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1、生物制药技术生物制药技术蔡谨蔡谨，13857136417（676417）C浙江大学玉泉校区教十5212室Chapter5GeneMedicine(genetherapy)1.概念概念基因：染色体上的基因：染色体上的DNA片段，是片段，是遗传信息结构和功能遗传信息结构和功能 的基本单位。的基本单位。基因基因 决定决定 生老病死生老病死 控制控制 高矮胖瘦高矮胖瘦 影响影响 喜怒哀乐喜怒哀乐基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。一一.概述概述基因与疾病基因与疾病基因与人类的疾病密切相关：基因与人类的疾病密切相关：基因与人类的疾病密切相关：基因与
2、人类的疾病密切相关：遗传病是由于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致; ;肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变, ,包括癌基因激活或抑包括癌基因激活或抑包括癌基因激活或抑包括癌基因激活或抑癌基因失活癌基因失活癌基因失活癌基因失活; ;高血压高血压高血压高血压, ,糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变; ;由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关由病原
3、体所致的传染病也和人体基因密切相关由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关, ,存在存在存在存在易感人群和耐受人群易感人群和耐受人群易感人群和耐受人群易感人群和耐受人群. .基因药物：将具有治疗作用的基因重组进真核表达载体，直接转移到人体细胞，表达出具有治疗作用的蛋白质和多肽，从而达到治疗作用的新方法。 TheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumanTheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumandiseasedisease Byin
4、troductionofgeneticByintroductionofgenetic materialintotargetcellsinordertomaterialintotargetcellsinordertocounteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunctioncounteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunction“Youmayneverhavetopurifyaprotein,ormanufactureadrug,youjusthavetomakethevectorand
5、getintothepatient.Whybothermarketingit?Youcanjustletthecelldoit.”Prof.JumWilsome,美国基因治疗中心主任基因治疗的必要条件基因治疗的必要条件UnderstandingofthediseaseprocessStructure/functionofgenetobeintroducedEfficientdeliveryofgenecontrolofgeneexpressionPrevention/controlofimmuneresponsesAnimalmodelandassessmentoffunctionClinic
6、altrial研究基因治疗的三个基本步骤研究基因治疗的三个基本步骤寻找适当的靶细胞寻找适当的靶细胞导入目的基因导入目的基因基因表达基因表达分类生殖细胞基因治疗（germlinegenetherapy）生殖细胞或早期胚胎细胞体细胞基因治疗(somatic-cellgenetherapy)体细胞体细胞基因治疗始终需要考虑的问题体细胞基因治疗始终需要考虑的问题基因转移的效率基因转移的效率治疗的特异性治疗的特异性基因表达的持久性及其调节基因表达的持久性及其调节治疗的毒副作用治疗的毒副作用什么疾病什么疾病什么基因什么基因什么载体什么载体什么靶器官和靶细胞什么靶器官和靶细胞什么基因导入方法什么基因导入方法
7、二、基因治疗和传统的基因工程的区别二、基因治疗和传统的基因工程的区别二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的“目的基因目的基因”。基因工程：基因工程：目的基因目的基因载体载体导入大肠杆导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋体外表达所需要的蛋白白经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品蛋白纯品,最终是制造出一种蛋白类的药物。最终是制造出一种蛋白类的药物。基因治疗基因治疗目的基因目的基因载体载体导入导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要
