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1、努力学习，无论做什么都要尽努力学习，无论做什么都要尽你所能尽力而为。你所能尽力而为。Study hard and whatever you do , do it as well as you possible can. 卡尔卡尔韦曼韦曼 Carl Wieman 2001年诺贝尔物理学奖获得者年诺贝尔物理学奖获得者植物细胞工程植物细胞工程主讲教师：邵景侠主讲教师：邵景侠TEL：13772546610E-mail：shaojingxia_目录绪论（绪论（2h)第一章第一章 植物细胞工程实验室及基本操作技术（植物细胞工程实验室及基本操作技术（2h）第二章第二章 植物细胞工程原理概述植物细胞工程原理概
2、述(4h)第三章第三章 植物离体快繁技术和脱毒培养技术植物离体快繁技术和脱毒培养技术(4h)第四章第四章 植物细胞培养与有用物质生产植物细胞培养与有用物质生产 (2h)第五章第五章 植物体细胞无性系变异与突变体筛选植物体细胞无性系变异与突变体筛选(2h)第六章第六章 植物离体单倍体诱导技术及应用植物离体单倍体诱导技术及应用 (2h)第七章第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交植物原生质体培养与体细胞杂交(2h)第八章第八章 植物胚胎培养技术及其应用植物胚胎培养技术及其应用(2h)第九章第九章 植物种质资源的离体保存植物种质资源的离体保存(1h)第十章第十章 植物的遗传转化植物的遗传转化 (1h)
3、第三章植物离体快繁和脱毒培养技术第三章植物离体快繁和脱毒培养技术植物离体快速繁殖技术Rapid MultiplicationRapid Multiplication植物的脱毒培养技术植物的脱毒培养技术第一节、植物离体快速繁殖技术第一节、植物离体快速繁殖技术一、离体快速无性繁殖的概念及其意义一、离体快速无性繁殖的概念及其意义二、植物离体快速无性繁殖的特点二、植物离体快速无性繁殖的特点三、离体快速无性繁殖中器官的发生形式三、离体快速无性繁殖中器官的发生形式四、离体无性繁殖的程序四、离体无性繁殖的程序五、植物组织培养中应注意的几个问题五、植物组织培养中应注意的几个问题有性繁殖有性繁殖无性繁殖无性繁殖
4、无融合生殖无融合生殖营养繁殖营养繁殖繁殖繁殖方式方式一、植物离体快速无性繁殖的概一、植物离体快速无性繁殖的概念及其意义念及其意义1 1 概念概念 离体无性繁殖离体无性繁殖：指利用组织培养的方法进行植：指利用组织培养的方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致的个体的方法，又称的个体的方法，又称“ “离体繁殖，快速无性繁离体繁殖，快速无性繁殖、微型繁殖殖、微型繁殖” ”。试管苗：试管苗：由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。无性系：无性系：指有同一个体通过无性繁殖产生的一个指有同一个体通过无性繁殖产生的一个群体，它们的
5、遗传背景基本一致。群体，它们的遗传背景基本一致。2 2 应用应用（1）用来加速难繁殖和繁殖速度慢的植物的繁用来加速难繁殖和繁殖速度慢的植物的繁殖。殖。（2 2）无病毒苗木的繁殖。）无病毒苗木的繁殖。（3 3）用于某些杂合园艺植物的繁殖。）用于某些杂合园艺植物的繁殖。（4 4）用于需要加速繁殖的特殊基因型。）用于需要加速繁殖的特殊基因型。二、植物离体快速无性繁殖的特点二、植物离体快速无性繁殖的特点1 1 优点优点（1 1）首先体现在一个）首先体现在一个“ “快快” ”字上。字上。（2 2）可人为控制条件，不受大自然的干扰）可人为控制条件，不受大自然的干扰（3 3）快速培养脱毒苗。）快速培养脱毒苗
6、。2局限性（1 1）一些植物快速无性繁殖技术的某些环）一些植物快速无性繁殖技术的某些环节还没有突破。节还没有突破。（2 2）要对其成本、技术等进行估算。）要对其成本、技术等进行估算。（3 3）随继代次数增多，培养材料的分化能）随继代次数增多，培养材料的分化能力下降。力下降。国内外植物离体快繁概况国内外植物离体快繁概况(1)欧洲微繁情况欧洲微繁情况植物组织培养室植物组织培养室650650多多个个主产品为花卉、果树主产品为花卉、果树微微繁繁数数量量最最大大国国家家：荷荷兰兰、法法国国、意意大大利利、比比利时、英国。利时、英国。（2 2）美洲美洲微繁实验室微繁实验室200200多个，多个，1.571
