白血病细胞遗传学

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1、 白血病细胞遗传学白血病细胞遗传学 一、白血病的细胞遗传学发展简史 虽然早在虽然早在19141914年德国学者年德国学者BoveriBoveri就提出了染色体畸变是导致肿瘤就提出了染色体畸变是导致肿瘤的基本原因的假说，可是由于受到技术的限制，长时间以来人类染色的基本原因的假说，可是由于受到技术的限制，长时间以来人类染色体的正确数目一直无法搞清楚，自然更谈不上对肿瘤开展研究了。体的正确数目一直无法搞清楚，自然更谈不上对肿瘤开展研究了。19561956年年TjioTjio和和LevanLevan通过人胚胎肺的成纤维细胞培养，终于确定人类通过人胚胎肺的成纤维细胞培养，终于确定人类染色体的正确数目为染

2、色体的正确数目为46.46.这一重要发现被公认为细胞遗传学发展史上这一重要发现被公认为细胞遗传学发展史上的第一个里程碑。的第一个里程碑。19581958年年FordFord等在一例急性白血病患者的骨髓细胞中等在一例急性白血病患者的骨髓细胞中发现有发现有4444个染色体和个染色体和1 1个断片的非整倍体异常，标志着白血病染色体个断片的非整倍体异常，标志着白血病染色体研究的开始。研究的开始。19601960年年NowellNowell和和 HungerfordHungerford在美国费城发现了在美国费城发现了2 2例慢性例慢性粒细胞白血病患者外周血标本中有小的异常染色体，这一发现迅速为粒细胞白血

3、病患者外周血标本中有小的异常染色体，这一发现迅速为许多其他学者所证实并将该异常染色体命名为许多其他学者所证实并将该异常染色体命名为PhPh染色体，即费城染色染色体，即费城染色体。这是人类肿瘤中第一个被发现的标记染色体，它激起了人们对肿体。这是人类肿瘤中第一个被发现的标记染色体，它激起了人们对肿瘤染色体研究的巨大热情，遂被公认为细胞遗传学发展史上的第二个瘤染色体研究的巨大热情，遂被公认为细胞遗传学发展史上的第二个里程碑。里程碑。 白血病的染色体研究大致经历了以下4个发展阶段： 1、非显带时期（1958-1970年） 2、显带时期（1970年后） 3、FISH时期（1980年后） 4、多色FISH

4、时期（1990年后)二、白血病的细胞遗传学研究的方法（一）标本的来源和采集 按照肿瘤染色体研究的标本必须取自肿瘤组织本身的原则，白血病的染色体研究通常以采用骨髓为宜。当外周血白细胞总数10x109/L和原、幼细胞百分比10%时，也可采用外周血细胞进行短期培养。（二）染色体的制备（二）染色体的制备 1 1、标本采集。用肝素润湿的针筒抽取骨髓、标本采集。用肝素润湿的针筒抽取骨髓2ml2ml或更多，立即注入或更多，立即注入含含16401640培养基的标本瓶中。培养基的标本瓶中。 2 2、细胞接种。将标本瓶带回实验室后，先做骨髓有核细胞计数，、细胞接种。将标本瓶带回实验室后，先做骨髓有核细胞计数，再按

5、照再按照1 122x10x106 6/ml/ml的细胞密度注入标本瓶中，将培养瓶放入的细胞密度注入标本瓶中，将培养瓶放入3737温箱温箱中持续培养中持续培养2424或或48h48h，其间定时摇匀培养物。，其间定时摇匀培养物。 3 3、阻留中期分裂相。培养瓶中加入秋水仙素，终浓度为、阻留中期分裂相。培养瓶中加入秋水仙素，终浓度为0.05ug/ml0.05ug/ml，摇匀后置，摇匀后置3737温箱中温箱中1h1h。 4 4、收获细胞。将培养物吸至尖底离心管，离心，、收获细胞。将培养物吸至尖底离心管，离心，10001000转转/min/min，10min10min。 5 5、低渗。弃上清液，沿管壁缓

6、缓加入预温至、低渗。弃上清液，沿管壁缓缓加入预温至3737的的0.075mol/L0.075mol/L的的KClKCl溶液溶液6 68ml8ml，吹打混匀后，吹打混匀后置置3737温箱中温箱中30min30min。 6 6、预固定。加入、预固定。加入3 3：1 1甲醇、冰醋酸固定液甲醇、冰醋酸固定液1ml1ml，吹打混匀。离心，吹打混匀。离心，10001000转转/min/min，10min10min。 7 7、固定。吸去上清液，加新鲜配制的、固定。吸去上清液，加新鲜配制的3 3：1 1甲醇、冰醋酸固定液甲醇、冰醋酸固定液6 68ml8ml，吹打混匀。静置至少吹打混匀。静置至少30min30m

7、in后，离心，后，离心，10001000转转/min/min，10min10min。重复固定三次，后两次静置时间至少重复固定三次，后两次静置时间至少15min15min。 8 8、制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量，从、制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量，从10cm10cm高处高处滴至冰水浸泡过的玻片上，每片三滴，然后在酒精灯上来回通过数次，滴至冰水浸泡过的玻片上，每片三滴，然后在酒精灯上来回通过数次，使其干燥。使其干燥。 9 9、显带。将玻片置于预温至、显带。将玻片置于预温至87.587.5的的 R R显带液中孵育，时间以显带液中孵育，时间以6060120min120min为为宜

8、。宜。 1010、染色。标本用、染色。标本用10%10%的的GiemsaGiemsa染色液染色染色液染色101020min20min，流水冲，流水冲洗，待干，洗，待干，镜检镜检。 采集标本采集标本采集标本采集标本 短期培养短期培养短期培养短期培养 加秋水仙素加秋水仙素加秋水仙素加秋水仙素1h1h 低渗低渗低渗低渗30min30min 预固定预固定预固定预固定 固定固定固定固定 制片制片制片制片 显带显带显带显带 染色染色染色染色三、白血病染色体畸变的临床和生物学意义 （一）克隆性染色体异常的检出有助于白血病的诊断和鉴（一）克隆性染色体异常的检出有助于白血病的诊断和鉴别诊断别诊断 特别是一些特异

9、性染色体的重排不仅有助于特别是一些特异性染色体的重排不仅有助于AMLAML和和ALLALL的鉴别，而且有助于进一步识别它们中的亚型。的鉴别，而且有助于进一步识别它们中的亚型。19851985年国际白血病形态学、免疫学和细胞遗传学分型讨论会将年国际白血病形态学、免疫学和细胞遗传学分型讨论会将特异性染色体的重排和细胞形态学特征、免疫学表型等一特异性染色体的重排和细胞形态学特征、免疫学表型等一起列为白血病诊断分型的重要指标，即以起列为白血病诊断分型的重要指标，即以MICMIC分型代替既分型代替既往单纯以细胞形态学为基础的往单纯以细胞形态学为基础的FABFAB分型。新近世界卫生组分型。新近世界卫生组织

10、织WHOWHO提出的直接用特异性染色体易位或免疫表型来命提出的直接用特异性染色体易位或免疫表型来命名白血病的亚型，这进一步凸显出了细胞遗传学和免疫学名白血病的亚型，这进一步凸显出了细胞遗传学和免疫学在白血病诊断分型中的地位和作用。在白血病诊断分型中的地位和作用。当今WHO分型将AML分为四亚型： 伴有特殊染色体的AML 伴有病态造血的AML 治疗相关的AML和MDS 不伴特殊细胞遗传易位的AML 1伴有特殊细胞遗传易位的AML （1 1）伴有）伴有t(8;21)(q22;q22)AML,t(8;21)(q22;q22)AML, AML1AML1（CBFCBF）/ETO /ETO 的的AMLAM

11、L （2 2）伴有）伴有inv(16)(p13;q22)inv(16)(p13;q22)或或 t(16;16)(p13;q22),t(16;16)(p13;q22), CBF/MYH11CBF/MYH11的骨髓嗜酸粒细胞增多的的骨髓嗜酸粒细胞增多的AMLAML （3 3）伴有）伴有t(15;17)(q22;q11-12),PML/RARt(15;17)(q22;q11-12),PML/RAR 及变异的急性早幼粒细胞白血病（及变异的急性早幼粒细胞白血病（APLAPL） （4 4）伴有）伴有11q23(MLL)11q23(MLL)异常增生的异常增生的AMLAML 2伴有多系增生异常的急性髓细胞白血

