能继续使用。641 1、计量、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量。根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量。2 2、移液、移液取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。3 3、称取琼脂、蔗糖、称取琼脂、蔗糖备用备用4 4、融化、融化用搪瓷量杯量取用搪瓷量杯量取600600700ml700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入边加热边用玻璃棒搅拌

57、，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。蔗糖。（二）、培养基的配制 655 5、混合、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml1000ml，来，来回混合几次回混合几次。6 6、调、调pHpH用滴管吸取用滴管吸取1 mol/L1 mol/L的的NaOHNaOH或或HClHCl溶液，逐滴滴入溶化的培养溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pHpH试纸调试纸调pH(5 pH(5 6)6)。注意：注意：高温灭菌会降低高温灭菌会降低pHpH值值( (约约0.20.20.30.3个个pHpH值值)

58、 )。不同的植物对培养基最适不同的植物对培养基最适pHpH值的要求是不同的值的要求是不同的; ; 一般来说当一般来说当pHpH值高于值高于6.06.0时，培养基会变硬；低于时，培养基会变硬；低于5.05.0时，琼时，琼脂不能很好地凝固。脂不能很好地凝固。66（二）、培养基的配制 7 7、分装、分装融化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和融化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/51/41/4。每每1L1L培养基，可分装培养基，可分装20203030瓶。瓶。8 8、包扎、包扎用封口

59、膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。9 9、灭菌、灭菌67（二）、培养基的配制 适用于各种器皿、培养基、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。等。121 121 维持维持202030min30min注意点：加足水、排尽气、注意点：加足水、排尽气、气压降到气压降到0 0时，才能开盖时，才能开盖湿热灭菌68 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节

60、剂养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜，滤膜孔径用注射器注入微孔滤膜，滤膜孔径0.220.220.450.45微米。微米。制培养基时，先将培养基高压灭菌，待降至制培养基时，先将培养基高压灭菌，待降至5050左左右时，加入适量的激素，然后分装。右时，加入适量的激素，然后分装。过滤灭菌6911.2.3 接种接种701 1、实验器具和材料的准备、实验器具和材料的准备

61、2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：台面。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。菌效果。3 3、关紫外灯、打开风机，过、关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲间，进入缓冲间，以以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）作台）71

62、组织培养实验操作过程：组织培养实验操作过程：4 4、用、用70707575的酒精拭擦台面并消毒双手。试验的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。长。725 5、取流水冲洗（至少、取流水冲洗（至少30

63、min30min）过的外植体，用一定）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3-43-4次，放入无菌次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。械进行分离、切割或其他处理。6 6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。盖上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。73注意注意

64、（1 1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。快，以防空气流动，增加污染机会。（2 2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。火焰烧灼消毒或取备品更换。 （3 3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4 4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细）工作由始至终要保持一

65、定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。会。74（5 5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。致细胞交叉污染。（6 6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带

66、入工作台面发生污染。沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7 7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。应将吸管丢掉。75接种接种时在近火焰在近火焰处打开瓶口，使瓶打开瓶口，使瓶倾斜，斜，以免空气中微生物落入瓶中以免空气中微生物落入瓶中正确错误76整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速迅速正确错误77接种接种过程中尽可能达到程中尽可能达到悬空要求空要求防止操作带来的污染正确错误78接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶

67、口接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误79瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误80接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生81种子和分生种子和分生组织：培养：培养时通常将其通常将其贴放在培养基表放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正确错误82接种茎段：注意形接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中学上端露于空气中正确错误83人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培养皿：洗高压灭菌玻璃器皿

68、：洗干热（干热箱）或晾干 接种用具：湿布擦 泡75%95%酒精烧培养基：高压灭菌培养材料外部细菌：用水冲洗化学药剂处理 内部细菌 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板，95%酒精擦超净工作台， 用化学试剂薰蒸污染来源84污染及其预防污染及其预防 培养中培养中温度温度、光照光照、湿度湿度等各种环境条件，等各种环境条件，培养培养基组成基组成、pHpH值值、渗透压渗透压等各种化学环境条件都会等各种化学环境条件都会影响组织影响组织培养条件的选择85一一. .光照的影响光照的影响 培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光周期等

69、方面：强、光质、以及光周期等方面： 光周期：黑暗与光照交替的时间光周期：黑暗与光照交替的时间 光光 量：光照强度量：光照强度 光光 质：光的波长质：光的波长86例例1 1：黑暗中培养的烟草花药，其胚状体的分化与幼植物的：黑暗中培养的烟草花药，其胚状体的分化与幼植物的 生长，同经光照培养一样的多生长，同经光照培养一样的多例例2 2：短日照敏感的葡萄品种，它的茎切段，仅在短日照条：短日照敏感的葡萄品种，它的茎切段，仅在短日照条 件下才能分化成根件下才能分化成根例例3 3：对日照不敏感的葡萄品种，可在任何光周期下分化成：对日照不敏感的葡萄品种，可在任何光周期下分化成 根根结论：结论：光周期的需要与否

70、，应根据植物种类、培养的目的来光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定决定1 1、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应87最常用的周期是最常用的周期是16h16h的光照，的光照，8h8h的黑暗。的黑暗。 愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照，多数植物适合全暗或周期性光照， 器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。离体培养中光周期的调节