7、.57亿株亿株/ /年年主要产品为香蕉、草莓、马铃薯脱毒种苗种薯。主要产品为香蕉、草莓、马铃薯脱毒种苗种薯。（3 3）亚洲亚洲共有商业性实验室共有商业性实验室270270多多个个试管苗试管苗65006500万株万株90009000万株万株/ /年年兰花、温带花卉、果树、农作物无性繁殖。兰花、温带花卉、果树、农作物无性繁殖。国内外植物离体快繁概况（4 4）大洋洲大洋洲8888个实验室个实验室20002000万试管苗万试管苗/ /年年果树、农作物、林木、观赏植物果树、农作物、林木、观赏植物（5 5）非洲非洲4242个商业性组织培养室个商业性组织培养室80%80%微型繁殖，微型繁殖，1.4101.4
8、106 6株试管苗株试管苗/ /年年农作物、马铃薯、木薯、甘蔗、香蕉农作物、马铃薯、木薯、甘蔗、香蕉国内外植物离体快繁概况国内基本情况国内基本情况 组组培培快快繁繁种种类类：木木本本150150种种；花花卉卉139139种种；药药用用5353种种；园园艺艺（果果蔬蔬）2929种种；禾禾谷谷类类4444种种；草草本本水水果果9 9种种，共共计计445445种。种。国内外植物离体快繁概况发达国家：商业快繁，观赏植物，果树发达国家：商业快繁，观赏植物，果树发展中国家：育种研究，无性繁殖农作物发展中国家：育种研究，无性繁殖农作物三、离体无性繁殖中器官的发生形式1 不定芽型（不定芽型（Adventiti
9、ous bud typeAdventitious bud type）器官型（器官型（Organ typeOrgan type）器官发生型（器官发生型（OraneogenesisOraneogenesis）类胚体发生型（类胚体发生型（EmbryogenesisEmbryogenesis）原球茎型（原球茎型（ProtocormProtocorm）1 不定芽型不定芽：不定芽：凡是叶腋或茎间以外任何其它地凡是叶腋或茎间以外任何其它地方形成的芽都称不定芽。方形成的芽都称不定芽。外植体：外植体：要有明显顶端分生组织和次生分要有明显顶端分生组织和次生分生组织的植物均适用。生组织的植物均适用。特点：特点：以芽
10、繁芽，繁殖速度快；后代遗传以芽繁芽，繁殖速度快；后代遗传性比较稳定。（性比较稳定。（图图）器官型器官型外植体：充分发育，生长旺盛的器官，外植体：充分发育，生长旺盛的器官，如茎段、叶、花器、鳞片等。如茎段、叶、花器、鳞片等。特点：直接从器官上诱导不定芽，遗特点：直接从器官上诱导不定芽，遗传性比较稳定，但繁殖速度慢。传性比较稳定，但繁殖速度慢。器官发生型器官发生型外植体外植体：生长幼嫩的材料，使其来源：生长幼嫩的材料，使其来源尽量一致，旺盛、新鲜的组织或器尽量一致，旺盛、新鲜的组织或器官。官。特点特点：繁殖速度快，但遗传性不稳定。：繁殖速度快，但遗传性不稳定。类胚体发生型类胚体发生型 即胚状体途径
11、，即胚状体途径，由植物细胞、组由植物细胞、组织或器官直接诱导发生胚状体结构，织或器官直接诱导发生胚状体结构，最终发育成苗的方式。最终发育成苗的方式。特点：特点：遗传性稳定，但繁殖数量不如遗传性稳定，但繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多。不定芽型和器官发生型多。从胡萝卜细胞培养产生胚状体和从胡萝卜细胞培养产生胚状体和 小植株开花结实的过程小植株开花结实的过程用打孔器从胡萝卜块根上取得盘状外植体外植体置于25下转动培养由外植体分离出的细胞增殖并发育为胚状体胚状体移于琼脂培养基上并长成植株和开花结实原球茎型原球茎型兰花特有的原球茎发生型，通过诱兰花特有的原球茎发生型，通过诱导原球茎直接长成植株。导原
12、球茎直接长成植株。图：兰花原球茎发生型图：兰花原球茎发生型图：兰花的微繁技术图：兰花的微繁技术兰花的萌发兰花的启动兰花的增殖兰花的分化培养的兰花四四 、离体无性繁殖的程序、离体无性繁殖的程序无菌母株的制备无菌母株的制备茎芽的增殖茎芽的增殖诱导生根诱导生根炼苗炼苗再生植株的鉴定再生植株的鉴定无菌母株的制备（）无菌母株的概念（）无菌母株的概念无菌母株无菌母株：在无菌条件下，用于：在无菌条件下，用于试管内继代增殖的植物材料，称为试管内继代增殖的植物材料，称为“ “无菌母株无菌母株” ”或或“ “繁殖母株繁殖母株” ”。（）无菌培养物的建立（）无菌培养物的建立外植体的制备（外植体的制备（选择、清洗、消
13、毒、灭菌选择、清洗、消毒、灭菌）培养基的选择培养基的选择基本培养基无机营养水有机营养大量元素微量元素碳源氨基酸维生素附加成分植物激素生长素：IAA、IBA、NAA2，4-D细胞分裂素：ZT、KT、BA琼脂、聚蔗糖等天然有机复合物水解酪蛋白椰子乳汁马铃薯汁其它成分：AV、PVP、NaCl、完全培养基按培养基的用途分为：按培养基的用途分为：基本培养基基本培养基诱导培养基诱导培养基继代培养基继代培养基分化培养基分化培养基生根培养基生根培养基壮苗培养基壮苗培养基按照培养基的物理状态分为按照培养基的物理状态分为：固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基附加培养基附加培养基单因子实