8、的蛋白的蛋白达到治病的目的。达到治病的目的。基因治疗在技术上一旦成功基因治疗在技术上一旦成功,其优势：其优势：制品为基因及其载体，非基因表达蛋白制品为基因及其载体，非基因表达蛋白产物产物,不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺生产成本远远低于基因工程产品生产成本远远低于基因工程产品从理论上讲从理论上讲,凡能治病的基因，都有可能开发凡能治病的基因，都有可能开发成为成为“药物药物”半衰期半衰期多肽药物多肽药物基因药物基因药物产物产物多肽蛋白质多肽蛋白质基因基因载体载体无信号肽无信号肽有信号肽有信号肽宿主细胞宿主细胞大肠杆菌大肠杆菌酵母等酵母等人体细胞（体内）人体细胞（体内
9、）转染转染容易容易难难生产工艺生产工艺复杂复杂较简单较简单纯化纯化复杂复杂较简单较简单成本成本高高较经济较经济稳定性稳定性低低高高保存保存难难易易半衰期半衰期短短长长用法用法长期注射长期注射一次性注射一次性注射副作用副作用高高低低但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能定入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入
10、人体后，必须能向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。够控制它的表达。因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。学等多种学科知识和技术的高度综合。三、基因治疗的主要策略三、基因治疗的主要策略GenereplacementGeneaugmentationtherapy(GAT)Genecorrection(Chimeraplasty)TargetedkillingofspecificcellsTargetedinhibitio
11、nofgeneexpression(Geneablation)Genereplacement:DeficientgenecorrectedbyreplacingthemutatedDeficientgenecorrectedbyreplacingthemutatedallelewithanintactallele;usedforthetreatmentofallelewithanintactallele;usedforthetreatmentofautosomalautosomaldominantdisorders.dominantdisorders.Thestrategiesareasfol
12、lows:Thestrategiesareasfollows:a)a)kockoutkockoutmutationbysinglecrossing-overmutationbysinglecrossing-over( (insertionalinsertionalinactivation)inactivation)b)genereplacementbydouble(reciprocal)crossing-b)genereplacementbydouble(reciprocal)crossing-overoverc)targetgeneinhibitionindominantnegativege
13、neticc)targetgeneinhibitionindominantnegativegeneticdisorders;usuallymutatedproteinswhichinteractdisorders;usuallymutatedproteinswhichinteractwithnormalcellularproteinstocreatealteredwithnormalcellularproteinstocreatealteredproperties;mutationalinactivationoftheonemutatedproperties;mutationalinactiv
14、ationoftheonemutatedcopywillalleviatethismutantphenotype;thecopywillalleviatethismutantphenotype;themutationcanbecarriedoutbymutationcanbecarriedoutbyinsertionalinsertionalinactivation,inactivation,ororantisenseantisensetechnology.technology.GeneAugmentationTherapy(GAT)Fordiseasescausedbylossofgenef
