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1、 PCR-单链构象多态性单链构象多态性 (PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP)单链单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由种立体结构主要是由 其内部碱基配对、氢键等分子其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同中受排阻大小不同
2、。因此，通过非变性聚丙烯酰胺因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳(PAGE)，可以非常可以非常 敏锐地将构象上有差敏锐地将构象上有差异的分子分离开异的分子分离开。该方法即为单链构象多态性该方法即为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。分析。基本原理基本原理将将SSCP用于检查用于检查PCR扩增产物的基因突变，扩增产物的基因突变，建立建立PCR-SSCP技术。技术。基本过程：基本过程：PCR扩增靶扩增靶DNA; 将特异的将特异的PCR扩增扩增 产物变性，而后快速复性，产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构
3、的单链使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；分子；将适量的单链将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳;最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。显色分析结果。若发现单链若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该该DNA片段中有碱基突变。片段中有碱基突变。 PCR-SSCP基本过程基本过程SSCP的应用的应用 进行人类进行人类DNA多态性分析，大量地用于检测多态性分析，大量地用于检测和肿瘤发生和肿瘤
4、发生 有关的基因突变。有关的基因突变。 如检测星形细胞瘤、脑如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、基因的突变、肺癌的肺癌的ras基因突变等。基因突变等。 用于检用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上测引起人类遗传性疾病的研究上 。 如如在囊性纤维化中起作用的在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤基因、神经纤维瘤 1型基因、型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。家族性结肠息肉基因的研究中。 用于病毒的分型、监测用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染实验中的污染 情情况、以及病原体传播途径的研究中。况、以及病原体传播途径
5、的研究中。 Yap用巢式用巢式PCR对来自不同国家和地区的对来自不同国家和地区的HBV标品标品 进行了检测，并对扩增产进行了检测，并对扩增产物进行了物进行了SSCP分析，发现每个标本的分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同图谱完全不同 ，不仅证明了不仅证明了HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性。染的可能性。 PCR-SSCP的实验操作的实验操作 SSCP前首先要通过前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物扩增出特异性好的产物(琼脂糖琼脂糖电泳不能有过强的拖尾和引物二聚体电泳不能有过强的拖尾和引物二聚体)。2.制备聚丙烯酰胺凝胶制备聚丙烯酰胺
6、凝胶(PAG) （1）电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，）电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗，95乙醇擦拭，通乙醇擦拭，通风橱自然晾干。两块玻璃对齐，底部和两侧用橡胶条封好，风橱自然晾干。两块玻璃对齐，底部和两侧用橡胶条封好，用用1%琼脂糖胶封底，琼脂糖胶封底，固定在垂直电泳槽上固定在垂直电泳槽上。 （2） 制胶：按照被分离制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用58的凝胶较为合适。的凝胶较为合适
7、。 PCR-SSCP的实验操作的实验操作 在小于在小于1Kb长度的情况下，长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下胺的浓度选择如下:DNA片段长度片段长度(核苷核苷酸数酸数)丙烯酰丙烯酰胺胺(%)1Kb700b3.5700b500b5500b200b8200b10-12PCR-SSCP的实验操作的实验操作 PAGE的制备：的制备：成分：成分： 浓度：浓度：8% 10%40%丙烯酰胺丙烯酰胺 8ml 10mlddH2O 26ml 24ml甘油甘油 4ml 4ml10 TBE 2ml 2mlTEMED 40ul 40ul10%AP 600ul 600ulPCR-SSCP
8、的实验操作的实验操作 10TBE：Tris 108 g，硼酸硼酸 55 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）40ml，定容至定容至1000 ml，高压灭菌，高压灭菌，4贮存贮存。 40%丙烯酰胺贮备液（交联度丙烯酰胺贮备液（交联度49:1）：）：39.2 g丙烯酰胺，丙烯酰胺，0.8 g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至100 ml，过滤，避光过滤，避光4贮存贮存。 10过硫酸铵：过硫酸铵：过硫酸铵过硫酸铵 0.1 g 溶于溶于1 ml蒸馏水，蒸馏水，4贮贮存存数周。数周。 2上样缓冲液：上样缓冲液：甲酰胺甲酰胺 9.5 g，0.5mol/L EDTA 0.4