14、验：第一组： 1-1 MS+BA0.0+NAA0.1 1-2 MS+BA0.1+NAA0.1 1-3 MS+BA0.2+NAA0.1第二组： 2-1 MS+BA0.1+NAA0.1 2-2 MS+BA0.1+NAA0.2 2-3 MS+BA0.1+NAA0.3 .茎芽的增殖（）通过不定芽的形成增殖（）通过腋芽的形成增殖（图） 蝴蝶兰花梗腋芽组织取芽法动画（）通过单节茎段扦插增殖（图）繁殖速率的计算 ：Y=mXnY：年繁殖数年繁殖数M M：无菌母株数：无菌母株数X X：每个培养周期增殖的倍数：每个培养周期增殖的倍数N N：全年可增殖的周期次数：全年可增殖的周期次数生根培养生根培养（）试管内生根（
15、）试管内生根（）试管外生根（）试管外生根 基质生根法基质生根法 嫁接生根法嫁接生根法（）试管内生根（）试管内生根 培养基内诱导生根的方法。培养基内诱导生根的方法。调节激素种类和浓度调节激素种类和浓度调节基本培养基的组成调节基本培养基的组成（1/21/2、1/4MS1/4MS）调节渗透压调节渗透压（降低糖浓度）（降低糖浓度）调节激素种类和浓度多数植物根分化需适当提高生长素水平，减低多数植物根分化需适当提高生长素水平，减低细胞分裂素水平。细胞分裂素水平。有些植物在仅含生长素的培养基中即可诱导根有些植物在仅含生长素的培养基中即可诱导根分化。分化。（如菊花在附加（如菊花在附加0.1-.3mg/LNAA
16、0.1-.3mg/LNAA培养基中，一周培养基中，一周即可生根，生根率达即可生根，生根率达100%100%。）。）一些禾本科植物，在无激素条件下即可生根。一些禾本科植物，在无激素条件下即可生根。（）试管外生根基质生根法：基质生根法： 把离体条件形成的无根小植株适当处理把离体条件形成的无根小植株适当处理后，使其在基质中（后，使其在基质中（蛭石、珍珠岩、土、沙子、蛭石、珍珠岩、土、沙子、泥炭等泥炭等）生长（）生长（灭菌灭菌）。）。嫁接生根法： 将无根小植株嫁接到砧木上，利用砧将无根小植株嫁接到砧木上，利用砧木的根系吸收养分和水分。木的根系吸收养分和水分。 试管内嫁接试管内嫁接 试管外嫁接试管外嫁接
17、移栽（炼苗）移栽（炼苗）（）试管苗的特点（）试管苗的特点根的特点根的特点叶的特点叶的特点组织的特点组织的特点根的特点 根系生长不好，没有根毛或根毛很根系生长不好，没有根毛或根毛很少，吸水力差，难以满足小苗蒸腾作用少，吸水力差，难以满足小苗蒸腾作用的消耗，小苗体内的水分难以达到平衡。的消耗，小苗体内的水分难以达到平衡。叶的特点 在高湿、弱光和异养条件下分化生长在高湿、弱光和异养条件下分化生长的叶，叶表皮保护组织不发达，甚至没的叶，叶表皮保护组织不发达，甚至没有。无角质层、蜡质层，使叶片表面缺有。无角质层、蜡质层，使叶片表面缺乏保护，易失水萎焉。乏保护，易失水萎焉。组织的特点 试管苗组织幼嫩，结构
18、松散，细胞试管苗组织幼嫩，结构松散，细胞含水量大，机械组织不发达，容易发生含水量大，机械组织不发达，容易发生机械损伤，对病虫害特别敏感机械损伤，对病虫害特别敏感。1.形形态解剖方面解剖方面 （1）根）根（2）叶）叶试管苗的特点（弱点）管苗的特点（弱点）叶的角叶的角质和蜡和蜡质层不不发达，容易蒸达，容易蒸腾失水。失水。 无表皮毛，保水和反光能力差。无表皮毛，保水和反光能力差。 叶叶细胞胞结构疏松。构疏松。 叶气孔突出，叶气孔突出，张大。大。 叶存在排水孔。叶存在排水孔。 （无根毛无根毛 根与根与苗苗输导不相不相连。）根的生理功能：低根的生理功能：低 叶片表面极易散失水分叶片表面极易散失水分 气孔
19、不能关气孔不能关闭 叶光和能力叶光和能力较低，低，CO2固定能力差。固定能力差。2. 生理功能方面生理功能方面茎尖、腋芽花药单细胞原生质体愈伤组织胚状体芽分化完整再生植株再生植株驯化定植苗组织培养过程中组织培养过程中4个阶段个阶段异养阶段异养阶段半自养阶段半自养阶段 半自养半自养-自养阶段自养阶段自养阶段自养阶段（）炼苗（）炼苗瓶炼瓶炼盘炼（试管苗的出瓶移栽）盘炼（试管苗的出瓶移栽）容器移栽容器移栽大田移栽大田移栽在全自动培养间进行光照培养 试管苗移栽于温室n生根方法生根方法试管内生根（培养基）试管内生根（培养基）试管外生根试管外生根影响试管内生根的因素影响试管内生根的因素植物材料植物材料 培
20、养基培养基 植物激素植物激素 营养元素营养元素 其它物质（核黄素、活性碳）其它物质（核黄素、活性碳） 培养条件培养条件 光照光照 pH pH 温度温度无无菌菌 异异养养 高高温温 弱弱光光 恒恒温温试管苗的生管苗的生长环境境克服克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施管苗弱点，提高其移栽成活率的措施（1）移栽要抓三个关移栽要抓三个关键 水分的平衡（不要失水水分的平衡（不要失水过多）多） 温度和光照（不能太高）温度和光照（不能太高） 光和能力逐步形成或加光和能力逐步形成或加强 （2 2）提高移栽成活率的技）提高移栽成活率的技术措施措施 移栽前的工作移栽前的工作 移栽移栽时应注意的注意的问题（1 1
