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1、肚闹铬膝贼但讣涧游屎咨赫隘杭离习奎带垮锦午薄饥隅栖豹函这蝶痞上诗二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备第三章第三章 二维电泳的蛋白质提取二维电泳的蛋白质提取与样品制备与样品制备滁潭菲石佃姆拦糊貉涕吾愿捌仙逗汉带岳歼瓢烛窒摄霍特协昔角蔡戈确罪二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备制备目的制备目的n完全溶解完全溶解n解离解离n变性变性n还原蛋白还原蛋白选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分污剂和裂解液的成分蕊姿必请岁曲闰忻嘉枢澜磋瘟吁峙痈臣镁砂话吁弓谜雨淹沁鼎澜投提提呀二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备样
2、品制备原则样品制备原则n尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失丢失n细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和低温和蛋白酶抑制蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解剂可以防止蛋白的降解n样品裂解液应该制备，并且分装冻存样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80-80，勿，勿反复冻融已制备好的样品反复冻融已制备好的样品n通过超速离心清除所有的杂质通过超速离心清除所有的杂质n加入加入尿素尿素之后加温不要超过之后加温不要超过3737，防止氨甲酰化，防止氨甲酰化而修饰蛋白而修饰蛋白姆滴谨速照恤腿染呆套颅牡窍吼玛配
3、莹啄旗抨源返乘塑音叔那烂枉责娠蛋二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备第一节细胞裂解方法第一节细胞裂解方法n温和裂解方法温和裂解方法n剧烈裂解方法剧烈裂解方法n用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解n蛋白沉淀步骤蛋白沉淀步骤n清除影响二维电泳图谱杂质清除影响二维电泳图谱杂质n裂解液组分裂解液组分癌拜链途靳屎只惮熊自错吠售瘦逾胆并羹沥篙盗孔彤浪详雹颜渤釉组弄垒二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备一、温和裂解法一、温和裂解法组成较简单样品组成较简单样品n渗透裂解渗透裂解血细胞、组织培养细胞血细胞、组织培养细胞低渗溶液悬浮细胞低渗溶液悬浮细胞n冻融裂解冻融裂解细菌
4、、组织培养细胞细菌、组织培养细胞液氮迅速冷冻细胞，随后在液氮迅速冷冻细胞，随后在37 融化，反复几次融化，反复几次胸幅钞碎亮灵累陀复耀尸寡帧歹才偿枣萎胀据彻切祷魏惺壤咕纵距拽彪胎二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备n去污剂裂解去污剂裂解组织细胞组织细胞溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物n酶裂解法酶裂解法消化细胞壁消化细胞壁溶菌酶溶菌酶 细菌细菌纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶 植物植物溶细胞酶溶细胞酶 酵母酵母在等渗溶液中处理细胞在等渗溶液中处理细胞古燕炎清汛扒佩苦癸驰翔汹惟瞎媒冉乓烘俩婪殷茫蛔弟唤汛泰何嵌澡峡褂二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质
5、提取制备二、剧烈裂解法二、剧烈裂解法n超声裂解法超声裂解法细胞样品细胞样品通过切应力裂解细胞通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却n弗氏压碎器（弗氏压碎器（French Pressure cell）含有细胞壁的微生物含有细胞壁的微生物在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力茹尧幂巩里熙洪疾织殖缕撬洪兜愤劣墅磷太遁册向矫胳藻休饯泊辞毋芒昼二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备n研磨法研磨法固体组织、微生物固体组织、微生物冻存于液氮中，随后研磨成粉末冻存于液氮中，随后研磨成粉末n机械匀浆法机械匀浆法固体组织固体
6、组织将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液n玻璃珠匀浆法玻璃珠匀浆法细胞悬液、微生物细胞悬液、微生物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁慷菇芥嘛拙搓儒呆坡际异粉拥陆舅鼎胎陋傣掳蝴散曰饶惑冬桃迂避垃函迷二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解n蛋白酶抑制剂鸡尾酒（蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail）苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟 (Pheylmethylsulfonyl fluo
