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1、实验四、质粒实验四、质粒DNA的转化的转化 一一一一 实验目的实验目的实验目的实验目的 二二二二 实验原理实验原理实验原理实验原理 三三三三 材料仪器材料仪器材料仪器材料仪器 四四四四 实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤 五五五五 实验结果图实验结果图实验结果图实验结果图 六六六六 结果讨论结果讨论结果讨论结果讨论 七七七七 思考题思考题思考题思考题一、实验目的一、实验目的vv学习将外源质粒学习将外源质粒学习将外源质粒学习将外源质粒 DNA DNA DNA DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体转入受体菌细胞并筛选转化体转入受体菌细胞并筛选转化体转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。的方法。的方法。的方
2、法。 vv转化转化转化转化（transformationtransformationtransformationtransformation）: : : :把外源把外源把外源把外源DNADNADNADNA分子导入到某一宿主分子导入到某一宿主分子导入到某一宿主分子导入到某一宿主细菌细胞的过程细菌细胞的过程细菌细胞的过程细菌细胞的过程称为转化。称为转化。称为转化。称为转化。当细菌处于容易吸收外源当细菌处于容易吸收外源当细菌处于容易吸收外源当细菌处于容易吸收外源DNADNADNADNA的的的的状态即状态即状态即状态即感受态感受态感受态感受态时，转化最易发生。时，转化最易发生。时，转化最易发生。时，转
3、化最易发生。vv当当当当受体菌受体菌受体菌受体菌处于感受态时处于感受态时处于感受态时处于感受态时，转化混合物中的，转化混合物中的，转化混合物中的，转化混合物中的DNADNADNADNA形成抗形成抗形成抗形成抗DNaseDNaseDNaseDNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42424242短时间热冲短时间热冲短时间热冲短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源击处理，促进细胞吸收外源击处理，促进细胞吸收外源击处理，促进细胞吸收外源DNADNADNADNA。在培养基上生长数小时后，。在培
4、养基上生长数小时后，。在培养基上生长数小时后，。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖球状细胞复原并分裂增殖球状细胞复原并分裂增殖球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗被转化的细菌中，载体中抗抗被转化的细菌中，载体中抗抗被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子的转化子的转化子的转化子（transformanttransformanttransformanttransformant）。
5、）。）。）。二、实验原理二、实验原理三、材料仪器三、材料仪器 实验仪器实验仪器实验仪器实验仪器 超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。 实验材料实验材料实验材料实验材料vv大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DH5DH5DH5DH5感受态细胞；感受态细胞；感受态细胞；感受态细胞；vv质粒质粒质粒质粒DNA:DNA
6、:DNA:DNA:pCR4ToPoGt5GT7pCR4ToPoGt5GT7pCR4ToPoGt5GT7pCR4ToPoGt5GT7( ( ( (Kan+AmpKan+AmpKan+AmpKan+Amp抗性抗性抗性抗性) ) ) )；vvLBLBLBLB固体培养基；固体培养基；固体培养基；固体培养基；vv含含含含Kan+Kan+Kan+Kan+AmpAmpAmpAmp的的的的LBLBLBLB固体培养基：将配好的固体培养基：将配好的固体培养基：将配好的固体培养基：将配好的LB LB LB LB 固体培养基高压固体培养基高压固体培养基高压固体培养基高压灭菌后冷却至灭菌后冷却至灭菌后冷却至灭菌后冷却至
7、60606060左右，加入左右，加入左右，加入左右，加入AmpAmpAmpAmp和和和和KanKanKanKan储存液，使终浓度储存液，使终浓度储存液，使终浓度储存液，使终浓度分别为分别为分别为分别为50g/ml50g/ml50g/ml50g/ml，摇匀后铺板。，摇匀后铺板。，摇匀后铺板。，摇匀后铺板。1 1 1 1从冰箱中取出感受态细胞，放置从冰箱中取出感受态细胞，放置从冰箱中取出感受态细胞，放置从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上冰上冰上冰上；2 2 2 2每每每每组组组组分分分分别别别别取取取取2 2 2 2管管管管2 2 2 20l0l0l0l感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞悬液悬
8、液悬液悬液； 第第第第一一一一管管管管为为为为转转转转化化化化实实实实验验验验组组组组：1l1l1l1l重重重重组组组组质质质质粒粒粒粒DNA+DNA+DNA+DNA+2 2 2 20l0l0l0l感受态细胞；感受态细胞；感受态细胞；感受态细胞； 第第第第二二二二管管管管为为为为阴阴阴阴性性性性对对对对照照照照组组组组；加加加加入入入入1l1l1l1l无无无无菌菌菌菌水水水水+ + + +2 2 2 20l0l0l0l感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液；轻轻轻轻轻轻轻轻摇匀，冰上放置摇匀，冰上放置摇匀，冰上放置摇匀，冰上放置30303030分钟分钟分钟分钟；3 3 3 3
9、将将将将管管管管放放放放入入入入42 42 42 42 恒恒恒恒温温温温水水水水浴浴浴浴中中中中90909090秒秒秒秒，迅迅迅迅速速速速将将将将eppendorfeppendorfeppendorfeppendorf管管管管移移移移到到到到冰冰冰冰浴浴浴浴上上上上，冷却冷却冷却冷却2 min2 min2 min2 min；四、实验步骤四、实验步骤+42420 0C C热击热击37370 0C C复复苏苏Kan+Amp筛选筛选感受感受态态细细胞胞质质粒粒DNA4.4.4.4.向向向向上上上上述述述述eppendorfeppendorfeppendorfeppendorf管管管管中中中中加加加加