71、离体培养中光周期的调节88光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。弱幼苗容易徒长。离体培养条件下常用的光量，一般为离体培养条件下常用的光量，一般为1000-4000lx1000-4000lx（勒克斯）（勒克斯）。离体培养中通常难以达到。离体培养中通常难以达到4000lx4000lx，一般

72、光量在，一般光量在2000-2000-3000lx3000lx。光照强度的高低直接影响器官分化的频率。光照强度的高低直接影响器官分化的频率 高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生长素素水平较高，容易生根长素素水平较高，容易生根2 2、光量的影响、光量的影响89p光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在化都有明显的影响。如百合珠芽在红光红光下培养，下培养，2 2周后，周后，分化出愈伤组织。但在分化出愈伤组织。但在蓝光蓝光下培养，几周后才出现愈伤下培养

73、，几周后才出现愈伤组织，组织，离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，对芽分化有离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，对芽分化有效光谱成分为蓝紫光，根分化则受效光谱成分为蓝紫光，根分化则受600-680nm600-680nm所刺激。所刺激。3 3、光质的影响、光质的影响90二二. .温度的影响温度的影响培养都是在培养都是在23232727之间进行，一般采用之间进行，一般采用252522。 喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温度一般控制在度一般控制在26-28 26-28 冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常

74、培养温度控制在常培养温度控制在18-22 18-22 或或25 25 91三三. .湿度的影响湿度的影响组织培养中湿度的影响有两个方面：组织培养中湿度的影响有两个方面： 一是培养容器内的湿度条件，容器内主要受一是培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。培养基水分含量和封口材料的影响。 一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要求要求707080%80%。常用加湿器或经常洒水的方法来。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。调节湿度。 92四四.pH.pH值值不同的植物对培养基最适不同的植物对培养基最适pHpH值的要求也是不同的，值的要

75、求也是不同的，大多在大多在5.5-6.55.5-6.5左右，一般培养基皆要求左右，一般培养基皆要求5.85.8，这，这基本能适应大多数植物培养的需要。基本能适应大多数植物培养的需要。 93种类种类最适最适PH值值种类种类最适最适PH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越橘越橘4.5胡萝卜、石刁柏胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄、葡萄番茄、葡萄5.7五五. .渗透压渗透压 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因而影响到渗透压的变化。通常因而影响到渗透压的变化。通常1-21-2个大气压对植个大气压对植物生长有促进作用，物生长有促进作用，2 2

76、个大气压以上就对植物生长个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而有阻碍作用，而5-65-6个大气压植物生长就会完全停个大气压植物生长就会完全停止，止，6 6个大气压植物细胞就不能生存个大气压植物细胞就不能生存94 培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着手。糖除了作为渗透压调节物质外，还是培养基手。糖除了作为渗透压调节物质外，还是培养基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作为调节物质。可以作为调节物质。渗透压调节物质95 氧气

77、氧气是培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通是培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液污染。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。考虑容器的类型、培养基等。 六六. .气体气体969711.2.4 种质保存种质保存n 超低温保存植物材料的原理与保存动物材料

78、相同。超低温保存植物材料的原理与保存动物材料相同。在在-196的超低温条件下，活细胞内的物质代谢和的超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止。因此，细胞、组织、器官生命活动几乎完全停止。因此，细胞、组织、器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能不会丢失形态发生的潜能。n 在降温冷冻过程中，如果细胞内的水发生结冰，也在降温冷冻过程中，如果细胞内的水发生结冰，也会造成植物细胞结构不可逆性的破坏而死亡。因此，会造成植物细胞结构不可逆性的破坏而死亡。因此，种质超低温保存成功的种质超低温保存成功的关键是在于降温冷冻过

79、程避关键是在于降温冷冻过程避免细胞内结冻免细胞内结冻。需使用。需使用冷冻保存剂冷冻保存剂，选择合适的降，选择合适的降温冷冻速度和化冻方式。温冷冻速度和化冻方式。981.超低温保存方法超低温保存方法（1）材料的选择）材料的选择 对组织培养的材料，在保存前要对其加速传代，以提高对组织培养的材料，在保存前要对其加速传代，以提高分裂细胞的比例。分裂细胞的比例。（2）预处理）预处理 加入预冷的保护剂（加入预冷的保护剂（0），处理），处理20-60min，提高细胞抗，提高细胞抗寒力。寒力。（3）降温冰冻）降温冰冻 四种方法：四种方法：1.快速冷冻快速冷冻2.慢速冷冻慢速冷冻3.预冻预冻4.逐级降温逐级降温

80、（4）采用迅速解冻法。）采用迅速解冻法。30-40 。（5）活力测定）活力测定 TTC或或FDA染色法测定细胞活力和存活率。染色法测定细胞活力和存活率。（6）再培养）再培养 根据植物种类，提供和满足原来培养条件进行培养，使根据植物种类，提供和满足原来培养条件进行培养，使细胞恢复分裂能力，诱导器官分化和植株再生。细胞恢复分裂能力，诱导器官分化和植株再生。991002.超低温保存的意义超低温保存的意义（1）能保持细胞培养物的稳定性。）能保持细胞培养物的稳定性。（2）长期保存植物种质资源。）长期保存植物种质资源。（3）长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的）长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质。种质。101http:/