12、病 （1）有MDS或MDS/MPD病史 （2）发病前无MDS病史 3治疗相关的AML和MDS（1）与烷化剂相关（2）与DNA拓扑异构酶抑制剂相关 （一些可以是淋巴系） （3）其他 4不伴特殊细胞遗传易位的AML （1）未分化AML （2）未成熟AML （3）成熟AML （4）急性粒-单核细胞白血病 （5）急性单核细胞白血病 （6）急性红白血病 （7）急性巨核细胞白血病 （8）急性嗜碱细胞白血病 （9）伴骨髓纤维化的急性全髓增生 （10）髓细胞肉瘤（二）染色体畸变可作为监测急性白血病缓解、复二）染色体畸变可作为监测急性白血病缓解、复发和发和CMLCML急变的重要指标急变的重要指标 急性白血病最初

13、的核型异常经过治疗后完急性白血病最初的核型异常经过治疗后完全消失而代之以正常核型提示全消失而代之以正常核型提示CRCR。CRCR后原有异常后原有异常重新出现，提示白血病复发。除原有异常外，又重新出现，提示白血病复发。除原有异常外，又增添了新的异常，提示发生了克隆性核型演变，增添了新的异常，提示发生了克隆性核型演变，通常意味着疾病的进展如通常意味着疾病的进展如CMLCML加速期或急变期往往加速期或急变期往往在原有的在原有的t(9;22)t(9;22)的基础上出现的基础上出现+ph+ph、+8+8、+19+19、 i i（17q17q）、）、+21+21等异常。因此病程中反复多次染等异常。因此病程

14、中反复多次染色体检查有助于判断急白的缓解、复发和色体检查有助于判断急白的缓解、复发和CMLCML急变。急变。（三）性染色体标志可用来验证异基因骨髓移植是否成功或确定白血病复发的来源（四）染色体是独立的预后指标并有助于治疗方案的选择 诊断时的核型是急白最有价值的预后因素，它决定着患者获得CR的几率、CR持续时间和总生存期的长短。根据核型可将急白患者分为三个不同的预后亚型 与急白预后相关的细胞遗传学亚型与急白预后相关的细胞遗传学亚型 核型核型预后等级预后等级 AML ALLAML ALL低危低危 t(8;21)t(8;21)、t(15;17)t(15;17)、inv(16) 50inv(16) 5

15、0的超二倍体、的超二倍体、t t（1212；2121） 正常核型、正常核型、+8+8、+21+21、+22+22、11q2311q23 中危中危 del(9q)del(9q)、del(7q)del(7q)、del(12p)del(12p)、-y -y 正常核型、正常核型、6q6q- -、t(10;14)t(10;14)、 t(11;14)t(11;14)高危高危 -5-5、-7-7、deldel（5q5q）、）、3q3q重排、重排、 t(9;22)t(9;22)、t(8;14)t(8;14)、t(4;11)t(4;11)、 复杂异常（复杂异常（3 3种异常种异常） 亚二倍体亚二倍体/ /近单倍

16、体近单倍体 核型对治疗方案的选择也有一定的指导意义，核型对治疗方案的选择也有一定的指导意义，最典型的例子为早幼粒细胞白血病患者若发现最典型的例子为早幼粒细胞白血病患者若发现t t（1515；1717）易位或）易位或PML-RARPML-RAR 融合基因，融合基因，则则提示提示将将对对全反式全反式维维甲酸或三氧化二砷治甲酸或三氧化二砷治疗疗有良好的反有良好的反应应；反之，；反之，则疗则疗效不佳。效不佳。 t t（1212；2121）易位或高）易位或高二倍体二倍体ALLALL对左旋门冬酰胺酶和抗代谢药物为主的对左旋门冬酰胺酶和抗代谢药物为主的化疗方案反应良好。化疗方案反应良好。 t t（1 1；1

17、919）则需要更强烈的）则需要更强烈的方案方能获得较好疗效。方案方能获得较好疗效。 t t（4 4；1111）和）和t t（9 9；2222）几乎总是预后不良，需要高剂量化疗和在首）几乎总是预后不良，需要高剂量化疗和在首次次CRCR后进行异基因骨髓移植治疗。后进行异基因骨髓移植治疗。（五）染色体发现为分子生物学研究提供了重要线索 染色体易位断裂点的克隆导致一系列与白血病有关的重要基因被相继发现，这不但对于白血病的诊断及其微小残留病的检测有很大的应用价值，而且对于研究白血病的发病机制和探索新的治疗手段也有重要的理论意义。四、与FAB亚型相关的特异性染色体重排 （一）（一）t t（9 9；2222

