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1、基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序是基因工程的操作步骤正确的操作顺序是 使目的基因与运载体相结合使目的基因与运载体相结合将目的基因导入受体细将目的基因导入受体细胞胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求检测目的基因的表达是否符合特定性状要求提取目的基因提取目的基因A B C D 步骤一：步骤一：目的基因的获取目的基因的获取 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的
2、基因的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因，还有植，还有植物的物的抗病抗病（抗病毒抗病毒、抗细菌抗细菌）基因基因、种子、种子贮贮藏蛋白的基因藏蛋白的基因，以及人的，以及人的胰岛素基因胰岛素基因、干扰干扰素基因素基因等。等。目的基因的提取方法目的基因的提取方法人工合成基因人工合成基因反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列合成合成DNA：鸟枪法鸟枪法直接分离基因直接分离基因从基因文库中获取基因组文库 cDNA文库 1 . 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 用用用用限制酶限制酶限
3、制酶限制酶将将将将供体细胞供体细胞供体细胞供体细胞中的中的中的中的DNADNA切成许多片段切成许多片段切成许多片段切成许多片段，从中，从中，从中，从中找出找出找出找出含有目的基因含有目的基因含有目的基因含有目的基因. .用限制酶切断成用限制酶切断成许多片段许多片段1）反转录法反转录法： 以以目的基因目的基因转录成转录成的的信使信使RNA为模板，为模板，反反转录转录成互补的成互补的单链单链DNA，然后在酶的作用下，然后在酶的作用下合合成双链成双链DNA，从而获得，从而获得所需的基因。所需的基因。目的基因的目的基因的mRNA单链单链DNA(cDNA)双链双链DNA(即目的基因即目的基因)反转录反转
4、录反转录反转录合成合成合成合成2.2.人工合成基因法人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ： 根据根据已知已知蛋白质蛋白质的的氨基酸序列氨基酸序列，推测推测出相应的出相应的信使信使RNA序序列，然后按照列，然后按照碱基互碱基互补配对补配对原则，原则，推测推测出出它的它的结构基因的核苷结构基因的核苷酸序列酸序列，再通过化学，再通过化学方法，以方法，以单核苷酸为单核苷酸为原料合成目的基因原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因
5、化学合成化学合成化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基酸根据已知氨基酸合成合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分离出来的有时并非一离出来的有时并非一个基因个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
6、1）DNA序列自动测序仪：序列自动测序仪：2）PCR技术：技术： 对提取出来的基因进对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段在短时间内成百万倍在短时间内成百万倍地扩增。地扩增。 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体
7、基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。3 3从基因文库中获取目的基因：从基因文库中获取目的基因：基因文库基因文库: : 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入导入受体菌的群体中储存受体菌的群体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的各个受体菌分别含
8、有这种生物的不同的基因不同的基因, ,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)基因组文库基因组文库: : 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因, ,这种基这种基因文库叫做基因组文库因文库叫做基因组文库. .部分基因文库部分基因文库: : 基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因, ,这种基这种基因文库叫做部分基因文库因文库叫做部分基因文库. .步骤二：步骤二：基因表达载体的构建基因表达载体的构建 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出现，使其出现一一个切口个切口，露出，露
9、出黏性末端黏性末端。 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其产，使其产生生相同相同的的黏性末端黏性末端。 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切口的切口处，再加入适量处，再加入适量DNA连接酶连接酶，形成了一个，形成了一个重重组组DNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的过程。常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基
10、因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。方法。（1 1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2 2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。入宿主细胞。（3 3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。）直接吸收法：把目
11、的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4 4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。细胞中。间接导入法常用的载体是质粒、间接导入法常用的载体是质粒、 噬菌体、科斯质粒。噬菌体、科斯质粒。（1 1）质粒是细菌染色体）质粒是细菌染色体DNADNA以外的环状双链以外的环状双链DNADNA分子，它能自分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体我复制，也可整合到细胞染色体DNADNA中与其一起表达。质粒通常中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。（2 2）
12、 噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNADNA可以作为目的基可以作为目的基因的载体。因的载体。（3 3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和 噬菌体的部分顺序，噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。很适合用作真核生物基因的载体。1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: : 首先用首先用CaCa2+ 2+ 处理细胞处理细胞, ,以以以以增大
13、增大增大增大细菌细菌细菌细菌细胞壁的细胞壁的细胞壁的细胞壁的通透性通透性通透性通透性, , , ,使细胞处于一种能吸收周围环境中使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分分子的生理状态子的生理状态, ,这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞. . 第二步是将重组表达载体第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合冲液中与感受态细胞混合, ,在一定的温度下促进感在一定的温度下促进感受态细胞吸收受态细胞吸收DNADNA分子分子, ,完成转化过程完成转化过程. . 第二步第二步目的基因在受体细胞内，随其繁目的基因在受体细胞内，随其繁目的基因在受体细胞内，随其繁
14、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而殖而殖而殖而复制复制复制复制，由于细菌，由于细菌，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很短非常快，在很短非常快，在很短非常快，在很短的时间内就能获得的时间内就能获得的时间内就能获得的时间内就能获得大量大量大量大量的目的基因。的目的基因。的目的基因。的目的基因。 1）将细菌用）将细菌用CaCl2处理处理，以，以增大增大细菌细菌细细胞壁的通透性胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体受体细胞。细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制复制，由于细菌，由于
15、细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很非常快，在很短的时间内就能获得短的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。步骤四：目的基因的检测与鉴定步骤四：目的基因的检测与鉴定四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效前三步的处理十分繁锁，为
16、保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养
17、、研究。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄
18、入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切
19、点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连连接接酶酶将将黏黏性性末末端端的的碱碱基基对对连连接接起起来来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习练习4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C练习练习