7、ride (Pheylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L1mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活蛋白酶，但在水溶液中迅速失活AEBSFAEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L4mmol/L，AEBSFAEBSF的抑制活性与的抑制活性与PMSFPMSF相近，但它更易溶于相近，但它更易溶于水而且毒性低，水而且毒性低，AEBSFAEBSF可能改变蛋白的等电点可能改变蛋白的等电点锭舱孩屋援遏侗腾醛巴
8、护匠掉蚕睦荧茅佯攻春囱钢劲硫噪牟耽寒恬滥趾抵二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备EDTAEDTA，EGTAEGTA：使用浓度为：使用浓度为1mmol/L1mmol/L，通过鳌合，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为：使用浓度为2-20ug/ml 2-20ug/ml 亮抑酶肽亮抑酶肽（LeupeptinLeupeptin）能抑制多种丝）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂（pepstatinpepstatin）抑制天冬氨酸蛋白
9、酶；）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽抑酶肽（aprotininaprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁苯丁抑制剂抑制剂（bestatinbestatin）能抑制氨基多肽酶）能抑制氨基多肽酶恭困津空宙娟嘘循鲁沏袖痔雁的社硷哭交嚷纽历盖饰进盎澡躺我殆观汀远二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCkTLCk），甲苯磺酰苯），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（丙氨酰氯甲酮（TPCTPC）K K：使用浓度为：使用浓度为0.1-0.1-0.5mmol/L0.5mmol/L，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨
10、酸的蛋白酶的蛋白酶苄脒（苄脒（BenzamidineBenzamidine）：使用浓度为：使用浓度为1-1-3mmol/L3mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶，抑制丝氨酸蛋白酶酪蜡抡弄恃或恼辛境久阎碟与忿戴计饼赚潮檬晚闯掉庇吊河烧筐克恨矿租二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备四、蛋白沉淀步骤四、蛋白沉淀步骤1 1、硫酸铵沉淀（盐析）、硫酸铵沉淀（盐析）n原理原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中保持在溶液中n步骤步骤：蛋白浓度大于：蛋白浓度大于1mg
11、/ml1mg/ml，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于50mmol/L50mmol/L，并含有，并含有EDTA,EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌搅拌1030min1030min，通过离心沉淀蛋白，通过离心沉淀蛋白n只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等电聚焦电聚焦n硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用基有敏感作用 孵蜒漆撼眺娶蛮小屋诺赎瓮钱蛙灶搀忻岸残质搔绣张克筛渔疥财得陨周乎二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备2 2、三氯醋酸（、三氯醋酸（TCATCA）
12、沉淀）沉淀n原理原理 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团露出较多的疏水性基团, 使之聚集沉淀使之聚集沉淀益珐肇止施勤郑拇位班湛钮毁翅怯摸削页芳膜慧哺诽莲唁肃少忠府侠暮谁二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备2 2、三氯醋酸（、三氯醋酸（TCATCA）沉淀）沉淀n原理原理 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳可能渗入分子内部而使之较难被完全除
13、去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显片，而且随时间的延长这一作用愈加明显 电泳图谱显示，电泳图谱显示，BSA 、HSA 单体谱带有较明显的展宽现单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于象，这可能是由于TCA 的结合，使的结合，使SDS 与蛋白质的结合与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致迁移率的不一致舱莲桐聂蹄兔紊忘燥流掘沏琳镇床郎婉儒庐棒袄峪僧造程哗雨共租什弟我二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的