9、ml，二甲苯蓝二甲苯蓝FF 5 mg,溴酚兰溴酚兰 5 mg，加水溶解，定容到加水溶解，定容到10ml。 试剂配制：试剂配制：PCR-SSCP的实验操作的实验操作 （3）按上表配制合适浓度的胶液，轻轻摇匀。用）按上表配制合适浓度的胶液，轻轻摇匀。用1ml移液器吸取胶液，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，移液器吸取胶液，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部，立即插入相应的点样梳，（小心直至灌满模具顶部，立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔梳齿于玻璃板上端，以
10、免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。小心小心取出点样梳，在电泳槽内灌入取出点样梳，在电泳槽内灌入 1TBE电泳缓冲液，电泳缓冲液，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。样品上胶前预电泳约未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。样品上胶前预电泳约30分钟。分钟。PCR-SSCP的实验操作的实验操作 lPCR扩增产物，加入扩增产物，加入15l 2上样缓冲液中，混匀。上样缓冲液中，混匀
11、。100C变性变性10min，立即冰浴骤冷立即冰浴骤冷2分钟以上分钟以上。然后将然后将10l混合物上样，以微量加样器上样。上样时要注意混合物上样，以微量加样器上样。上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散。易于扩散。 PCR-SSCP的实验操作的实验操作 4.电泳：根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大电泳：根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l5Vcm电泳。电泳。 5.剥胶：电泳结束后，回收电泳缓冲液，取下电泳剥胶：电泳结束后，回收电泳缓冲
12、液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。顺序标记。 PCR-SSCP的实验操作的实验操作 试剂：试剂： 1.固定液（固定液（10%无水乙醇）：无水乙醇无水乙醇）：无水乙醇50ml，双蒸水定双蒸水定容至容至500ml。 2.1%硝酸溶液：硝酸溶液：5ml硝酸，双蒸水定容至硝酸，双蒸水定容至500ml。 3.0.2%硝酸银溶液（现配）：硝酸银溶液（现配）：1g硝酸银，双蒸水定容至硝酸银，双蒸水定容至500ml。 4.显色液：显
13、色液：15g无水碳酸钠，溶于无水碳酸钠，溶于500ml双蒸水，同时加双蒸水，同时加入入250ul甲醛，混匀。临用时配制。甲醛，混匀。临用时配制。 PCR-SSCP的实验操作的实验操作 步骤：步骤：1.凝胶用固定液浸泡凝胶用固定液浸泡5-10分钟，双蒸水漂洗分钟，双蒸水漂洗2遍，遍，每次每次2 min ；2.1%硝酸溶液浸泡硝酸溶液浸泡5分钟，双蒸水漂洗分钟，双蒸水漂洗2遍；遍；3.0.2%硝酸银溶液浸泡硝酸银溶液浸泡20分钟，双蒸水漂洗分钟，双蒸水漂洗2遍，遍，每次约每次约10 s，轻轻漂洗轻轻漂洗 ；4.显色液中显色至条带清晰而背景不至于过深，双蒸水漂显色液中显色至条带清晰而背景不至于过深，
14、双蒸水漂洗洗2遍；遍；5.银染后的凝胶经银染后的凝胶经SmartView成像，拍摄，电脑保存。成像，拍摄，电脑保存。PCR-SSCP的实验操作的实验操作 由于在由于在SSCP分析中非变性分析中非变性PAG电泳不是根据单链电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近，很出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在难看
15、出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在16-18cm以上，以检测限为指标来判定结果。以上，以检测限为指标来判定结果。检测限是指突变检测限是指突变DNA片片段与正常段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说明该测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化。例如，于检测限则说明链之间无变化。例如，一般检测限定为一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有以上，则说明两链之间有 改变。改变。另外检测限不能定的太低，否则主观因素太
16、大，易造成假阳另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果。另外，性结果。另外，SSCP 分析中其它条件，如分析中其它条件，如PCR产物的上样产物的上样量，量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定。行选择确定。SSCP结果结果SSCP结果结果 对出现异常泳动条带的样品，从对出现异常泳动条带的样品，从PCR扩增到扩增到SSCP，均重复均重复3次，获相同结果，再送测序确证，以次，获相同结果，再送测序确证，以排除排除PCR反应中的错配或电泳条件差异引起的偶然现反应中的错配或电泳条件差异引起的偶然现象，既使结果可靠，又避