15、unctionmorecopiesofnormalgeneraiselevelsofgeneproductrestorenormalphenotypeApplyto:monogenicrecessivediseasescysticfibrosis,haemophilia,musculardystrophyGeneCorrection-Chimeraplastytumour celltkthymidinekinasegeneviralvectorganciclovirganciclovirphosphateTargetedKillingGeneticPro-drugActivationThera
16、pyTargetedinhibitionofgeneexpressionRibozymes-cancleave(orrepair)mRNATriplehelixoligonucleotides-blockgenetranscriptionAntisenseoligos-blockmRNAtranslationAll gene therapy strategies dependon getting the gene or genetic material into the target cells! 治疗方式治疗方式矫正性基因治疗矫正性基因治疗基因置换（genereplacement）基因矫正(
17、genecorrection)基因增强(geneaugmentation)调控性基因治疗调控性基因治疗调控基因的表达来达到改善疾病的目的（1）反义技术A）反义基因到载体，耙细胞到反义RNA，封闭mRNA的翻译B)合成反义寡聚脱氧核苷酸，化学修饰导入体内，胞吞与DNA结合形成核苷酸三聚体，与转录因子结合，转录不能启动；或与mRNA结合形成RNA-DNA杂链，影响基因的表达。C）核酶）核酶具有催化作用的RNA分子，能催化切割降解异常表达基因的RNA分子，已经设计出特殊的核酶。（2）通过其他基因的代偿作用弥补缺陷基因的功能。四.基因转移体系若干相关术语：若干相关术语：Transfection转染转染
18、：过去：将病毒过去：将病毒DNA或或RNA转入细胞。转入细胞。现在：将外源现在：将外源DNA转入动物细胞。转入动物细胞。DNATransfer转移：基因导入或转移广义的概念。转移：基因导入或转移广义的概念。Transduction转导：噬菌体介导的细菌之间的基转导：噬菌体介导的细菌之间的基因因转移。转移。Transformation转化：将裸转化：将裸DNA或质粒导入原核或质粒导入原核和真核细胞。和真核细胞。转移途径1）exvivo法，体外途径体外途径。体外基因导入人体细胞，再将细胞植入人体。经典，安全，效果较易控制，对基因转移效率要求不高，但步骤多，复杂，难度大。2)invivo法，体内途径
19、体内途径。将含治疗基因的重组载体直接植入体内。操作简单，容易推广，但对基因转移技术要求高。a a aaa aEx-vivoIn-vivotopicaldeliveryIn-vivosystemicdeliveryVExamples:-bonemarrow-livercells-skincellsExamples:-brain-muscle-eye-joints-tumorsExamples:-Intravenous-intra-arterial-intra-peritonealTHREEclassesofanatomicalgenedelivery基因治疗过程中的基因转移方法基因治疗过程中的基
20、因转移方法Viral vectorsNon-viral vectorsPhysical methods目前最有效的是病毒载体，但存在目前最有效的是病毒载体，但存在插入大小有限、免疫原性强和生产插入大小有限、免疫原性强和生产难等局限难等局限1、病毒载体类型、病毒载体类型反转录病毒（反转录病毒（RV）载体载体retrovirus腺病毒（腺病毒（AV）载体载体adenovirus 腺相关病毒（腺相关病毒（AAV）载体载体Adeno-associatedvirus单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）载体载体herpessimplexvirus 慢病毒（慢病毒（lentivirus)载体等载体等对载体的
21、基本要求：对载体的基本要求：特异并有效的基因转移特异并有效的基因转移特异、高效、持续性表达，具有可控性特异、高效、持续性表达，具有可控性免疫原性低免疫原性低易于生产易于生产载体特征载体特征：reproducibility stablepropagatedpurifiedtohightitersmediatedtargeteddelivery基因治疗病毒载体比较基因治疗病毒载体比较 RV AV AAV HSV LVRV AV AAV HSV LV基因组成基因组成 ssRNAssRNA dsDNAdsDNA ssDNAssDNA dsDNAdsDNA dsRNAdsRNA基因组长度基因组长度 10