21、）培养瓶生壮苗）培养瓶生壮苗移栽前的工作移栽前的工作-1加入生加入生长控制控制剂，如多效，如多效唑， B9， CCC，其作用，其作用是使苗粗壮，叶是使苗粗壮，叶绿素增加。素增加。（2）炼苗将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为1030D。移栽前的工作移栽前的工作-2移栽移栽时应注意的注意的问题（1 1）防止菌）防止菌类滋生滋生 苗底部培养基要洗干苗底部培养基要洗干净 杀菌菌剂处理苗的根部理苗的根部 定定时用用杀菌菌剂处理种植基理种植基质 常用常用杀菌菌剂：KMnO4,百菌清、多菌百菌清、多菌灵、托不津，使用灵、托不津，使用浓度度0.1
22、移栽移栽时应注意的注意的问题（2）保持小苗水分供）保持小苗水分供给平衡平衡(3)(3)移栽移栽时选择合理的种植基合理的种植基质基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭。移栽移栽时应注意的注意的问题泥炭珍珠岩椰糠移栽移栽时应注意的注意的问题 一般一般强度度较高的慢高的慢射光射光较好好(4)(4)注意一定光照，温度条件注意一定光照，温度条件试管苗的鉴定试管苗的鉴定（）形态学鉴定（）形态学鉴定（）细胞学鉴定（）细胞学鉴定五、植物组织培养中应注意的问题褐变（褐化）褐变（褐化）污染污染玻璃化玻璃化褐变褐变（）褐变（）褐变褐变褐变：指在组织培养过程中
23、，由培养：指在组织培养过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。慢变褐而死亡的现象。褐变现象 褐变原因n有的植物材料在接种后材料的表有的植物材料在接种后材料的表面出现褐色物质甚至培养基也呈面出现褐色物质甚至培养基也呈褐色的现象，褐色会严重影响外褐色的现象，褐色会严重影响外植体的生长分化，成为植物组织植体的生长分化，成为植物组织培养的一大障碍。培养的一大障碍。（组织中的多酚氧化中的多酚氧化酶被激活，使酚被激活，使酚类物物质被被氧化生氧化生产生棕褐色生棕褐色醌类物物质而引
24、起褐而引起褐变。）褐褐变影响因素影响因素基因型基因型 材料的生理状材料的生理状态 培养培养时间（）克服褐变的方法（）克服褐变的方法选择适宜的外植体选择适宜的外植体（幼嫩材料、春季（幼嫩材料、春季取材）取材）改善营养条件改善营养条件（连续培养）（连续培养）在培养基中加入一些附加物在培养基中加入一些附加物活性炭活性炭抗氧化剂抗氧化剂（聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮）（牛血清蛋白）（牛血清蛋白）褐褐变的防止的防止n三个选择分生能力分生能力强的外植体的外植体 合适的无机合适的无机盐成分成分浓度、合适的蔗糖度、合适的蔗糖浓度和度和 激素水平激素水平 适宜的温度适宜的温度 n两个加入 （活性碳、抗氧化（活
25、性碳、抗氧化剂）n一个连续 （连续将材料将材料进行行转移）移）污染污染细菌污染细菌污染真菌污染真菌污染污染细菌污染的特点细菌污染的特点 在培养材料附近出现黏液状菌斑，一般接种1-2天一5可发现。特别应注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌，外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死，可随培养材料、用具传播，可出现在培养基表面，也可呈滴形云雾状存在于培养基内，发现及时淘汰，并对用过的器具严格高温灭菌。真菌污染的特点真菌污染的特点培养基上长霉，一般接种3-5天就可先，霉的颜色有黑、白、黄等，真菌污染的特点是污染部分有不同颜色的霉菌，接种3天，有时多达10天才能表现。（）克服方法外植体灭菌不彻底外
26、植体灭菌不彻底培养基及各种器具清洁灭菌不彻底培养基及各种器具清洁灭菌不彻底人为因素人为因素超净工作区被污染超净工作区被污染环境不清洁环境不清洁细菌菌污染染表表现： 发酵状酵状 水水渍状状 滴形云滴形云雾状状污染原因：染原因： 培养基灭菌不过关 接种器具污染 操作污染 交叉污染真菌真菌污染染表表现： 灰、白、黄、绿菌丝体、孢子组成绒毛状物有色圈污染原因染原因： 培养室湿度过大 瓶口积落有灰尘和孢子。材料内部材料内部带菌菌在培养基中表现的症状 外植体接触培养基部位长菌 外植体损伤部位长菌 外植体生长不良或表现出缺绿诊断 培养基添加有机物检测人人为因素（工作人因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、