17、免不必要的测序。象，既使结果可靠，又避免不必要的测序。 质量控制质量控制 1.DNA片段的大小和组成片段的大小和组成:用于用于SSCP分析的分析的DNA片段片段越小，检测的敏感性越高。越小，检测的敏感性越高。200 bp的的DNA片段检出率为片段检出率为90%，200500 bp的的DNA片段检出率为片段检出率为7080%，而，而500 bp的的DNA片段检出率片段检出率50%。对于大于。对于大于400bp的的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于产物，产生小于400bP的的DNA片段，再进行片段，再进行SSCP分分析
18、。另一方面，核酸片段中碱基的组成以及突变位点临近析。另一方面，核酸片段中碱基的组成以及突变位点临近的核酸序列也可能影响其电泳速度，如富嘌呤序列较富嘧的核酸序列也可能影响其电泳速度，如富嘌呤序列较富嘧啶序列对碱基变异更敏感。啶序列对碱基变异更敏感。 PCR-SSCP注意事项注意事项产量和特异性：产量和特异性：PCR扩增产物的高度特异性是扩增产物的高度特异性是SSCP成成功的前提。首先要优化功的前提。首先要优化PCR反应条件，以免非特异扩反应条件，以免非特异扩增带干扰结果分析；其次要避免增带干扰结果分析；其次要避免PCR操作过程的污染。操作过程的污染。在使用大量在使用大量PCR产物时，变性的单链产
19、物时，变性的单链DNA会很快地复会很快地复性，从而影响性，从而影响SSCP检测的敏感性；但如果减少检测的敏感性；但如果减少PCR产产量，则可能因为单链量，则可能因为单链DNA太少而降低敏感性，所以上太少而降低敏感性，所以上样量也要进行摸索。样量也要进行摸索。PCR-SSCP注意事项注意事项 3. 游离引物游离引物: 游离引物可能同游离引物可能同 PCR产物结合而改变产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物
20、。也可以运用过柱或磁性球方法尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化纯化PCR产物。或者是稀释产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的产物，减少游离引物的干扰。干扰。PCR-SSCP注意事项注意事项 4.低浓度变性剂低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂，如凝胶中加入低浓度的变性剂，如5-10甘油、甘油、5尿素或甲酸胺、尿素或甲酸胺、10二甲亚砜二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油
21、的凝的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用胶中被检出。因此，对同一序列使用23种条件做种条件做SSCP，可能提高敏感性。可能提高敏感性。 PCR-SSCP注意事项注意事项 5.凝胶浓度、交联度及厚度凝胶浓度、交联度及厚度: 凝胶浓度和交联度决定凝胶浓度和交联度决定凝胶孔径大小，因而影响单链凝胶孔径大小，因而影响单链DNA泳动速度和对构象的泳动速度和对构象的分辨率。不同大小分辨率。不同大小DNA片段的最适浓度不同，本人以往片段的最适浓度不同，本人以往实验根据有关文献选择了实验根据有关文献选择了8%凝胶。凝胶浓度不同，突变凝胶。凝胶浓度不同，突变带的相对位置也
22、不相同，如果在进行未知突变种类的带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。凝胶越薄越好。PCR-SSCP注意事项注意事项 6.电泳温度：电泳温度：单链单链DNA的构象取决于温度和分子内的构象取决于温度和分子内部弱的稳定力之间的平衡，温度是部弱的稳定力之间的平衡，温度是SSCP分析中至关重分
23、析中至关重要的影响因素，不同的要的影响因素，不同的DNA片段应尽可能调试在最适片段应尽可能调试在最适温度下进行电泳，一般温度下进行电泳，一般4-15之间。但由于在电泳时之间。但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。水冷却等。 PCR-SSCP注意事项注意事项PCR-SSCP注意事项注意事项 : 在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电
24、泳槽温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行上进行SSCP时，开始的时，开始的5min应用较高的电压应用较高的电压(550V)，以以后用后用400V左右电压进行电泳。这主要是由于开始的高电左右电压进行电泳。这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的初步分离，而凝胶的温度不会升高温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离。随后的低电压电泳可以使之进一步分离。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。 8.假阴性假阴性: 一般认为，如没有污染，一般认为，如没有污染，PCRSSCP分析分
25、析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于由于PCRSSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性
26、对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。百分之百地消除。PCR-SSCP注意事项注意事项 9.结果分析结果分析: 单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带。因此，链亦可形成一条带。因此，PCRSSCP分析结果至少分析结果至少显示三条带显示三条带。但是，。但是，由于一种由于一种DNA单链有时可形成两种单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。PCR-SSCP注意事项注意事项