14、蛋白质提取制备2 2、三氯醋酸（、三氯醋酸（TCATCA）沉淀）沉淀n有效的沉淀方法有效的沉淀方法：将：将TCATCA加到提取液中，终加到提取液中，终浓度高达浓度高达1020%1020%，冰上沉淀，冰上沉淀30min30min；组织样；组织样可直接用可直接用1020%TCA1020%TCA进行匀浆；最后用丙酮进行匀浆；最后用丙酮清洗沉淀，以除去清洗沉淀，以除去TCATCAn蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶唤慎癣年性裕宗辰森无永霹热弯妙团坡煽宁吱中毫哟噶拭泞耀生吴既弘箕二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备3 3、丙酮沉淀、丙酮沉淀n沉淀机理沉淀机理
15、：降低水的介电常数，导致具有表面水：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出n优点：优点：分辨能力比盐析法高，分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤较为容易沉淀不用脱盐，过滤较为容易n在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性 蓉肖犊疤吸拷夯绎饵羊翼静至抓谋牛狰少善盅痰赞皋壶畸兑另弘杠踌晋重二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备4 4、在丙酮中用、在丙酮中用TCATCA沉淀沉淀n两者联合更加有效两者联合更加有效n10%TCA10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液在丙酮中重悬裂解的样品溶液(
16、(含有含有0.01%0.01%-巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT20mmol/L DTT) )，至少，至少- -2020沉淀沉淀45min45minn仍然存在难再溶现象仍然存在难再溶现象谅究筛烽翱遁凿谆肠卧啊钱蜀竣集疯壕格圾互纹莫售酉赎毯啡鞘蔚赎也埋二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备5 5、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀n杂质含量高的植物样品很有效杂质含量高的植物样品很有效n蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白铵从酚相中沉淀蛋白n此法较复杂，并且耗时较
17、多此法较复杂，并且耗时较多灯抠默隘武馅孟氓罪疽瘤起烷敞貉纷辙止够紫握耐甥蘸挖悬续赖言益兵臃二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备五、清除影响二维电泳图谱的杂质五、清除影响二维电泳图谱的杂质1 1、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子n在在IPGIPG胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大n胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦n透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/ /重悬进行脱盐重悬进行脱盐处理处理懦曙亩锈燥误咯搁秧睫檀微圭玲婪灭嘶帐猾托歇昌兑彦
18、姜缘嵌目赁顷犀贿二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备样品中太多盐离子干扰样品中太多盐离子干扰IEF丙酮沉淀去除盐和杂质丙酮沉淀去除盐和杂质术捌涝智劳箩韧下偶酝祸慧窍建镐亮沉磋检店炯踊敝丧莲桓咏歧扰婿隔封二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备A.蛋白提取物蛋白提取物未经处理未经处理B.经脱盐处理经脱盐处理C.商品化试剂商品化试剂盒沉淀处理盒沉淀处理仅斧甸落诧役甸唁糟揪脊核污拜狞锑星晒戒侵沙剁觉愤畜药吸建社揭物釜二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备带电荷杂质带电荷杂质鲍枪舰辨董待阿洽壹瑟敛码夏恩状仆吵锅置巳苍崇纷拓须缠躬吼伸命噎晰二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的
19、蛋白质提取制备样品不纯样品不纯栖宇芜蔽嵌濒淬却芍闯盾哈涨话渝气檄吩缩旬椭舰材往坊蓟罢嚣旷勇眶闰二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备2 2、内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）、内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）n带带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全nTCA/TCA/丙酮沉淀除去这类物质特别有效丙酮沉淀除去这类物质特别有效幢袖底砍搓爽囱瞅亮衍窜燥痴茸茎须抓沙惩哦眠铸淮脂释辞爸滋狐勺朱效二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备3 3、离子去污剂、离子去污剂n与多肽形成复合物与多肽形成复合物n不能正确聚焦不能正确聚焦n重泡胀溶液可稀释含重泡胀溶液