22、 10kb 36kb 5kb 152kb 10kbkb 36kb 5kb 152kb 10kb装载容量装载容量 8 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kbkb 8kb 4.5kb 30kb 9kb病毒滴度病毒滴度 10107 7 10101111 10108 8 10108 8 10108 8感染细胞谱感染细胞谱 窄窄 宽宽 宽宽 窄窄 宽宽感染能力感染能力 中中 很强很强 强强 强强 中中整合能力整合能力 有有 无无 有有 无无 强强毒性作用毒性作用 遗传毒遗传毒 细胞毒细胞毒 遗传毒遗传毒 细胞毒细胞毒 遗传毒遗传毒免疫原性免疫原性 弱弱 中等中等 弱弱 强强 弱弱病病毒毒型型载载体
23、体逆转录逆转录病毒病毒腺病毒腺病毒疱疹病毒疱疹病毒腺相关腺相关病毒病毒慢病毒慢病毒优点优点: :安全，对人体低病原性安全，对人体低病原性针对增殖的细胞针对增殖的细胞长期稳定表达长期稳定表达外源基因插入能力适中。外源基因插入能力适中。缺点缺点: : 导入率低导入率低随机整合到宿主细胞，有插随机整合到宿主细胞，有插入性基因突变或癌变的危险入性基因突变或癌变的危险无导向性。无导向性。优点优点: :高效导入、高滴度高效导入、高滴度非增殖细胞也能非增殖细胞也能导入，对遗传、代谢病有利导入，对遗传、代谢病有利基因插入能基因插入能力强（力强（30kb30kb） 宿主广泛宿主广泛缺点缺点: :有严重的免疫反应
24、。有严重的免疫反应。 无导向性无导向性优点优点: :无细胞毒性，无免疫反应无细胞毒性，无免疫反应 转导稳定，转导稳定，长期表达长期表达具有在特定位点整合的潜力，导具有在特定位点整合的潜力，导入基因后可特殊表达入基因后可特殊表达个体小，可广泛分布。个体小，可广泛分布。缺点缺点: :可做到高滴度可做到高滴度, ,但包装困难但包装困难有随机整合有随机整合的可能的可能基因插入量有限（基因插入量有限（5kb5kb）优点优点: :有嗜神经性，可用于神经系统疾病有嗜神经性，可用于神经系统疾病有环有环状分子形式的潜伏状态状分子形式的潜伏状态基因插入容量大。基因插入容量大。缺点缺点: :细胞毒性和免疫原性不细胞
25、毒性和免疫原性不 定定潜伏期潜伏期HSV-1HSV-1可能回复突变为野生型可能回复突变为野生型, ,导致脑炎或死亡导致脑炎或死亡优点优点: :能转导神经细胞能转导神经细胞中等插入量。中等插入量。缺点缺点: :随机整合随机整合可能回复突变为野生型可能回复突变为野生型。retrovirusadenovirusHSVAAVlentivirus反反转录病毒载体基因转移系统转录病毒载体基因转移系统辅助细胞辅助细胞: : 将含有病毒结构基因但缺将含有病毒结构基因但缺失了顺式包装信号的缺陷型失了顺式包装信号的缺陷型反反转录病转录病毒导入哺乳动物细胞（毒导入哺乳动物细胞（2 2 ，PA317PA317，CRI
26、PCRIP）。可产生病毒包装蛋白但可产生病毒包装蛋白但不产生病毒颗粒；不产生病毒颗粒；反反转录病毒载体转录病毒载体: :以外源目的基因替换以外源目的基因替换病毒结构基因病毒结构基因, ,含病毒包装信号含病毒包装信号辅助细胞提供载体包装蛋白，使后者辅助细胞提供载体包装蛋白，使后者产生含外源目的基因的病毒颗粒产生含外源目的基因的病毒颗粒缺陷型的反转录病毒颗粒的缺陷型的反转录病毒颗粒的RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达外宿主细胞的染色体上，可稳定表达外源基因。源基因。反转录病毒只能感染处于增殖期反转录病毒只能感染处于增殖期的细胞。的细
27、胞。反转录病毒安全性问题反转录病毒安全性问题病毒感染的可能性病毒感染的可能性病毒在靶细胞基因组整合可导致病毒在靶细胞基因组整合可导致:破坏细胞正常生长必需的抑癌基因破坏细胞正常生长必需的抑癌基因LTR激活原癌基因激活原癌基因染色体重排激活原癌基因染色体重排激活原癌基因腺相关病毒（腺相关病毒（AAV）载体：载体：4.7kb单链单链DNA，结构为结构为ITR-rep-cap-ITR，病毒基因组简病毒基因组简单，易于消除，可降低细胞毒性和单，易于消除，可降低细胞毒性和T-淋巴细淋巴细胞反应的危险性；病毒胞反应的危险性；病毒DNA可在人可在人19号染色号染色体上进行位点特异性整合，需要辅助因子出体上进
28、行位点特异性整合，需要辅助因子出现才复制；其现才复制；其Rep蛋白可能介导这种定向整蛋白可能介导这种定向整合宿主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏合宿主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持续半年以上。续半年以上。但但AAV载体接纳的外源载体接纳的外源DNA小于小于4.5kb，载体整合效率较低，制备困难载体整合效率较低，制备困难HSV病毒病毒双链双链DNA,包括包括:HSV-1,2,VZV,EB,CMV.主要以主要以HSV-1型为主型为主.HSV载体含包装信号载体含包装信号,复制复制位点等顺序结构位点等顺序结构,HSV病毒启动
29、子病毒启动子,目的基因表目的基因表达框架达框架.由辅助病毒共转染辅助细胞由辅助病毒共转染辅助细胞M64A,制备制备重组病毒重组病毒.辅助病毒的改造辅助病毒的改造:IE3温度敏感突变型温度敏感突变型;缺失突变型缺失突变型:IE3缺失缺失;应用应用:感染心肌细胞感染心肌细胞,神经元神经元,神经胶质细胞神经胶质细胞.VEGF-血管形成血管形成;脑肿瘤脑肿瘤;帕金森病帕金森病Lentivirus（慢病毒载体）慢病毒载体）优点优点:感染非分裂细胞感染非分裂细胞，有，有RV优优势势结构结构:LTR-gag-pol-env-LTRTARtat,rev,tev应用应用:宿主广泛宿主广泛;艾滋病基因治疗艾滋病基