27、酒精擦手。本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培养皿：洗培养皿：洗热压 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干干热（干（干热箱）或晾干箱）或晾干 接种用具：用接种用具：用CCL4布擦布擦湿布擦湿布擦 泡泡75%95%酒精酒精烧培养基：湿培养基：湿热培培养养材材料料外部外部细菌：用水冲洗菌：用水冲洗化学化学药剂处理理 内部内部细菌菌 茎尖培养茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超酒精擦超净工作台工作台 用化学用化学试剂薰蒸（甲薰蒸（甲醛或者甲或者甲醛： 高高锰酸酸钾=10:1)污染来源染来源作好接种
28、前准作好接种前准备接种室的接种室的灭菌菌超超净工作台的工作台的灭菌菌接种器皿、用具的接种器皿、用具的灭菌菌工作人工作人员接种前接种前应做的准做的准备工作工作材料的材料的灭菌菌1. 1.接种室的接种室的灭菌菌接种室的地面，墙壁要擦洗干净 接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2接种室还可以采用紫外灯灭菌作好接种前准作好接种前准备2. 2.超超净工作台的工作台的灭菌菌开风机前将紫外灯打开30分钟以上 之后开风机15分钟 用95%酒精洗工作台面作好接种前准作好接种前准备3. 3.接种器皿、用具的接种器皿、用具的灭菌菌用具先用95%酒精浸泡，后于酒精灯外焰灼烧作好接种前准作好接种前准备4. 4.工作人工作人
29、员接种前接种前应做的准做的准备工作工作个人卫生，穿工作服 用70%酒精擦手作好接种前准作好接种前准备q一个典型的材料灭菌流程 q常用灭菌剂 q灭菌关键性问题 5. 5.材料材料处理理灭菌菌作好接种前准作好接种前准备适当的搭配 适当的浓度 适当的时间一个典型的一个典型的灭菌流程菌流程材料的预处理(剪切、清洗)75%酒精(20s)0.1%升汞(15min)无菌水冲洗（6次）沥干接种注意接种操作注意接种操作防止空气污染防止空气污染防止空气污染防止操作带来的污染防止器皿用具污染防止空气防止空气污染染接种接种时在近火焰在近火焰处打开瓶口，使瓶打开瓶口，使瓶倾斜，以免空斜，以免空气中微生物落入瓶中气中微生
30、物落入瓶中正正 确确 错 误防止操作防止操作带来的来的污染染-A整个接种操作整个接种操作应在近火焰在近火焰处进行，且行，且动作要迅速作要迅速正正 确确 错 误接种接种过程中尽可能达到程中尽可能达到悬空要求空要求防止操作防止操作带来的来的污染染-B正正 确确 错 误接种接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口不得用手接触瓶盖内壁或瓶口防止操作防止操作带来的来的污染染-C正正 确确 错 误瓶盖朝上放，接种完瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口后立即盖好瓶口防止操作防止操作带来的来的污染染-D正正 确确 错 误防止器皿用具防止器皿用具污染染接种完一瓶用火接种完一瓶用火烧用具以防止交叉用具以防止交叉污染染产生生
31、玻璃化（）玻璃化（）玻璃化玻璃化玻璃化：是试管苗的一种生理失调症状，：是试管苗的一种生理失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的茎、叶往往会出现半透明状和水渍物的茎、叶往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。状，这种现象称为玻璃化。（）克服方法（）克服方法增加固体琼脂浓度，使细胞吸水受到阻增加固体琼脂浓度，使细胞吸水受到阻碍。碍。提高培养基中的、比。提高培养基中的、比。控制温度，增加自然光照。控制温度，增加自然光照。附加一些物质附加一些物质活性炭活性炭乙烯乙烯青霉素青霉素玻璃化问题玻璃化问题产生的主要原因产生的主要原因克服玻璃化现象的措施：克服
32、玻璃化现象的措施： 继代培养的关键技术继代培养的关键技术-1（水分太多，植物内具有过多的游离水引起水分太多，植物内具有过多的游离水引起）两个两个“增加增加”两个两个“增强增强” 两个两个“加入加入” 一个一个“减少减少”两个两个“ “增加增加” ”：增加：增加琼脂脂浓度；增加蔗糖含量；度；增加蔗糖含量； 两个两个“ “增增强” ”：增：增强溶器通溶器通风；增；增强光照；光照； 两个两个“ “加入加入” ”：加入渗透：加入渗透剂；加入；加入ABAABA； 一个一个“ “减少减少” ”：减少培养基氮含量：减少培养基氮含量第二节、植物的脱毒技术第二节、植物的脱毒技术病毒的特性及其侵染病毒的特性及其侵