10、入入入入200uL200uL200uL200uL LBLBLBLB液液液液体体体体培培培培养养养养基基基基（不不不不含含含含抗抗抗抗生生生生素素素素），混混混混匀匀匀匀后后后后37373737振振振振荡荡荡荡培培培培养养养养20min20min20min20min，使使使使细细细细菌菌菌菌恢恢恢恢复复复复正正正正常常常常生生生生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；长状态，并表达质粒编码的抗性基因；长状态，并表达质粒编码的抗性基因；长状态，并表达质粒编码的抗性基因；5.5.5.5.将将将将上上上上述述述述菌菌菌菌液液液液摇摇摇摇匀匀匀匀后后后后取取取取1 1 1 100l 00l 00l 00l
11、涂涂涂涂布布布布于于于于含含含含Kan+Kan+Kan+Kan+AmpAmpAmpAmp的的的的筛筛筛筛选选选选平平平平板板板板上上上上，涂涂涂涂布布布布之之之之后后后后，在在在在37373737培培培培养养养养箱箱箱箱中中中中正正正正面面面面向向向向上上上上放放放放置置置置半半半半小小小小时时时时，待待待待菌菌菌菌液液液液完完完完全全全全被被被被培培培培养养养养基基基基吸吸吸吸收收收收后后后后倒倒倒倒置置置置培培培培养养养养皿皿皿皿，37373737培培培培养养养养12-1612-1612-1612-16小小小小时；时；时；时；6. 6. 6. 6. 涂布细则如下表：涂布细则如下表：涂布细则
12、如下表：涂布细则如下表：涂布棒的使用涂布棒的使用1 1 1 1、使用前，浸入、使用前，浸入、使用前，浸入、使用前，浸入75%75%75%75%酒精中；酒精中；酒精中；酒精中；2 2 2 2、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；（不要烧到手）；（不要烧到手）；（不要烧到手）；3 3 3 3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；4 4 4 4、涂布均匀；、涂布均匀；、涂布均匀；、涂布均匀；
13、5 5 5 5、将涂布棒重新除菌以备下一次使用、将涂布棒重新除菌以备下一次使用、将涂布棒重新除菌以备下一次使用、将涂布棒重新除菌以备下一次使用；6 6 6 6、阴性对照与重组、阴性对照与重组、阴性对照与重组、阴性对照与重组DNADNADNADNA的涂布棒区别使用，避免的涂布棒区别使用，避免的涂布棒区别使用，避免的涂布棒区别使用，避免DNADNADNADNA污染。污染。污染。污染。A A( (对照对照-Amp-Amp+Kan)+Kan): :1 100ul00ul菌液涂布于菌液涂布于LB+AmpLB+Amp+Kan+Kan培养基，菌落生长培养基，菌落生长情情况况; ;B B( (转化转化-Amp
14、-Amp+Kan)+Kan):100ul:100ul菌液涂布于菌液涂布于LB+AmpLB+Amp+Kan+Kan培养基，菌落生长情况培养基，菌落生长情况; ;C C( (对照对照- -无无) ): :1 100ul00ul菌液涂布于菌液涂布于LBLB培养基，菌落生长情况培养基，菌落生长情况; ;BCA五、实验结果图五、实验结果图六、结果讨论六、结果讨论v转化转化过程过程中的影响因素中的影响因素1 1受体受体细胞的生长状态和密度细胞的生长状态和密度 细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5510107 7个左个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通
15、过测右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的定培养液的A A600600控制。控制。2 2质粒质粒DNADNA的质量和浓度的质量和浓度 用于转化的质粒用于转化的质粒DNADNA应主要是超螺旋态的，转化率与应主要是超螺旋态的，转化率与外源外源DNADNA的浓度在一定范围内成正比，但外源的浓度在一定范围内成正比，但外源DNADNA的量过多的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，时，则会使转化率下降。一般来讲，DNADNA溶液的体积不应溶液的体积不应超过感受态细胞体积的超过感受态细胞体积的5%5%，1ng1ng的超螺旋的超螺旋DNADNA即可使即可使50 l50 l的感受态细胞达
16、到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNADNA分子的构型分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高相同的线性重组质粒高10-10010-100倍。倍。3 3试剂的质量试剂的质量 化合物及无机离子的影响：所用的化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2CaCl2等试剂均需是等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于44。在。在Ca2+C
17、a2+的基础上联合其他二价金属离子（如的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+Mn2+或或Co2+Co2+）、）、DMSODMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。4 4防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNADNA的污染的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNADNA酶或杂酶或杂DNADNA所污所污染，否
18、则均会影响转化效率或杂染，否则均会影响转化效率或杂DNADNA的转入。的转入。5 5整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。率将会降低。七、思七、思 考考 题题1 1 1 1、制备感受态细胞的关键是什么？、制备感受态细胞的关键是什么？、制备感受态细胞的关键是什么？、制备感受态细胞的关键是什么？2 2 2 2、如果、如果、如果、如果DNADNADNADNA转化后，没有得到转化子或者转化子很转化后，没有得到转化子或者转化子很转化后，没有得到转化子或者转化子很转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。少，分析原因。少，分析原因。少，分析原因。3 3 3 3、如何提高转化效率？、如何提高转化效率？、如何提高转化效率？、如何提高转化效率？