30、因治疗问题问题:安全性安全性2 2、非病毒及物理方法、非病毒及物理方法脂质体介导法脂质体介导法磷酸钙转染法磷酸钙转染法机械法（显微注射、基因枪等）机械法（显微注射、基因枪等）DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene(聚凝胺聚凝胺)转染法转染法电穿孔法电穿孔法超声波辅助法超声波辅助法纳米材料等纳米材料等中性脂质体中性脂质体由脂类形成的可高效包装由脂类形成的可高效包装DNA的人造的人造单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入细胞，操作简单细胞，操作简单，转染效率可高达，转染效率可高达50
31、%，可用于体内试验，但目的基因表达不稳，可用于体内试验，但目的基因表达不稳定定阳离子脂质体：阳离子脂质体：阳离子脂质体在水中可阳离子脂质体在水中可形成大小约形成大小约100-400nm单层脂质体。其单层脂质体。其带正电，带负电的带正电，带负电的DNA可自动结合到带可自动结合到带正电的脂质体正电的脂质体上，形成上，形成DNA-DNA-阳离子脂质阳离子脂质体复合物，与细胞膜作用使体复合物，与细胞膜作用使DNA进入细进入细胞。在该系统胞。在该系统体内基因导入效率低，且体内基因导入效率低，且无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注射外，其前景仍存在问题。射外，其前景仍存在问
32、题。磷酸钙转染法：磷酸钙转染法：将氯化钙、目的将氯化钙、目的DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有DNA的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷酸钙酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜，通过复合物粘附到细胞膜，通过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过程简单有效程简单有效，适用于贴壁、非贴壁细，适用于贴壁、非贴壁细胞，转染效率可达胞，转染效率可达20%左右，但目的左右，但目的基因表达不稳定基因表达不稳定机械法机械法如显微注射和基因枪（如显微注射和基因枪（biolisticparticle）。）。显微注射使用一根细针头将外源显微注射
33、使用一根细针头将外源DNA直接转直接转入受体细胞核。基因枪使用高压入受体细胞核。基因枪使用高压DNA分子导分子导入细胞。入细胞。基基因因枪枪工工作作原原理理显显微微注注射射电穿孔法电穿孔法通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导目的中转导目的DNA。细胞悬浮液置于电场细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。或更高）的毒性。DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene转
34、染法转染法带正电的带正电的DEAE-葡聚糖或葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的外源多聚体复合物和带负电的外源DNA分子分子作用，使得作用，使得DNA可以结合在细胞表面。可以结合在细胞表面。通过使用通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克或甘油获得的渗透休克将外源将外源DNA导入。两种试剂都已成功用导入。两种试剂都已成功用于转染。于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。葡聚糖仅限于瞬时转染。裸裸DNA基因转移和治疗基因转移和治疗进展进展展望展望裸裸DNA肌肉注射，活体转移肌肉注射，活体转移非病毒基因转移越来越重要非病毒基因转移越来越重要电击促进质粒电击促进质粒DNA进入肌肉皮肤进入肌肉
35、皮肤未来几年遗传病临床试验将首选血友病未来几年遗传病临床试验将首选血友病血管内导入质粒血管内导入质粒DNA，肝细胞基因转移肝细胞基因转移Duchenne肌营养不良，关节炎等肌营养不良，关节炎等尾静脉导入尾静脉导入pDNA，简单有效，转染大、简单有效，转染大、啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表小鼠肝细胞小鼠肝细胞达状况和基因治疗方法广泛应用达状况和基因治疗方法广泛应用pDNA表达载体可高水平持续表达表达载体可高水平持续表达血管内裸血管内裸DNA导入为细胞有效涉入导入为细胞有效涉入pDNARNAi将在基因治疗领域中成为重要手将在基因治疗领域中成为重要手裸裸DNA导入法