33、染脱毒的方法脱毒的方法茎尖培养脱除病毒的程序茎尖培养脱除病毒的程序一、病毒的特性及其侵染特性特性侵染途径侵染途径分布特点分布特点 病毒是专性病毒是专性细胞内寄生物，大小细胞内寄生物，大小在在2020200 nm200 nm之间。之间。含有含有RNARNA或或DNADNA，外包，外包一个蛋白衣壳，衣壳一个蛋白衣壳，衣壳外有包膜。完整组装外有包膜。完整组装的病毒称为病毒粒子。的病毒称为病毒粒子。病毒对抗生素不敏感。病毒对抗生素不敏感。Virus 对植物病毒的研究是从对植物病毒的研究是从19世纪世纪后期才后期才正式开始的。正式开始的。1886年年，德国麦尔（，德国麦尔（Adolf Mayer)首先描
34、述了烟草花叶病毒（首先描述了烟草花叶病毒（TMV)，1935年年，TMV被结晶，也是第一个在电子显被结晶，也是第一个在电子显微镜下被观察的病毒。现在，经过微镜下被观察的病毒。现在，经过ICTV（国（国际病毒分类委员会）分类的植物病毒大约有际病毒分类委员会）分类的植物病毒大约有1000多种。多种。 世界上的病毒对于所有的植物的影响是十分巨世界上的病毒对于所有的植物的影响是十分巨大的，据估计每年由于病毒的感染而损失的金额达大的，据估计每年由于病毒的感染而损失的金额达700亿美元亿美元,农作物的损失达到农作物的损失达到200亿美元亿美元。几乎所有。几乎所有农作物都会受到一种或一种以上的病毒侵染，会减
35、农作物都会受到一种或一种以上的病毒侵染，会减少作物的产量和（或）品质。当用特定的无毒植株少作物的产量和（或）品质。当用特定的无毒植株取代了被病毒侵染的母株后，产量平均增加取代了被病毒侵染的母株后，产量平均增加30%。现在，还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的现在，还没有什么药物处理可以治愈受病毒侵染的植物。植物。植物病毒对无性繁殖的植物危害更大，植物病毒对无性繁殖的植物危害更大，病毒可以通过营养繁殖传递到下一代。病毒可以通过营养繁殖传递到下一代。病毒侵染后植物的症状病毒侵染后植物的症状 外部症状外部症状 植株矮小，叶片植株矮小，叶片 变小、叶间距及叶片数目减少，变小、叶间距及叶片数目减少，果
36、实和种子变小。出现花叶（如班驳、明脉、及绿果实和种子变小。出现花叶（如班驳、明脉、及绿岛）和叶片皱缩。一些病毒会引起叶片黄化、环斑岛）和叶片皱缩。一些病毒会引起叶片黄化、环斑或蚀纹症状。组织、器官或整个植物坏死，或发育或蚀纹症状。组织、器官或整个植物坏死，或发育不良，出现畸型。不良，出现畸型。 细胞学变化细胞学变化 小液泡出现，细胞器退化，叶绿体、线粒体聚集，小液泡出现，细胞器退化，叶绿体、线粒体聚集，细胞壁加厚、从胞间连丝进入细胞、含有细胞壁加厚、从胞间连丝进入细胞、含有12个微管，个微管，细胞壁之间出现沉淀物，细胞内出现风轮状内含体。细胞壁之间出现沉淀物，细胞内出现风轮状内含体。病毒的特性
37、（）病毒的结构非简单，仅由蛋白质和核酸组成，无（）病毒的结构非简单，仅由蛋白质和核酸组成，无细胞结构，且核酸仅为或细胞结构，且核酸仅为或RNARNA。（）病毒不能进行独立的代谢活动，也缺乏自身的核（）病毒不能进行独立的代谢活动，也缺乏自身的核糖体，必须依靠寄主来合成蛋白质。糖体，必须依靠寄主来合成蛋白质。（）病毒有核酸，因此能利用寄主的细胞进行复制。（）病毒有核酸，因此能利用寄主的细胞进行复制。（）具有侵染力，能够将核酸从一种寄主细胞转移到（）具有侵染力，能够将核酸从一种寄主细胞转移到其它寄主细胞。其它寄主细胞。植物病毒的侵染途径（）农业操作时的机械损伤。（）农业操作时的机械损伤。（）介体（昆
38、虫等）造成的微伤。（）介体（昆虫等）造成的微伤。（）通过嫁接、菟丝子的（）通过嫁接、菟丝子的“ “桥接桥接” ”传播。传播。病毒的运动病毒的运动 病毒侵染植物病毒侵染植物 病毒进入细胞病毒进入细胞 病毒脱壳病毒脱壳 病毒基因组的复制、蛋白质的合成病毒基因组的复制、蛋白质的合成 子代病毒颗粒子代病毒颗粒的组装的组装 细胞间移动细胞间移动 进入维管组织长距离运进入维管组织长距离运输，向其它部位转移输，向其它部位转移 从维管组织进入细胞，感染从维管组织进入细胞，感染整个植株。整个植株。 在细胞间的移动在细胞间的移动 只能通过胞间连丝来传播扩散，只能通过胞间连丝来传播扩散，是借助病毒编码的是借助病毒编
39、码的“运动蛋白运动蛋白”来实现的，部分病毒来实现的，部分病毒的运动还需要的运动还需要“外壳蛋白外壳蛋白”的参予。的参予。运动蛋白运动蛋白 病毒运动蛋白（病毒运动蛋白（Movement protein)与植物间的与植物间的胞间连丝结合，与细胞壁与胞间连丝调节蛋白相互胞间连丝结合，与细胞壁与胞间连丝调节蛋白相互作用，增加了胞间连丝的有效通道直径，以便允许作用，增加了胞间连丝的有效通道直径，以便允许病毒粒子或基因组核酸通过胞间连丝进入临近细胞，病毒粒子或基因组核酸通过胞间连丝进入临近细胞，实现病毒在细胞间的运动。实现病毒在细胞间的运动。 MP首先在细胞质中暂时表达，然后与微管和微首先在细胞质中暂时表