18、）（）（q34;q11q34;q11） PhPh染色体约见于染色体约见于95%95%的的CMLCML患者，通常被认为是患者，通常被认为是CMLCML的重要诊断标志。根据的重要诊断标志。根据PhPh染色染色体的有无，可将体的有无，可将CMLCML与类白血病反应、骨髓增生综合征及与类白血病反应、骨髓增生综合征及MDSMDS相鉴别。分子生物学的研究证明，原位于相鉴别。分子生物学的研究证明，原位于9q349q34的的ABLABL原原癌基因易位到癌基因易位到22q1122q11上和上和BCRBCR基因的一部分融合，产生基因的一部分融合，产生BCR/ABLBCR/ABL融合基因，后者转录为融合基因，后者转

19、录为8.5Kb8.5Kb的的BCR/ABLBCR/ABL融合融合mRNAmRNA，最终翻译成，最终翻译成210KD210KD的蛋白质。该蛋白质具有酪氨酸激酶的的蛋白质。该蛋白质具有酪氨酸激酶的活性，它通过包括活性，它通过包括RASRAS在内的多种信号传导途径来活化癌基在内的多种信号传导途径来活化癌基因和某些细胞因子，最终导致细胞的恶性转化。因和某些细胞因子，最终导致细胞的恶性转化。 CML患者经过新近问世的BCR/ABL信号传导抑制剂STI571治疗后，100%的患者可获得完全的血液学缓解，53%的病例有细胞遗传学的反应，其中13%为完全的细胞遗传学反应。 （针对易位靶点的研究将在白血病的治疗

20、前景中发挥重要的作用。） CML CML急变期，急变期，20%20%的患者保持的患者保持4646， t t（9 9；2222）核型不变，核型不变，80%80%的患者可发生核型演变，即出现额的患者可发生核型演变，即出现额外的染色体异常以致染色体众数增加至外的染色体异常以致染色体众数增加至474750.50.最多最多见见的的额额外染色体异常按出外染色体异常按出现现的的频频率的高低依次率的高低依次为为2Ph2Ph、+8+8、i i（17q17q）、）、+19+19和和+21+21。它。它们们可可单单独或独或联联合出合出现现。染色体的。染色体的丢丢失失较较少少见见，其中，其中-7-7约见约见于于3%3

21、%的患者，多的患者，多为为急淋急淋变变。额额外异常通常比外异常通常比临临床和床和血液学急血液学急变变征象早出征象早出现现2424个月，因此个月，因此CMLCML病程中病程中定期定期进进行染色体行染色体检测检测有助于早期有助于早期诊诊断断CMLCML急急变变。CML t(9;22),-Y （二）（二）t t（8 8；2121）（）（q22;q22q22;q22） 该易位和该易位和AML-M2AML-M2有特别有特别的联系（的联系（92%92%为为AML-M2 AML-M2 ，7%7%为为AML-M4AML-M4，个别为，个别为AML-AML-M1M1）分子生物学研究揭示该易位导致原位于）分子生物

22、学研究揭示该易位导致原位于21q2221q22的的AML1AML1基因易位到基因易位到8q228q22上和位于该处的上和位于该处的ETOETO基因并置，形成基因并置，形成AML1-AML1-ETOETO融合基因。融合基因。AML1AML1系核心结合因子（系核心结合因子（CBFCBF）的）的a a亚单位。亚单位。正常情况下，它和正常情况下，它和CBFCBF 亚单亚单位位结结合，形成异二聚体的合，形成异二聚体的转录转录因子，从而因子，从而调节许调节许多与髓系多与髓系细细胞的生胞的生长长和分化有关的基因的和分化有关的基因的表达。表达。 AML1-ETOAML1-ETO融合基因通过对残存的正常的融合基

23、因通过对残存的正常的CBF CBF a/a/ 转转录录因子的因子的显显性性负调负调控作用，干控作用，干扰扰了有关基因的表达，最了有关基因的表达，最终导终导致致细细胞的胞的恶恶性性转转化。化。 （三）（三）t t（1515；1717）（）（q22;q21q22;q21） 该易位只见于早幼粒细该易位只见于早幼粒细胞白血病，即胞白血病，即AML-M3AML-M3。约。约85%85%的的AML-M3AML-M3包括粗颗粒型和细包括粗颗粒型和细颗粒型均可检出颗粒型均可检出t t（1515；1717），因而成为该型白血病高度特），因而成为该型白血病高度特异的细胞遗传学标志。分子遗传学研究揭示原位于异的细胞

