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1、流感的相关知识及实验室检测微生物检验科 1.一、流感病毒的生物学特征v流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒分为甲、乙、丙三型。v甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性大流行，在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成动物大量死亡。v乙型流感病毒常引起流感局部暴发，不能引起世界性大流行，也没有在动物中存在的证据。v丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。23v流感病毒属于正粘病毒科，病毒颗粒多形态或球形，直径80120nm，丝状体可达数微米。病毒的毒粒结构可分为三层：最外层为双层类脂囊膜，膜上覆盖着血凝素（H）、神经氨酸酶（N ）、M2蛋白。囊膜上的
2、突起，一种像三角形、细长的、能凝集红细胞的称血凝素（H），另一种像蘑菇样、能使病毒颗粒从吸附的红细胞表面释放下来的叫神经氨酸酶（N ）。中间层为球形蛋白壳，是由基质（M1）蛋白形成的，有一个或若干个分子厚。里层为核壳体，呈螺旋对称，直径915nm，包含核蛋白（NP），三种多聚酶蛋白（PB1，PB2，PA），病毒单链的RNA.45v病毒是专性活细胞内寄生物，不能单独进行繁殖，必须在活细胞内才能繁殖。整个复制周期概括起来分为：吸附，侵入，脱壳，生物合成，装配与释放等5个步骤。 67v流感在流行病学上最显著的特点为：突然爆发，迅速蔓延，波及面广，具有一定的季节性，发病率高，死亡率低，多发于青少年，一
3、般不留后遗症，每次流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡，死亡者多为年迈体衰或有慢性疾病的患者。v流感经呼吸道飞沫传播，潜伏期短，一般为13天。人对流感病毒普遍易感。病人是流感的主要传染源，隐性感染者因不易被人察觉，可自由活动，也易向周围人群传播病毒。8v一般来讲，流感病毒对热敏感，5630min被灭活。4-40条件下不稳定，-70以下或冷冻干燥后置4可长期保存。流感病毒最适PH值7.08.0。流感病毒能被紫外线灭活，对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂、氧化剂、卤素化合物、重金属、去污剂等均敏感。v人流感病毒只感染呼吸道表面粘膜上皮细胞，并在这些细胞中繁殖。如果把活流感病毒注入易感者皮下或肌肉内，
4、病毒不能繁殖，但可引起高热头痛、白细胞减少等症状。9二、流感监测的意义v流感为第一个实行全球性监测的传染病，目前已有80多个国家、110余个国家/地区流感中心组成了全球性流感监测网络。流感实验室监测最主要的目的是及时发现并抓到有意义的新变异株，尤其大流行株，提供给诊断试剂制备和疫苗生产；准备做好流感疫情预报。v自人流感病毒被发现以来，人甲型流感病毒出现过四个亚型均首发于我国。1968年以来所出现的新变异株绝大多数也首发于我国。因此我国流感动态已引起WHO和世界各国的关注，甚至有人提示我国的南方是世界流感流行的中心。10三、流感监测的方法v流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异。长江以南地区
5、，流感活动季节性不太强，每年有两个活动峰，一个在冬春季，另一个在夏季；长江以北地区具有较严格的季节性，每年只有一个冬春季高峰。v在辽宁省，流感监测方案规定流行周每周至少采集1015份，非流行周每周至少采集510份，流行季节（每年10月至次年3月）至少采集120份。11v流感样病例定义：体温38，伴有咳嗽或咽喉痛、全身痛等症状的急性呼吸道传染病病例。v流感监测对象为发病三天之内的流感样病例，监测时采集的标本一般为咽拭子、鼻拭子或含漱液。当有流感暴发疫情时，应尽量收集典型病例的鼻咽拭子、含漱液、血清、抽吸液等标本。标本应在4保存24小时内送至实验室，实验室对收到的标本最好2448小时内进行接种。1
6、2四、流感病毒实验室分离1、MDCK细胞传代技术2、流感病毒接种技术3、血凝实验13. 1、MDCK细胞传代技术v把需用的溶液置室温或37恒温箱预温；v把已长成片的MDCK细胞生长液倒掉；v把Versene与0.25%胰酶按7：15：1的比例配制成消化液，每瓶细胞加入适量的消化液，置37恒温箱中消化，此期间要经常在倒置显微镜下观察。14v当细胞变圆，细胞与细胞间互不相连，表明消化时间已到。v倒掉消化液，每瓶加入适量的细胞生长液，用毛细吸管将细胞轻轻吹下吹散。v加入适量细胞生长液，混匀。分装并留下原瓶。v将分装好的细胞瓶放入37恒温箱中培养，约37天可长成片。v长成片的细胞即可进行病毒接种。15
7、16细胞培养中应注意的一些问题：v1、消化时间过长。胰酶浓度过低或保存时间过长。v2、细胞的保存问题。v3、温度的问题。温度增加23对细胞产生不良影响，使之在24小时之内死亡。低温对细胞影响小。v4、污染的问题。预防和避免污染是细胞培养成功的关键。17污染的预防v添加抗生素v实验时使用的器具用品消毒灭菌v操作者严格遵守操作规程v定期更换实验室及生物安全柜的滤膜v发生污染后对实验室进行彻底消毒182、流感病毒接种技术v接种前先将标本管内的棉签取出，用小镊子摘下棉签头，在管内反复挤压后弃去。v向标本管内加入抗生素放42小时。目的：抑制细菌生长。v将长成片的细胞弃去细胞生长液，用Hanks液洗2遍，
8、加入标本0.51ml，放3335恒温箱内2小时。目的：使病毒吸附在细胞上。19v弃去标本液，用Hanks液洗2遍，加入2倍于细胞生长液的病毒维持液，放3335恒温箱内培养。目的：使病毒在细胞内繁殖。v逐日观察细胞形态，当有75100%的细胞发生病变即可收获病毒。细胞病变形态包括拉丝、脱落、圆缩等。v7日仍未发生病变的视为阴性。盲传一代，仍为阴性的可报告为阴性。2021223、血凝实验v第一孔加入100l病毒液，其下各孔均加入50l生理盐水；v由第一孔开始做倍比稀释，最后一孔弃去50l液体；v每孔内加入50l 1%血球，混匀；v室温静置3060分钟观察结果。以生理盐水做阴性对照。23v血球均匀凝集为+；v血球凝集但上缘有卷边为+；v血球沉积成较大的圆环，周围有较多凝集颗粒为+；v血球沉积成较小的圆环，周围有少量凝集颗粒为+；v血球沉积成较小的圆环，周围基本没有凝集颗粒为；242526