20、可稀释含SDSSDS样品样品n丙酮沉淀可去除部分丙酮沉淀可去除部分SDSSDSn高温下沉淀将最大限度除去高温下沉淀将最大限度除去SDS,SDS,但在但在-20-20沉淀会沉淀会更完全更完全拄掸郁消匈凳树膨窍怎制先伯斋漾横氧捌蝉归水乔猎辛灵资峪醋翠扮诌凋二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备4 4 、核酸（、核酸（RNARNA、DNADNA）n核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散n高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径n核酸可通过电稳态相互作用与蛋白结合，阻碍聚核酸可通过电稳态相互作用与蛋白结合，阻碍聚焦焦n核酸也将被银染染色，导致
21、高背景核酸也将被银染染色，导致高背景nDNase/RNase ADNase/RNase A混合物处理混合物处理n超离超离剿乳辕厢寒缝吓孜阶甩朱霄鲜宦游肖版除榨梁谆风徒箱拖琅吱右梳资沂想二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备5 5、多糖、多糖n阻碍凝胶孔径、导致沉淀、延长聚焦时间、出现阻碍凝胶孔径、导致沉淀、延长聚焦时间、出现水平条纹、与蛋白质形成复合物水平条纹、与蛋白质形成复合物n硫酸铵或苯酚硫酸铵或苯酚/ /醋酸铵沉淀，随后离心醋酸铵沉淀，随后离心n超速离心超速离心桨夕肌苹等尺去吠首惹采缠颜几颤烙那勒匿厘援赫状在难谢心王瘩告丝腐二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备6 6
22、、脂类、脂类n膜蛋白与脂类形成复合物，降低溶解性，影响等膜蛋白与脂类形成复合物，降低溶解性，影响等电点和分子量电点和分子量n脂类与去污剂形成复合物，减低其效率脂类与去污剂形成复合物，减低其效率n强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相互作用互作用仔冻绍柱遏闽沸遮射驮懂汰搜罗绵藏元铺蹭煮膨带禹腾遮雏青醉校默肪廖二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备7 7、酚类组分、酚类组分n通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白n应用还原剂防止苯酚的氧化应用还原剂防止苯酚的氧化n通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白通过沉淀方法迅速从酚组分
23、中分离蛋白n用抑制剂灭活多酚氧化酶用抑制剂灭活多酚氧化酶nPVPPVP或或PVPPPVPP吸收酚来清除酚组分吸收酚来清除酚组分氧专胀气万谆彪跪橡挑仟案淬胜否朔儡场演仕舶搞酸癣限嚼钦枣渔址醒汪二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备8 8、不溶物质、不溶物质n阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良n阻碍蛋白进人阻碍蛋白进人IPGIPG胶条胶条n先除去不溶物质先除去不溶物质惰悠潭碑逗讶咏粕臆乖怕神吐川噬捎量碰惺贾缺毒臀易队静徊卷矗柿代络二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备六、裂解液的组分六、裂解液的组分n基本成分：尿素、一种或几种去污剂基本成分：尿素、一种或几种去
24、污剂n尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中露于溶液中n去污剂：去污剂：确保蛋白完全溶解，防止通过疏水相互确保蛋白完全溶解，防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合作用导致蛋白聚合n还原剂还原剂：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态状态n载体两性电解质、载体两性电解质、IPG bufferIPG buffer: :通过电荷与电荷之通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性杉滓芜壬监
25、樟咐捶挠原菜焊皱详吸逻倘适慕行曾亿孩汝匀炎绷顺卞牵茵事二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备1 1、可溶性样品、可溶性样品n血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行溶性提取物，经很少的前处理便可进行2-DE2-DEn蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀释后直接分析释后直接分析n较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、超滤、超滤、TCA