24、遗传学标志。分子遗传学研究揭示原位于17q17q上的上的维甲酸受体维甲酸受体a a基因（基因（RARaRARa）易位到）易位到15q15q上和位于上和位于该处该处的早幼粒的早幼粒细细胞白血病基因（胞白血病基因（PMLPML）融合，形成）融合，形成PML- RARaPML- RARa融合基因。正融合基因。正常情况下，常情况下，PMLPML显显示示类类似似肿肿瘤抑制基因的活性，瘤抑制基因的活性， RARaRARa则则有促有促进进分化和抑制生分化和抑制生长长的活性。的活性。 PML- RARaPML- RARa融合蛋白既破坏了核融合蛋白既破坏了核体的正常体的正常结结构，又通构，又通过过与与PMLPM

25、L或其他的或其他的维维甲酸甲酸结结合蛋白形成合蛋白形成稳稳定的异源二聚体，从而定的异源二聚体，从而对对野生型的野生型的PMLPML和和RARaRARa等位基因起等位基因起显显性的性的负调负调控作用，最控作用，最终导终导致致细细胞的胞的恶恶性性转转化。化。 临临床上凡具有床上凡具有t t（1515；1717）易位或）易位或PML- RARaPML- RARa融合基因融合基因的的AML-M3AML-M3病例病例应应用全反式用全反式维维甲酸治甲酸治疗疗有效，反之有效，反之则则无反无反应应，表明表明t t（1515；1717）的有无对）的有无对AML-M3AML-M3的治疗有指导作用。的治疗有指导作用

26、。 （19881988年我国学者王振义在国际上首先成功应用全反年我国学者王振义在国际上首先成功应用全反式维甲酸（式维甲酸（ATRAATRA）治疗急性粒细胞性白血病（）治疗急性粒细胞性白血病（APLAPL），不），不仅取得了很高的完全缓解仅取得了很高的完全缓解(CR)(CR)率，而且不诱发率，而且不诱发DICDIC，不引，不引起骨髓抑制，开辟了一条有别于联合化疗诱导治疗起骨髓抑制，开辟了一条有别于联合化疗诱导治疗APLAPL的的新途径。由于费用低廉，使用方便等优点，新途径。由于费用低廉，使用方便等优点，ATRAATRA是目前是目前公认的诱导治疗公认的诱导治疗APLAPL的首选药物的首选药物 ）

27、（四）（四）invinv（1616）（）（p13q22p13q22） 该易位约见于该易位约见于8%8%的的AMLAML和和25%25%的的AML-M4AML-M4患者。分子生物学研患者。分子生物学研究揭示究揭示invinv（1616）导致原位于）导致原位于16p1316p13上的平滑肌肌上的平滑肌肌球蛋白重链基因（球蛋白重链基因（MYH11MYH11）和位于）和位于16q2216q22上上CBFCBF 基因断裂后并置在一起，形成基因断裂后并置在一起，形成CBFCBF -MYH11-MYH11融合融合基因。与基因。与AML1-ETOAML1-ETO融合基因一融合基因一样样， CBFCBF - -

28、MYH11MYH11由于阻断了由于阻断了CBF CBF a/a/ 的的转录转录激活功能而激活功能而导导致关致关键键靶基因表达靶基因表达诱导诱导的阻断。的阻断。 （五）（五）t/delt/del（1111）（）（q23q23） 该异常和单核细胞该异常和单核细胞白血病有特别的联系，约见于白血病有特别的联系，约见于22%22%的的AML-M5AML-M5。它。它可以是单独缺失，也可以是易位，后者常涉及可以是单独缺失，也可以是易位，后者常涉及11q2311q23，而其，而其“ “对手对手” ”染色体则不固定，约有染色体则不固定，约有5454种之多。分子生物学研究揭示，所有这些融合蛋种之多。分子生物学研究揭示，所有这些融合蛋白都导致原位于白都导致原位于11q23 11q23 的的MLLMLL基因的激活区缺失，基因的激活区缺失，干扰了野生型的干扰了野生型的MLLMLL基因对其下游基因对其下游HOXHOX基因表达基因表达的调节，从而导致白血病的发生。的调节，从而导致白血病的发生。