36、已经在临床研究（导入法已经在临床研究（PAOD，段段外周动脉闭锁症）外周动脉闭锁症）SiRNA可通过血管内基因转移法有效导入可通过血管内基因转移法有效导入Knockout小鼠小鼠基因治疗载体的发展趋势基因治疗载体的发展趋势综合病毒载体与非病毒载体的优势综合病毒载体与非病毒载体的优势,构建构建杂种病毒载体杂种病毒载体其需要达到的境界：其需要达到的境界：靶向性进入特异细胞靶向性进入特异细胞表达持久、可控、安全、高效表达持久、可控、安全、高效商业化定做（商业化定做（tailormade)依据特异的治疗依据特异的治疗依据不同个体依据不同个体五五. .细胞的选择细胞的选择体外基因治疗靶细胞的基本要求体外
37、基因治疗靶细胞的基本要求：1.1.应来自受治者。应来自受治者。2.2.可以或容易从体内获得。可以或容易从体内获得。3.3.容易在体外培养和大量扩增。容易在体外培养和大量扩增。4.4.易被重组基因转染。易被重组基因转染。5.5.输回体内能确保携带的目的基因稳定表达。输回体内能确保携带的目的基因稳定表达。6.6.能在体内存活一段时间。能在体内存活一段时间。7.7.不影响临近组织的正常生理功能。不影响临近组织的正常生理功能。基因治疗常用细胞基因治疗常用细胞1.骨髓细胞骨髓细胞造血干细胞造血干细胞。优点优点：源自造血干细胞的细胞遍源自造血干细胞的细胞遍布全身，几乎存在于所布全身，几乎存在于所有有器官组
38、织，可治疗一些与器官组织，可治疗一些与其不直接相关的疾病。其不直接相关的疾病。有些遗传病直接与其有关有些遗传病直接与其有关。缺点缺点：改造的细胞很少。改造的细胞很少。治疗基因在细胞中表达的治疗基因在细胞中表达的时间太短。时间太短。干细胞分化导致基因失活。干细胞分化导致基因失活。有些遗传病与造血干细有些遗传病与造血干细胞胞完全无关完全无关特点：特点：可分化为成骨细胞、可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪或肌软骨细胞、脂肪或肌肉细胞、神经胶质细肉细胞、神经胶质细胞等，也可分化为造胞等，也可分化为造血干细胞和基质细胞血干细胞和基质细胞。可利用定向分化的生可利用定向分化的生长因子转入干细胞，长因子转入干细
39、胞，促进其定向分化促进其定向分化。 骨髓间质细胞（骨髓间质细胞（MSCs）生骨生骨生骨生骨细胞细胞细胞细胞2.非造血干细胞非造血干细胞成肌细胞成肌细胞可分化可分化为心肌、心肌、骨骼肌。骨骼肌。肝脏细胞肝脏细胞以以肝脏细胞为靶细胞可治疗代谢相关疾肝脏细胞为靶细胞可治疗代谢相关疾病和肝癌、慢性病毒性肝炎等病和肝癌、慢性病毒性肝炎等神经细胞神经细胞以以神经细胞为靶细神经细胞为靶细胞可疗神经系统相胞可疗神经系统相关疾病如帕金森病关疾病如帕金森病和脑外伤等和脑外伤等 神经干细胞的分化神经干细胞的分化 可可治治疗疗遗遗传传性性皮皮肤肤病病 角角质质形形成成细细胞胞 成成纤纤维维细细胞胞 上皮细胞上皮细胞
40、内皮细胞内皮细胞3.3.人体淋巴细胞人体淋巴细胞人体的淋巴干细胞在体内人体的淋巴干细胞在体内 寿命可长达几年。基因治寿命可长达几年。基因治 疗用的淋巴细胞一般为疗用的淋巴细胞一般为T T 细胞（细胞（B B细胞寿命太短）。细胞寿命太短）。4.4.肿瘤细胞。肿瘤细胞。六.基因治疗的耙向问题安全性和有效性：基因在体内表达的空间，时间的精确定位，表达水平的调控。目的基因表达空间的定位靶向载体（Targetingvectors）靶向转录(TranscriptionalTargeting)靶向载体（Targetingvectors）1)受体介导的基因转移2）靶向反转录病毒载体靶向转录将外源基因置于具有组
41、织特异性的启动子的下游，只有特定组织细胞中的转录因子才能与这些启动子作用并激活转录，从而实现目的基因的选择性表达。目的基因表达时序的调控目的基因表达时序的调控采用可被内源或外源因素诱导活化的启动子采用可被内源或外源因素诱导活化的启动子来指导目的基因的表达来指导目的基因的表达；早期生长因子启动子(early growth factor, egr-1)能被辐射诱导激活，并进行不连续的表达，通过照射的精确定位，可使启动子控制的目的基因在空间和时序上定位表达。利用基因开关来激活或关闭目的基因表达利用基因开关来激活或关闭目的基因表达目的基因表达水平的调控多数组织特异性启动子为组成型启动子，转录活性低；V
42、P16为基础的转录激活系统来放大组织特异型启动子的作用七七.基因药物的靶器官基因药物的靶器官1.骨骼肌含量丰富；“永生性”细胞，没有明显的细胞更替；细胞长体积大，细胞膜面积大；多核细胞（300多个细胞核），有利于的基因核转移专施收缩的“非生命”器官，相对安全含溶酶体少，DNA降解少，基因表达时间长血流丰富，基因产物可释放入血液中，有远程效果2.呼吸道和肺雾化基因3.皮肤4.其他途径八八基因治疗的治疗案例基因治疗的治疗案例一一. .单基因缺乏症单基因缺乏症世界上第一例基因治疗临床实验于世界上第一例基因治疗临床实验于1990年年9月月展开，展开，患者为两个患有患者为两个患有ADAADA缺乏症的儿童
