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1、产品经理 吴 勇HBVHBV分型和耐药突变基因检测分型和耐药突变基因检测产品经理 吴 勇一、慢性乙肝患者抗病毒治疗的临床现状一、慢性乙肝患者抗病毒治疗的临床现状二、基因芯片原理、亚能二、基因芯片原理、亚能HBVHBV分型与耐药突变基因检测分型与耐药突变基因检测三、三、HBVHBV分型与耐药突变基因检测的运用与临床意义分型与耐药突变基因检测的运用与临床意义目目 录录一、一、乙肝患者抗病毒治疗的临床现状乙肝患者抗病毒治疗的临床现状耐药耐药 指南指南 策略策略 干扰素：干扰素：普通干扰素（2a、2b、1b）、 聚乙二醇干扰素（2a、2b）核苷（酸）类药物：核苷（酸）类药物：拉米夫定、阿德福韦酯、 恩
2、替卡韦、替比夫定药物种物种类有限有限我国我国CHB治疗现状治疗现状20122012年年EASLEASL、APASLAPASL乙肝防治指南建议乙肝防治指南建议: : ETV或TDF作为单药一线用药国内难以普及国内难以普及： 强调根据情况个体化选药，患者依从性差国情国情差异差异干扰素：干扰素：PegIFN 1年病毒学应答率25%，HBeAg血 清学转换率30%，血清HBV DNA阳性率高；耐药问题耐药问题: :核苷（酸）类药物疗效效有限有限慢性乙型肝炎联合抗病毒治疗专家共识，中国肝脏病杂志，2011，3（2）：38-45耐药的危害耐药的危害导致疾病进展（病毒学反弹、生化突破等）导致疾病进展（病毒学
3、反弹、生化突破等）肝硬化和肝癌发生率高肝硬化和肝癌发生率高使已取得的疗效（如组织学改善）丧失使已取得的疗效（如组织学改善）丧失后续治疗更复杂、困难，增加医疗成本后续治疗更复杂、困难，增加医疗成本耐药毒株的传播可能导致公共卫生问题耐药毒株的传播可能导致公共卫生问题警惕警惕耐药耐药HBVHBV耐药耐药EASL Clinical Practice Guidelines :Management of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology 2012 vol.57|167-185核苷（酸）类药物耐药核苷（酸）类药物耐药的预防和
4、治疗的预防和治疗1243 33 5慢性乙型肝炎防治指南（慢性乙型肝炎防治指南（20102010年）年）严格掌握治疗适应症严格掌握治疗适应症谨慎选择核苷（酸）类药物谨慎选择核苷（酸）类药物1高危患者及时联合治疗高危患者及时联合治疗治疗中密切监视，一旦耐药尽早救援治疗治疗中密切监视，一旦耐药尽早救援治疗尽量避免单药序贯治疗尽量避免单药序贯治疗生物化学生物化学检查：血清ALT和AST、胆红素、白蛋白等乙肝乙肝实验实验室室检查检查HBVHBV血清学检查血清学检查：HBsAg、抗HBs、HBeAg等乙肝两对半HBV DNAHBV DNA、基因型和变异检测基因型和变异检测生物化学生物化学检查：血清ALT和
5、AST、胆红素、白蛋白等HBVHBV血清学检查血清学检查：HBsAg、抗HBs、HBeAg等乙肝两对半HBV DNAHBV DNA、基因型和变异检测基因型和变异检测生物化学生物化学检查：血清ALT和AST、胆红素、白蛋白等HBVHBV分型与耐药突变检测方法分型与耐药突变检测方法u PCR PCR产物直接测序法；产物直接测序法；u PCR PCR产物克隆测序法；产物克隆测序法；u 限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性技术(RFLP)(RFLP)；u 线性探针反向杂交法线性探针反向杂交法(INNO-LiPA)(INNO-LiPA)；u 基因芯片技术基因芯片技术u 限制性片段质谱多肽性分析限
6、制性片段质谱多肽性分析u 焦磷酸测序法焦磷酸测序法u 深度测序法深度测序法二、基因芯片原理、二、基因芯片原理、亚能亚能HBVHBV分型与耐药突变基因检测分型与耐药突变基因检测基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)：是多种特定的寡核苷酸序列为探针，固定于支持物表面上而成的二维DNA阵列。基本原理：基本原理：利用碱基互补配对原则，通过目的DNA与探针特异结合来判断目的DNA的序列信息。基因芯片原理基因芯片原理乙型肝炎病毒分型和耐乙型肝炎病毒分型和耐药药突突变变基因基因检测试剂检测试剂盒盒 （PCR-PCR-反向点反向点杂杂交法）交法）注册号：国食注册号：国食药监药监械（准）字
