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1、实验五实验五 猪瘟的间接免疫荧光实验猪瘟的间接免疫荧光实验龙岩学院生命科学学院龙岩学院生命科学学院2021.5.25一、实验目的：了解和掌握猪瘟的临床诊断方法和实验室诊断方法间接免疫荧光法。荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术直接法-荧光素标志Ab直接检测间接法-荧光素标志二抗补体结合法-荧光素标志抗补体Ab双结合法-两种荧光素标志Ab二、实验原理：固定在载片上的待检病变组织与适当稀释的猪瘟阳性血清反响后，假设待检组织中有猪瘟病毒抗原就会与猪瘟阳性血清中的抗体特异性结合，参与FITC(异硫氰酸荧光素)标志的的兔抗猪IgG二抗又可与猪瘟阳性抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见呈现绿色荧光。 可以可以产
2、产生明生明显荧显荧光并能光并能作作为为染料运用的有机化染料运用的有机化合物称合物称为荧为荧光色素或光色素或荧荧光染料。用于光染料。用于标标志抗体志抗体的的荧荧光色素，必需具有光色素，必需具有化学上的活性基因，能化学上的活性基因，能与蛋白与蛋白质稳质稳定定结结合，且合，且不影响不影响标标志抗体的生物志抗体的生物活性及抗原抗体的特异活性及抗原抗体的特异性性结结合。合。异硫异硫氰酸酸荧光素光素(FITC) 荧光二抗荧光二抗荧光素及其激发波长和发射波长荧光素及其激发波长和发射波长三、试剂与仪器：1.猪瘟病料、抗原片、FITC荧光标志的兔抗猪二抗、PBS缓冲液、猪瘟规范阴、阳性血清、封片介质:磷酸盐缓冲
3、甘油、盖玻片、滤纸2.荧光显微镜、摇床、移液器、吸管等生物薄片生物薄片生生物物薄薄片片马马赛赛克克：将将包包被被有有不不同同基基质质的的生生物物薄薄片片固固定定在在一一个个载载片片反响区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。反响区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。荧光显微镜：荧光显微镜：四、IIF操作步骤：预备：取病猪的扁桃体，淋巴：取病猪的扁桃体，淋巴结、脾或其他、脾或其他组织一小一小片，用片，用滤纸吸去外面的液体。用笔吸去外面的液体。用笔编号、号、标志。志。触片：取干触片：取干净载玻片一玻片一块，稍，稍为烘烘热，将，将组织小片的小片的切面触切面触压玻片，略加玻片，略加转动，
4、作成，作成压印置室温内枯燥。或印置室温内枯燥。或用所采的病理用所采的病理组织，做成切片。，做成切片。固定：滴加冷丙固定：滴加冷丙酮数滴，置数滴，置20固定固定15一一20分。分。清洗：用清洗：用PBSpH7.2洗洗涤3次，每次次，每次5 min，阴干。，阴干。第一次温育：滴加第一次温育：滴加25ul稀稀释后的血清覆盖触片后的血清覆盖触片样品，防止品，防止产生气泡。滴加完一切待生气泡。滴加完一切待测标本后才开本后才开场室温温育室温温育30分分钟。 四、IIF操作步骤：6清洗：用磷清洗：用磷PBS冲洗冲洗载片留意水流不要太急，不片留意水流不要太急，不要直接要直接对着触片着触片组织冲，然后立刻将其浸
5、入装有磷冲，然后立刻将其浸入装有磷酸酸盐缓冲液的平皿中浸洗冲液的平皿中浸洗3次，每次次，每次5分分钟。7第二次温育：滴上第二次温育：滴上标志志荧光抗体光抗体30ul，置，置37饱和湿度箱内和湿度箱内处置置1030分分钟。8清洗：用清洗：用pH7.2的的PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次510分分钟。 9封封锁：干后，滴上甘油：干后，滴上甘油缓冲液数滴，加盖玻片封冲液数滴，加盖玻片封锁，用用荧光光显微微镜检查。10结果判果判别：如：如细胞胞胞胞浆内有弥散性、絮状或点状的内有弥散性、絮状或点状的亮黄亮黄绿色色荧光，光，为猪瘟，如猪瘟，如仅见喑喑绿或灰或灰蓝那么不是那么不是猪瘟。猪瘟。对照照实验用知猪瘟病毒用知猪瘟病毒资料料压印片先用抗猪瘟印片先用抗猪瘟血清血清处置，然后用猪瘟置，然后用猪瘟荧光抗体光抗体处如上如上检查，应不出不出现猪瘟病毒感染的特异猪瘟病毒感染的特异荧光。光。五.本卷须知:1触片要求均匀。2每次实验应该设阳性和阴性对照。3 应留意荧光抗体的质量。4. 标本应及时检测，并避光保管。