43、缺乏症的儿童。 ADAADA缺乏症缺乏症：是一种由于：是一种由于腺苷脱氨腺苷脱氨酶酶（ADAADA）缺陷缺陷而引起的而引起的严重的重的联合免疫缺陷合免疫缺陷症。症。中国首例基因治疗于中国首例基因治疗于1991年年8月展开，患者为月展开，患者为两例患血友病乙的儿童。两例患血友病乙的儿童。 血友病乙：是一种由于遗传性血友病乙：是一种由于遗传性IX因子缺乏而引起的凝因子缺乏而引起的凝血障碍性疾病。血障碍性疾病。二、肿瘤的基因治疗二、肿瘤的基因治疗目前，进入临床试验的基因疗法有目前，进入临床试验的基因疗法有70%是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，但代表了癌
44、症治疗的方向。但代表了癌症治疗的方向。恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基因大致可归为三类：细胞因子类；杀伤性基因大致可归为三类：细胞因子类；杀伤性基因类，以疱疹病毒因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；以为代表；以p53为代表的抑癌基因及反为代表的抑癌基因及反义癌基因类。义癌基因类。2003年年10月月16日，全世界第一个基因日，全世界第一个基因治疗药物治疗药物p53腺病毒注射液由中国国腺病毒注射液由中国国家药品监督管理局颁发新药证书！家药品监督管理局颁发新药证书！常见癌症治疗方案常见癌症治疗方案外源性基因替补疗法外源性基
45、因替补疗法输注外源性抑癌基因输注外源性抑癌基因p53可抑制或杀灭癌细胞。可抑制或杀灭癌细胞。抗原基因导入疗法抗原基因导入疗法将组织相容复合体基因转移给肿瘤细胞，在肿瘤将组织相容复合体基因转移给肿瘤细胞，在肿瘤细胞表面大量表达，与肿瘤抗原结合形成复合抗原，细胞表面大量表达，与肿瘤抗原结合形成复合抗原，从而暴露出从而暴露出“靶点靶点”被免疫细胞识别和消灭被免疫细胞识别和消灭反义基因疗法反义基因疗法以癌基因以癌基因DNA的有义链为模板合成出反义链，将其的有义链为模板合成出反义链，将其转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌细胞增殖。细胞增殖。自
46、杀基因疗法自杀基因疗法将自杀基因（又称前药转换酶基因如胸苷激酶将自杀基因（又称前药转换酶基因如胸苷激酶tk基因基因和胞嘧啶脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶CD基因等基因等）,导入癌细胞内，使癌细胞导入癌细胞内，使癌细胞死亡。死亡。细胞因子基因导入疗法细胞因子基因导入疗法将白细胞介素将白细胞介素II、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细胞内，增强这些细胞的抗癌作用。胞内，增强这些细胞的抗癌作用。
47、目前癌症基因治疗的研究大多是在观察毒副目前癌症基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的反应为主的期临床试验，极少数进入期临床试验，极少数进入/期临期临床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为
48、一种新的肿瘤会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。要的组成部分。三三病毒性肝炎的基因治疗病毒性肝炎的基因治疗病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗在机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗
49、在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。程度。病毒性肝炎基因治疗病毒性肝炎基因治疗最近部分工作最近部分工作XuRetal”MoleculartherapeuticsofHBV”CurrGeneTher.2003Aug;3(4):341-55.病毒学杂志病毒学杂志.2003Mar;17(1):81-4.DingCLetal“
50、ExpressionofHBcAgineukaryoticcellsbyretroviralvectormediatedgenetransfer”中华实验和临床病中华实验和临床病毒学，毒学，2003Mar;17(1):81-4.KleinCetal“InhibitionofhepatitisBvirusreplicationinvivobynucleosideanaloguesandsiRNA”Gastroenterology.2003Jul;125(1):9-18HanJQetal“ApproachtotransforminghepatitisBvirusasagenetherapeutic
51、vector”中华肝脏病杂志中华肝脏病杂志2003,Jun;11(6):344-6. 四四.AIDS.AIDS的基因治疗方案的基因治疗方案将抑制将抑制HIVHIV复制的基因转入复制的基因转入T T淋巴细胞后能淋巴细胞后能表现出对表现出对HIVHIV复制的明显的抑制作用。若将复制的明显的抑制作用。若将其转染造血其转染造血 干干/ /祖细胞，则能在体内分化祖细胞，则能在体内分化为对为对HIVHIV有抗性的巨噬细胞、有抗性的巨噬细胞、T T细胞等，从细胞等，从而获得长期治疗而获得长期治疗AIDSAIDS的效果。的效果。五五SARS基因治疗基因治疗反义技术？反义技术？在在“反义反义”技术领域潜心耕耘了