40、达，然后与微管和微丝结合，沿微管运动，在细胞壁上积累，并最终定丝结合，沿微管运动，在细胞壁上积累，并最终定位于胞间连丝。位于胞间连丝。病毒在植物体内分布不均匀的原因病毒在植物体内分布不均匀的原因（）分生组织中无微管系统，病毒不易移动。（）分生组织中无微管系统，病毒不易移动。（）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很强，（）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很强，有竞争状态，抑制了病毒的复制。有竞争状态，抑制了病毒的复制。（）在分生组织中存在高水平的内源激素，可以（）在分生组织中存在高水平的内源激素，可以抑制病毒的增殖。抑制病毒的增殖。二、脱毒的方法二、脱毒的方法物理法脱毒物理法脱毒化学方法脱毒化学方
41、法脱毒生物学方法生物学方法物理方法（）射线（射线、紫外线等）（）射线（射线、紫外线等）（）热处理）热处理热水：对休眠组织有效，温水热水：对休眠组织有效，温水热空气：对正在生长或生长旺盛的器官有效热空气：对正在生长或生长旺盛的器官有效（3 3）冷处理）冷处理化学方法 嘧啶、嘌呤类似物、抗生素等嘧啶、嘌呤类似物、抗生素等生物学方法茎尖脱毒茎尖脱毒愈伤组织脱毒愈伤组织脱毒嫁接脱毒嫁接脱毒珠心组织脱毒珠心组织脱毒（）茎尖脱毒茎尖脱毒的原理茎尖脱毒的技术关键茎尖脱毒的原理病毒的传播：微管系统 和细胞的胞间连丝传播，以微管组织为主。茎尖脱毒的技术关键同一种病毒在植物体内分布部位不同。不同种类病毒在同一植物
42、中分布位置不同。茎尖越小，对培养基要求越高，成功率低。茎尖越小，剥离技术要求高。（）愈伤组织脱毒（）微体嫁接脱毒原理：把极小的茎尖0.2mm作为接穗嫁接到砧木上，然后连同砧木一起在培养基上培养，由砧木吸收培养基中的营养，接穗在砧木的哺育下很容易成活。试管嫁接技术关键微体嫁接要求剥离技术高。筛选培养基时要考虑到砧木与接穗对培养基营养组成的不同要求。取材季节，春季容易成功，嫁接率高。（4）珠心组织脱毒珠心组织脱毒珠心胚与微管组织无关三、茎尖培养脱除病毒的程序三、茎尖培养脱除病毒的程序取材和灭菌取材和灭菌茎尖剥离茎尖剥离初代培养初代培养分化培养分化培养无病毒植株的鉴定无病毒植株的鉴定无病毒种苗的保存
43、与利用无病毒种苗的保存与利用取材和灭菌取材和灭菌（）材料的大小（）材料的大小（）取材时间（）取材时间（）优良种质（）优良种质（）生长健壮（）生长健壮（）年龄（）年龄茎尖剥离（）防止茎尖被损伤。（）防止茎尖被损伤。（）注意保湿（）注意保湿（）避免污染（）避免污染茎尖分生组织茎尖分生组织（Apical meristem;Apical dome）：主要指茎的最幼龄叶原基上方的一主要指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，其直径部分，其直径0.1mm0.1mm，长度，长度0.250.25的茎尖。的茎尖。普通茎尖普通茎尖（ Shoot tip ） ：由顶端分生组织由顶端分生组织及其下方的及其下方的1-31-3个
44、幼叶原基构成。个幼叶原基构成。茎茎尖尖分分生生组组织织剥剥离离3.初代培养注意GA的应用4.分化培养可以先诱导愈伤组织，然后在诱导分化形成苗。茎尖培养可以与热处理和化学脱毒相结合。5 5无病毒植株的鉴定无病毒植株的鉴定（）血清鉴定法（）血清鉴定法（）生物学鉴定法（）生物学鉴定法（）电子显微镜检查法（）电子显微镜检查法（）血清鉴定法原理：原理：抗原抗原与与抗体抗体结合，具有很强的特结合，具有很强的特异性，一种病毒产生的抗体只能结合该异性，一种病毒产生的抗体只能结合该病毒。病毒。抗体：当动物被感染或人工注射异体蛋抗体：当动物被感染或人工注射异体蛋白时，会在动物体内产生一种特异性球白时，会在动物体内
45、产生一种特异性球蛋白蛋白免疫球蛋白，称抗体。免疫球蛋白，称抗体。抗原；引起形成抗体的物质病毒或异体抗原；引起形成抗体的物质病毒或异体蛋白称为抗原。蛋白称为抗原。病毒感染人工注射异体蛋白动物动物植物带该种病毒血清反应（抗体）（抗原）（抗原）+血液鉴定法示意图植物汁液植物汁液凝集反应抗血清抗血清对照血清玻璃片凝集法示意图（）生物学鉴定法敏感植物敏感植物：有些植物对病毒极为敏感，：有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒表现特有的病斑，把这种植物称为病毒“ “敏感植物敏感植物” ”或或“ “指示植物指示植物” ”。
46、 摩擦接种法 嫁接法（）电子显微镜检查法6无病毒种苗的保存与利用保存： 隔离种植保存 离体保存利用：建立良种繁育场病毒交叉保护：病毒交叉保护：一种病毒存在，可以使一种病毒存在，可以使寄主植物有能力抵抗另一种病毒。寄主植物有能力抵抗另一种病毒。植物对病毒的衍生抗性植物对病毒的衍生抗性：当一株植物被：当一株植物被非致病性病毒感染后，会表现出对其它非致病性病毒感染后，会表现出对其它致病性病毒的抗性。致病性病毒的抗性。病毒交叉保护现象病毒交叉保护现象 是指一种病毒的存在可使寄主植物有能力抵抗是指一种病毒的存在可使寄主植物有能力抵抗另一种病毒。另一种病毒。 脱毒后的植物的感病性反而增强脱毒后的植物的感病
