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1、3 3 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法仪器分析 定义：定义：定义：定义：以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪液相色谱仪；采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为液相色谱仪称为高效液相色谱仪高效液相色谱仪。组成部分：组成部分： 高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统本实验室的高效液相色谱仪（岛津本实验室的高效液相色谱仪（岛津本实验室的高效液相色谱仪（岛津本实验室的高效液相色谱仪（岛津 LC-10ALC-10A
2、）3.1 流程流程液体流动相液体流动相液体流动相液体流动相高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱进样器进样器进样器进样器检测器检测器检测器检测器废液废液废液废液信号输出信号输出信号输出信号输出3.2 特点特点 特点：高压、高效、高速、高灵敏度特点：高压、高效、高速、高灵敏度 适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析具有极大的优势。高效分离分析具有极大的优势。3.33.3 主要部件主要部件主要部件主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，用于输送液体流动相。主要部件之一，用于输送液体流动相。高高柱柱效效
3、的的固固定定相相粒粒度度很很小小（ 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。长期累积损坏色谱柱和使检测器噪
4、声增加。（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。）化铝固定相等。）（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。器时，流动相不应有紫外吸收。1 1 液液- -固吸附色谱固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatogr
5、aphyliquid-solid adsorption chromatography 固定相：为为固固体体吸吸附附剂剂，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用的是用的是510 m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸；：组分在固定相上的吸附与解吸； 适适用用于于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有有官能团的化合物和异构体有较高选择性；官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；3.4 主
6、要色谱分离类型与基本原理有机氯农药残留量分析有机氯农药残留量分析有机氯农药残留量分析有机氯农药残留量分析 固固 定定 相相 ： 薄薄 壳壳 型型 硅硅 胶胶 (37 50 m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径) 检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。2. 液液-液分配色谱液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）
7、； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正相相 normal phase），反反之之，流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（反反相相 reverse phase）。）。正相与反相的出峰顺序相反。正相与反相的出峰顺序相反。 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型载体 由由氧氧化化硅硅、氧氧化化铝铝、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；早早期期采采用用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性
8、能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。 （2）表面多孔型载体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体） 3040m的的玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为1 2m的的多多孔硅胶。孔硅胶。 表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底； 化学键合固定相化学键合固定相: 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用 最广最广、性能最佳的固定相；、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C c
9、. 硅碳键型：硅碳键型： SiC d. 硅氮键型：硅氮键型： SiN 3化学键合相色谱法化学键合相色谱法 将各种不同基团通过化学反应将各种不同基团通过化学反应 键合到硅胶（载体）表面的键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上。游离羟基上。4. 离子交换色谱离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液碱性水溶液； 基本原
10、理：组分在固定相上发生反复离子交换反应；：组分在固定相上发生反复离子交换反应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。在形式等有关。亲和力大，保留时间长。 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。5. 5. 尺寸排斥色谱尺寸排斥色谱尺寸排斥色谱尺寸排斥色谱size- exclusion chromatographysize- exc
11、lusion chromatography 原理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶剂分子小，故在最后出峰。溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰； 可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范围内的化合物按质量分离。范围内的化合物按质量分离。 M.W.tR高效液相色谱分析的应用高效液相色谱分析的应用高效液相色谱分析的应用高效液相色谱分析的应
12、用1.1.茶多酚的检测茶多酚的检测茶多酚的检测茶多酚的检测 高效液相条件：高效液相条件： 色谱柱：色谱柱：DiamonsilDiamonsil C18 C18（5um5um，250mm*4.6mm250mm*4.6mm） 流动相：等浓度洗脱流动相：等浓度洗脱 CH3OH-H2O-TFACH3OH-H2O-TFA（2323：7777：0.050.05） A A：甲醇（色谱纯）：甲醇（色谱纯） B B：0.05%0.05%的的TFATFA水溶液（微孔过滤超声）水溶液（微孔过滤超声） 洗脱程序（先等度再梯度）：洗脱程序（先等度再梯度）：23%A23%A（20min20min） 10min10min
13、40%A(5min) 40%A(5min) 5min5min 90%A(5min) 90%A(5min) 5min 5min 23%A23%A 检测波长：检测波长：280nm 280nm 流速：流速：1ml/min1ml/min 柱温：柱温：3535 样品含量公式：样品含量公式： 样品含量样品含量= =（标品取样量（标品取样量* *样品峰面积样品峰面积* *标品纯度）标品纯度）/ /标品峰面积标品峰面积色谱图色谱图色谱图色谱图1. 25%1. 25%甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液2. 23%2. 23%甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液甲醇溶液2. 2. 图形分析图形分析图形分析图形分析气相图：气相图
14、：气相图：气相图：l l存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。l l可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动 相流速偏低；进样速度慢。相流速偏低；进样速度慢。相流速偏低；进样速度慢。相流速偏低；进样速度慢。l l解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温
15、加解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加 热）；增大流速。热）；增大流速。热）；增大流速。热）；增大流速。液相图：液相图：液相图：液相图：l lC-18C-18柱（柱（柱（柱（ODSODS柱柱柱柱) )l l可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。l l解决的办法：降低极性，增加流速。解决的办法：降低极性，增加流速。解决的办法：降低极性，增加流速。解决的办法：降低极性，增加流速。问题：两个峰出峰时间相隔太远。问题：两个峰出峰时间相隔太远。方法：增加流动相极性；增加流动方法：增加
16、流动相极性；增加流动 解决办法：使用梯度洗脱。解决办法：使用梯度洗脱。解决办法：使用梯度洗脱。解决办法：使用梯度洗脱。液相色谱液相色谱液相色谱液相色谱- -质谱联用质谱联用质谱联用质谱联用样品样品色谱色谱接口接口质谱质谱计算机处理系统计算机处理系统结果结果ABCD.M+N+O+P+.质谱检测质谱检测样品样品色谱分离色谱分离课堂作业课堂作业课堂作业课堂作业什么是梯度洗脱，梯度洗脱的特点及应用。什么是梯度洗脱，梯度洗脱的特点及应用。什么是正向柱和反向柱？在正相液相色谱的分离过程中什么是正向柱和反向柱？在正相液相色谱的分离过程中, , 极性极性 _ _ _的组分先流出色谱柱的组分先流出色谱柱, , 极性极性_ _ _的组分后流出色的组分后流出色谱柱。谱柱。 下列几种物质，应选择哪种色谱进行分析？下列几种物质，应选择哪种色谱进行分析？ 乙醇，玫瑰精油，乙醇，玫瑰精油， - -淀粉酶，脂肪酸，多糖淀粉酶，脂肪酸，多糖
