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1、实验二实验二LBLB培养基制备及培养基制备及大肠杆菌的接种大肠杆菌的接种一、一、 实验目的实验目的了解LB培养基的配制方法；掌握平板划线分离法的操作方法；培养无菌观念，巩固无菌操作技术。二二. .、实验原理、实验原理平板划线分离法：是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落。原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。三三. .、实验器材、实验器材菌种：大肠杆菌 DH5培养基：LB固
2、体培养基仪器材料：超净工作台，接种针，酒精灯，封口 条，记号笔，恒温培养箱。 特点：DH5是一种经诱变的菌株；缺乏DNA 修饰，即其自身DNA不会被修饰；缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA进行切割；对青霉素敏感。 用途：基因工程受体菌。1、大肠杆（Escherichia coli ） 2、LB培养基 是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。 LB培养基的配方如下： 酵母提取物：5 g 蛋白胨： 10 g NaCl： 10 g 琼脂： 1520 g 水： 1000 mL pH
3、 7.0四、实验方法v平板划线分离法v细菌的接种方法有很多种，如划线法、涂布法、倾注法、斜面接种法、液体培养基接种法、螺旋接种法等。v平板划线分离法主要用于菌种分纯，获得单菌落。培养基灭菌培养基灭菌制作平板制作平板扩大培养扩大培养划线分离划线分离菌种保存菌种保存LB液体培养基、LB固体培养基、培养皿高压灭菌。超净工作台中，将灭菌后冷却到60左右的LB固体培养基倒入灭菌培养皿中，敞盖冷却，备用。将大肠杆菌接种到LB液体培养基中，于37摇床中震荡培养12h。以接种环取震荡培养后的菌液，在固体培养基上划线，封口。培养皿倒置与37的恒温培养箱中培养1224h，观察划线末端的菌落生长情况；用接种环挑取单
4、菌落，用划线法接种于斜面上，在37的恒温培养箱中培养24h。4的冰箱中保存 。五、实验步骤五、实验步骤1.取菌种前灼烧接种环，消灭接种环上的微生物，冷却冷却；2.用接种针挑取单菌落，迅速送入培养皿内，培养基的一边划Z线。划线时，接种针应与平板表面成30角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破；3.灼烧接种环，待接种环冷却后，转动培养皿约70角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次划线；4.灼烧接种环，待接种环冷却后，用同样方法，通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次划线部分作第四次划线；5.划线完毕后，盖上皿盖，以封口条将培养皿封好，标注日期；6.灼烧接种环；7.培
5、养皿倒置于恒温箱培养。 划线分离具体步骤：划线分离具体步骤：一区二区三区四区五区灼烧接种环灼烧接种环灼烧接种环灼烧接种环灼烧接种环 划线 （第一区域）平板倒置培养冷却挑单菌落冷却 划线 （第二区域）冷却 划线 （第三区域）冷却 划线 （第四区域）冷却 划线 （第五区域）灼烧接种环六、实验结果六、实验结果v次日观察有无单菌落出现，拍照。七、注意事项七、注意事项1.每次划线前，须灼烧接种针；2.待接种针冷却后才能接种；3.划线时不可力度过大；4.在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线；5.划线操作结束时，灼烧接种针；6.注意保持无菌操作；八、思考题八、思考题1.为什么第一次划线前要灼烧接种针？为什么其他每次划线之前都要灼烧接种针？2.在灼烧接种针之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种针吗？为什么？4.为什么每次划线操作总是从上一次划线的末端开始？