52、技术领域潜心耕耘了23载的载的AVI公司一直不为外公司一直不为外界所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。事实上，界所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。事实上，AVI公司只公司只花了几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的花了几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的“反义反义”技术技术“改造改造”成了对付非典病毒的武器。成了对付非典病毒的武器。是否成功有待证明是否成功有待证明但是，一些专家对但是，一些专家对AVI公司成功对付非典的可能性表示怀疑。公司成功对付非典的可能性表示怀疑。纽约阿尔伯特纽约阿尔伯特爱因斯坦医学院的赛爱因斯坦医学院的赛斯滕博士说，他要看更多斯滕博士说，他要看
53、更多的数据。这位被称为的数据。这位被称为“反义反义技术之父技术之父”的博士还强调，他的的博士还强调，他的领域充满了失败，领域充满了失败，“我们的了解不多，（这一技术）实在太复杂我们的了解不多，（这一技术）实在太复杂”。“反义反义”技术之复杂在于，一是它除了能切断有害基因及其编技术之复杂在于，一是它除了能切断有害基因及其编码的蛋白质之间的信号传播，也会影响与疾病没有关系的其它基码的蛋白质之间的信号传播，也会影响与疾病没有关系的其它基因和蛋白质；二是它有可能最终被证实不能切断信号传播。因和蛋白质；二是它有可能最终被证实不能切断信号传播。九九基因治疗成功的基本条件基因治疗成功的基本条件 1.1.深入
54、了解变异性。深入了解变异性。 2.2.要充分察知细胞内基因的调节。要充分察知细胞内基因的调节。 3.3.要选择好受体细胞。要选择好受体细胞。 4.4.要选择稳定有效的载体。要选择稳定有效的载体。 5.5.受转染的细胞要合格。（即要求其具有受转染的细胞要合格。（即要求其具有 生长优势，长期存活和稳定而又高水生长优势，长期存活和稳定而又高水 平的表达）平的表达）现有基因治疗的潜在危险现有基因治疗的潜在危险 1.1.病毒通常能感染多种细胞，若作为载病毒通常能感染多种细胞，若作为载 体，可能会改变非目标细胞。体，可能会改变非目标细胞。 2.2.新基因插入新基因插入DNADNA的位置可能出现错误，的位置
55、可能出现错误， 导致癌症和其他损伤的产生。导致癌症和其他损伤的产生。 3.3.转化基因可能转化基因可能“过表达过表达”，产生过多的缺，产生过多的缺 失蛋白，导致机体损害。失蛋白，导致机体损害。 4.4.病毒载体产生炎症或免疫响应。病毒载体产生炎症或免疫响应。 5.5.患者可能将病毒传播给其他个体或转播患者可能将病毒传播给其他个体或转播 到环境中。到环境中。 1.1.安全、靶向、高效表达的基因安全、靶向、高效表达的基因 导入系统。导入系统。 2.2.对导入基因的表达调控。对导入基因的表达调控。 3.3.致病基因及其调控机制的发现致病基因及其调控机制的发现 （已知的能有效治病的基因为数（已知的能有
56、效治病的基因为数 太少）。太少）。基因治疗的发展方向基因治疗的发展方向十、我国基因治疗成就和存在问题十、我国基因治疗成就和存在问题（一）成就：（一）成就：1991年复旦大学进行了国际首例血友病年复旦大学进行了国际首例血友病B基基因治疗临床实验因治疗临床实验2000年四川大学首先提出利用异种同源分子年四川大学首先提出利用异种同源分子作肿瘤基因治疗的策略作肿瘤基因治疗的策略2002年上海市肿瘤研究所设计的非病毒基因年上海市肿瘤研究所设计的非病毒基因导入系统获得美国专利导入系统获得美国专利2003年，世界上第一个基因治疗药物在中国年，世界上第一个基因治疗药物在中国诞生诞生我国已有我国已有14个基因治
57、疗方案进入临床试验个基因治疗方案进入临床试验（二）存在问题：（二）存在问题：大多重复国外同类实验；大多重复国外同类实验；缺乏创新性，各自为政缺乏创新性，各自为政,规模小规模小,资金投入有限资金投入有限,缺乏中心的辐射作用；缺乏中心的辐射作用；一哄而上一哄而上,一哄而下一哄而下,缺乏基因治疗正确认识缺乏基因治疗正确认识.缺乏孵化和转化机制缺乏孵化和转化机制,更缺乏风险基金；更缺乏风险基金；基因治疗研究和相关研究如基因组学基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学病毒学,免疫学免疫学,转基因动物转基因动物,临床医学的结合不够；临床医学的结合不够；初级初级人才流失人才流失,高级人才匮乏；高级人才匮乏；过于强调商业价值过于强调商业价值,忽视科学价值和样板作用忽视科学价值和样板作用P53的基因治疗的基因治疗高纯度质粒的生产高纯度质粒的生产反义寡核苷酸药物研究进展反义寡核苷酸药物研究进展