7、械（准）字20112011第第34011773401177号号专专利号：利号：国内首个全面提示核苷（酸）类药物耐药的快速诊断试剂国内首个全面提示核苷（酸）类药物耐药的快速诊断试剂 PCR PCR扩增：扩增：在S基因和P基因重叠区段设计PCR引物，PCR扩增片段既包含耐药突变位点又能进行基因分型。P P基因：耐基因：耐药药突突变检测变检测编码DNA合成酶（包含逆转录酶rt），抗病毒药物作用靶区，耐药基因突变热点区S S基因：分型基因：分型检测检测产品技术原理产品技术原理亚能亚能HBVHBV产品应用产品应用抗病毒治疗前、治疗中抗病毒治疗前、治疗中HBVHBV的基因分型和耐药突变基因检测的基因分型和
8、耐药突变基因检测u 区分我国常见的区分我国常见的HBV-BHBV-B、C C、D D基因型基因型u 涵盖我国涵盖我国4 4种核苷（酸）抗病毒药物（拉米夫定、阿德福韦酯、种核苷（酸）抗病毒药物（拉米夫定、阿德福韦酯、 替比夫定、恩替卡韦）替比夫定、恩替卡韦）7 7个耐药位点的个耐药位点的1616种突变：种突变：rtL180MrtL180M、rtM204V/rtM204V/I I、rtA181V/TrtA181V/T、rtN236TrtN236T、rtM250I/L/VrtM250I/L/V、rtS202G/rtS202G/I I、rtT184rtT184I I/S/A/F/L/S/A/F/L。本
9、产品检测的样本为本产品检测的样本为血清或血浆血清或血浆；要求待检样本的要求待检样本的HBV DNAHBV DNA载量载量1.0101.0103 3copies/mLcopies/mL。样本要求样本要求样本保存样本保存为了避免为了避免DNADNA降解，制备好的血清或血浆，避免长时间室温放置；降解，制备好的血清或血浆，避免长时间室温放置；2 28 8保存不超过保存不超过4848小时；小时；-18-18以下保存不超过半年，避免反复冻融。以下保存不超过半年，避免反复冻融。注意事项注意事项全基因序列全基因序列测测定法定法限制性片段限制性片段长长度多度多态态性性分析法（分析法（RFLPRFLP）实时荧实时
10、荧光光PCRPCR法法亚亚能能HBV HBV 基因芯片基因芯片灵敏度灵敏度灵敏度低，最低检测限为20%；灵敏，最低检测限为5%；灵敏，最低检测限为5%；灵敏，最低检测限为5%；检测检测位点位点所有突变位点已知耐药位点仅能检测rt204位点我国4种核苷类药物7个耐药位点的16种突变评评价价1、测序试剂大多未获得SFDA批准；2、操作繁琐、技术难度大、仪器要求高、不易在临床开展。1、需针对每一个待测突变位点，分别设计特异性内切酶反应体系；2、一些突变可能生成新的酶切位点，或破坏原有酶切位点，必须谨慎看待检测结果。结果仅提示拉米夫定耐药。1、是首个获得SFDA批准的，同时进行分型、耐药检测的试剂盒；
11、2、准确性好、6小时出结果、结果肉眼可见。仪器要求低，操作便捷、易于临床使用。HBVHBV耐药检测产品比较耐药检测产品比较三、三、HBVHBV分型与耐药突变基因检测分型与耐药突变基因检测的运用与临床意义的运用与临床意义HBVHBV基因型检测临床意义基因型检测临床意义u HBeAg HBeAg阳性患者中，阳性患者中，B B基因型对基因型对IFN-IFN-治疗的应答率高于治疗的应答率高于C C基因基因 型，型，A A基因型高于基因型高于D D基因型。基因型。u 与与C C基因型感染者相比，基因型感染者相比，B B基因型感染者较早出现基因型感染者较早出现HBeAgHBeAg血清学血清学 转换，较少进
12、展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；预测干扰素应答和疾病进展情况预测干扰素应答和疾病进展情况慢性乙型肝炎防治指南（慢性乙型肝炎防治指南（20102010年）年）HBVHBV耐药检测临床意义耐药检测临床意义u 抗病毒治抗病毒治疗疗前，前，预预存耐存耐药检测药检测 协助临床选择合理抗病毒药物，实现个体化抗病毒治疗、提高抗病毒疗效、降低耐药发生率。u 抗病毒治抗病毒治疗疗中，全程耐中，全程耐药监测药监测 全程监测耐药，利于早期挽救治疗，为调整治疗方案提供理论支持。选择合理抗病毒药物，为调整治疗方案提供理论依据选择合理抗病毒药物，为调整治疗方案提供理
13、论依据抗病毒治疗前抗病毒治疗前抗病毒治疗期间抗病毒治疗期间抗病毒治疗效果不佳时抗病毒治疗效果不佳时HBVHBVHBVHBV基因分型、基因分型、基因分型、基因分型、耐药检测耐药检测耐药检测耐药检测何时选择何时选择HBVHBV基因分型、耐药检测？基因分型、耐药检测？预存耐药检测，实现治疗个体化预存耐药检测，实现治疗个体化LAMLAM、ADV ADV 、ETVETV预存耐药率分别为预存耐药率分别为7.81%7.81%、7.81%7.81%、1.56%1.56%预存耐药 慢性乙型肝炎患者在核苷(酸)类似物治疗前即存在耐药位点突变，即预存耐药变异。盖洪鹏，孙伟翔，袁德胜，等，预存耐药对核苷（酸）类似物抗