47、性反而增强，会感染上致，会感染上致病性更强的病毒或真菌。其原因可能是寄主植株病性更强的病毒或真菌。其原因可能是寄主植株的营养和生理状态发生了改变。的营养和生理状态发生了改变。 日本曾经用通过茎尖培养得到的脱毒原种取代日本曾经用通过茎尖培养得到的脱毒原种取代了受马铃薯了受马铃薯X病毒（病毒（PVX）侵染的马铃薯品种后，）侵染的马铃薯品种后，造成了花叶病的严重泛滥。造成了花叶病的严重泛滥。植物对病毒的衍生抗性植物对病毒的衍生抗性 当一株植物先被非致病性的病毒感染后，会呈当一株植物先被非致病性的病毒感染后，会呈现出对其它致病性病毒的抗性（不是由于免疫）。现出对其它致病性病毒的抗性（不是由于免疫）。
48、如人们将如人们将TMV包膜蛋白基因转化植物，然后包膜蛋白基因转化植物，然后让让TMV进行侵染，结果显示，转基因植物对多种进行侵染，结果显示，转基因植物对多种类型的类型的TMV都有抗性。都有抗性。作 业一一 名词解释名词解释离体快速无性繁殖离体快速无性繁殖 单株（芽）无性系单株（芽）无性系顶端分生组织顶端分生组织 试管嫁接试管嫁接褐变褐变 玻璃化玻璃化 指示植物指示植物二二 简答题简答题1 1 植物离体快速无性繁殖有那些特点？植物离体快速无性繁殖有那些特点？2 2 简述植物离体快速无性繁殖的一般程序及简述植物离体快速无性繁殖的一般程序及技术关键？技术关键？3 3 简述植物病毒的特性及其在植物体内
49、的简述植物病毒的特性及其在植物体内的分布特点？分布特点？4 4 脱除植物病毒有那几种方法？并说明茎尖脱除植物病毒有那几种方法？并说明茎尖培养脱毒的原理及程序。培养脱毒的原理及程序。Xylemphloem vascular tissueground tissue Xylemphloem vascular tissueground tissue dermal tissueepidermisdermal tissueepidermisMeristem, shoot tip and stem cutting culture Meristem, shoot tip and stem cutting cu
50、lture Meristems are actively dividing parts (0,2 to 0,5 mm in size), at the top of Meristems are actively dividing parts (0,2 to 0,5 mm in size), at the top of the shoot tips or root tips as well as in the axillary buds. They are dissected the shoot tips or root tips as well as in the axillary buds.
51、 They are dissected under the microscope and can be regenerated on specific media to under the microscope and can be regenerated on specific media to complete plete plants.Also shoot tips and stem cuttings (0,5 to 1 cm in size) can be cultivated in Also shoot tips and stem cuttings (0,5 to 1 cm in s
52、ize) can be cultivated in vitro to produce complete plantlets. vitro to produce complete plantlets. All 3 methods are used All 3 methods are used to eliminate virus pathogens in plants to identically propagate plants (cloning) to store plants for long periods (long term storage) without the impact of environmental conditions. These methods are applied at the LfL to improve Arnica montana, hops, potato and forage grasses.