14、病毒治疗应答和耐药的影响，临床肝胆病杂志，2012，28（11）：841-844预存耐药检测显著提高预存耐药检测显著提高CHBCHB患者患者 HBV DNA HBV DNA 转阴率、转阴率、HBeAg/HBeAg/抗抗HBeHBe转换率转换率盖洪鹏，孙伟翔，袁德胜，等，预存耐药对核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答和耐药的影响，临床肝胆病杂志，2012，28（11）：841-8444848周周HBeAg/HBeAg/抗抗-HBe-HBe转换率转换率P P 4848周周HBV DNA HBV DNA 转阴率转阴率P P 预存耐药检测，显著提高临床疗效预存耐药检测，显著提高临床疗效抗病毒治抗病毒治疗中的
15、中的监测( (线路路图）治疗第治疗第12周评估是否存在周评估是否存在“原发性无应答原发性无应答”病毒学应答：HBV DNA 较基线下降10IU或50拷贝/ml原发性治疗失败：HBV DNA 较基线下降 10IU或 50拷贝/ml患者依从性良好：加用更强的抗病药物患者依从性不佳：督促劝说坚持治疗治疗治疗24周评估疗效的早期预测因子周评估疗效的早期预测因子完全病毒学应答：PCR检测 HBV DNA 阴性部分病毒学应答：60IU/ml HBV DNA 2000IU/ml不充分病毒学应答：HBV DNA 2000IU/ml以同一药物继续治疗，每6个月监测一次基因屏障低的药物：加用基因变异特点不同的第二
16、种药物基因屏障高的药物：每3个月监测一次并在48周后继续监测抗病毒能力相对低的药物：每3个月监测一次并在48周后继续监测加用更强的抗病毒药物：每3个月监测一次若第48周获得完全病毒学应答，则继续治疗若第48周未获得病毒学应答，则加用一种更强且无交叉耐药的药物Keeffe，et al.Clinical Gastroenterology and Hepatology，2007，5：890897耐药基因位点变异与临耐药基因位点变异与临床挽救治疗方案床挽救治疗方案突突变变基因位点基因位点结结果模式果模式对应对应的耐的耐药药药药物物临临床挽救治床挽救治疗疗方案方案rt180M+rt204I/Vrt180
17、M+rt204I/V拉米夫定（拉米夫定（LAMLAM）1 1、加用或、加用或换换用用TDFTDF2 2、加用、加用ADVADVrt204I/Vrt204I/Vrt181V/Trt181V/T换换用用ETVETVrt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V替比夫定（替比夫定（LdTLdT）1 1、加用或、加用或换换用用TDFTDF2 2、加用、加用ADVADVrt204Irt204Irt181V/Trt181V/T换换用用ETVETVrt181V/Trt181V/T阿德福阿德福韦酯韦酯（ADVADV）1 1、加或、加或换换用用ETVETV2 2、加加用用LAMLAM、LdT(rt
18、181LdT(rt181位点未突位点未突变变者者) )rt236Trt236Trt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V或或rt204I/Vrt204I/V184184I/S/A/F/LI/S/A/F/L恩替卡恩替卡韦韦（ETVETV） 1 1、加或、加或换换用用TDFTDF 2 2、加用、加用ADVADV250I/L/V250I/L/V202G/I202G/I抗病毒治疗耐药检测节点抗病毒治疗耐药检测节点抗病毒抗病毒治疗前治疗前部分病毒学应答、不部分病毒学应答、不充分病毒学应答者充分病毒学应答者治疗治疗24周周治疗治疗12周周评估是否原评估是否原发无应答发无应答疗效早期疗效早
19、期预测预测后每后每12周监周监测一次测一次抗病毒治疗过程中效果不佳时：抗病毒治疗过程中效果不佳时： 需及时进行需及时进行HBVHBV耐药突变检测，调整用药。耐药突变检测，调整用药。预存耐药预存耐药国内首个全面提示核苷（酸）类药物耐药的快速诊断试剂；国内首个全面提示核苷（酸）类药物耐药的快速诊断试剂；6h6h全面呈现：全面呈现：4 4种核苷（酸）相关的种核苷（酸）相关的7 7个耐药位点个耐药位点1616种突变，区分种突变，区分HBV- BHBV- B、C C、D D三种基因型；三种基因型；全程监测耐药，实现治疗个体化：全程监测耐药，实现治疗个体化： 预存耐药检测预存耐药检测 个体化用药、提高临床疗效；个体化用药、提高临床疗效； 治疗第治疗第1212周、周、2424周耐药检测周耐药检测 评估抗病毒早期疗效；评估抗病毒早期疗效； 治疗效果不佳时，耐药检测治疗效果不佳时，耐药检测 及时调整治疗方案、节约成本。及时调整治疗方案、节约成本。产品总结产品总结