26、/TCA/丙酮沉淀浓缩样品丙酮沉淀浓缩样品导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质七、样品制备七、样品制备负申梳痛糖腑寝柞储恿刁让臀篱屉扫盒魁款档塑臆翟扰洼责志噶屎北狐明二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备2 2、组织样品、组织样品n组织在液氮中冷冻后破碎组织在液氮中冷冻后破碎n组织样品的异质性组织样品的异质性免疫亲和技术免疫亲和技术激光捕获微量切割技术（激光捕获微量切割技术（LCMLCM）苇舀孩萍愚市褒共遥抱屿代互姜销珍爹隐艘典槽志抒竭瘪几丈柄摈洗送涅二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备3
27、 3、细胞、细胞n体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液n固体基质中培养的细胞：去除培养基质，固体基质中培养的细胞：去除培养基质，PBSPBS或等或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，将附着在基质上的细胞直接裂解将附着在基质上的细胞直接裂解n核酸含量过高，用不含蛋白酶的核酸含量过高，用不含蛋白酶的DNase/RNaseDNase/RN
28、ase混合混合物来处理样品物来处理样品贴晶锤牧泳追异蛔踢谗赦香憎昼枉辟储蠕焦烹晋聚岭炊纱芒镭弧哆冻昏三二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备4 4、样品分级、样品分级n目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质n亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀n蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶解性能的不同解性能的不同牺烬蟹略苔魄单默赵海助蘸蝎孝等蹦色劲横腐秋炎卯窗叠送剂许抱夺捞兰二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备八、溶解八、溶解n理想的理想的2-
29、DE溶解应能达到破坏所有非共价溶解应能达到破坏所有非共价结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多肽的溶解液肽的溶解液样品中结合牢固的蛋白质复合物可能使样品中结合牢固的蛋白质复合物可能使2-DE中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的点强度将下降点强度将下降必须允许去除可能干扰必须允许去除可能干扰2-DE分离的盐、脂类、分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质多糖和核酸等物质样品中蛋白质在样品中蛋白质在2-DE过程中必须保持可溶性过程中必须保持可溶性施雏纽溺忘霖级栽世众阑远椒峨疤务痔近魂拉巫钮闯杀至摔轧履夫杉藻秃二维电泳的蛋白质提取
30、制备二维电泳的蛋白质提取制备增加样品溶解性手段增加样品溶解性手段n变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，使其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域使其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域 尿素硫脲尿素硫脲n表面活性剂表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基团还需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基团 CHAPS、SDSn还原剂还原剂：在变性剂和表面活性剂联用的条件下，加用还原：在变性剂和表面活性剂联用的条件下，加用还原剂可使蛋白质展开更完
31、全，溶解更彻底剂可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底 含自由巯基的含自由巯基的DDT、巯基乙醇、不带电荷的三丁巯基乙醇、不带电荷的三丁基膦（基膦（TBPTBP）肛娠御后诊绎万串屈羞武整作先东梗压岩旗唬稠川弟删挝跳渊南蛇仰碉皖二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备n起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和表面起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质质也需要在盐活性剂存在的情况下，某些蛋白质质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则在离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则在其其pI点时会发生沉淀点时会发生沉淀 两性电解质的浓度应小于两性电解质的浓度应
32、小于0.2%(w/v)，过高，过高会使会使IEF速度降低速度降低 两性电解质的两性电解质的pH应与应与IPG胶条的胶条的pH范围相符范围相符增加样品溶解性手段增加样品溶解性手段钥铱啃童感涡颤撼芦蔽隙常颖乔临碌铲贡酥坷紊罗货虹忠官陕泥癸链钥藤二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备第二节第二节 蛋白质分步提取技术蛋白质分步提取技术n分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的的n第一步裂解液第一步裂解液：只含有：只含有40mmol/L Tris40mmol/L Tris，其余为去，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白质离子水，只溶解偏亲水性的蛋白
33、质n第二步裂解液第二步裂解液：属传统的裂解方法，含有表面活：属传统的裂解方法，含有表面活性剂性剂CHAPSCHAPS、还原剂、还原剂DTTDTT、解聚剂、解聚剂UreaUrea等成分，具等成分，具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白疏水性的蛋白n第三步裂解液第三步裂解液：添加了能促进疏水性蛋白质溶解：添加了能促进疏水性蛋白质溶解的成分（表面活性剂的成分（表面活性剂SB3-10SB3-10、还原剂、还原剂DTTDTT、解聚剂、解聚剂thiourea, thiourea, ）主要溶解偏疏水性的蛋白质）主要溶解偏疏水性的蛋白质俺危宋腋将镰疵
34、相稗盈椭布徽植难同猎平晶幂瓷党葬酸晃疏聘剖低瞳尼晚二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备蛋白样品蛋白样品40mmol/L Tris收集上清收集上清冷冻干燥冷冻干燥8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA在在40mmol/L Tris中不溶的沉淀中不溶的沉淀8mol/L Uter,4%CHAPS,2mmol/L TBP,40mmol/L Tris,0.5%CA收集上清收集上清浩碉分固春氢蒋韩墟从粒费特七沉淖矫兢晒宝症赢百省喀吭骚品杠蹿白筷二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备在在8mol/L Uter,4%C
35、HAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA中不溶的沉淀中不溶的沉淀5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA收集上清收集上清在在5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA不溶的沉淀不溶的沉淀分步提取法示意图分步提取法示意图烤酥贤践斗苯硫口一婴腰撇赚鄂侥瞪叹凶赚宇峰抢父肮超苟厢制涡七磺入二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的
36、蛋白质提取制备第三节第三节 亚细胞分离与蛋白质提取亚细胞分离与蛋白质提取n亚细胞的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋亚细胞的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋白白n最基本的方法：依据蛋白的大小和密度差异来进最基本的方法：依据蛋白的大小和密度差异来进行亚细胞分级行亚细胞分级低速离心，从胞质细胞器中分离出细胞核和未破碎的低速离心，从胞质细胞器中分离出细胞核和未破碎的细胞，获得所需上清细胞，获得所需上清通过各种密度梯度从上清中分离出各种细胞器通过各种密度梯度从上清中分离出各种细胞器二维电泳分离，计算机帮助图像分析显示出差异蛋白二维电泳分离，计算机帮助图像分析显示出差异蛋白促乾岔孺咖耀康足戴械钓散饺型
37、频拈挫纲属负眯彦疡坝彭颇瞧食肿诬桩繁二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备一、膜蛋白的提取和分离一、膜蛋白的提取和分离醒论足限夺膛渤睬钙搏诲乃提祈嗽邪富琶妥仅启驯婪又甚蛤筒台啊跃俘众二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备一、膜蛋白的提取和分离一、膜蛋白的提取和分离n膜蛋白：多肽链跨越脂双分子层数次的蛋白，为膜蛋白：多肽链跨越脂双分子层数次的蛋白，为膜整合或膜内在蛋白膜整合或膜内在蛋白n膜内在蛋白结构域必须折叠成膜内在蛋白结构域必须折叠成螺旋或螺旋或片片层的二的二级结构构n跨膜蛋白占跨膜蛋白占细胞胞总蛋白的蛋白的30%n膜蛋白膜蛋白处于于细胞的胞的边界，在界，在细胞的各种生命
38、活胞的各种生命活动中中发挥重要的作用重要的作用信号信号转导、细胞粘附、代胞粘附、代谢、离子交、离子交换、内吞、内吞等等浓自茁扯淘誊初废炕甄十峰担扫醋涣歼风沂暖炭剩摔揣炕逛干闷雍聋廷喘二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备提取膜蛋白应注意：提取膜蛋白应注意：n膜蛋白的纯度膜蛋白的纯度沉淀或分级技术也分离膜连的细胞器（如线粒体）沉淀或分级技术也分离膜连的细胞器（如线粒体）样品的制备中，并不是每一个蛋白质都是膜蛋白样品的制备中，并不是每一个蛋白质都是膜蛋白应用盐：溴化钾应用盐：溴化钾n使与膜相互作用较弱的蛋白分离出来而富集内使与膜相互作用较弱的蛋白分离出来而富集内在蛋白在蛋白应用去污剂分级
39、应用去污剂分级n除去膜蛋白制品中的可溶性杂质除去膜蛋白制品中的可溶性杂质好既淌生碗绷炉豹灾孙街掉蛾邑自楞赣尉外晋珊着喇斟噶舶己香盖壶钎织二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备n膜蛋白很难出现二维电泳凝胶图谱中膜蛋白很难出现二维电泳凝胶图谱中膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中的蛋白聚焦的水相介质中的蛋白必须实现必须实现3个条件个条件n必须保证膜的脂类环境，还应避免多余脂类必须保证膜的脂类环境，还应避免多余脂类对等电聚焦的干扰对等电聚焦的干扰n必须以一种可溶的形式（去污剂必须以一种可溶的形式（去污剂-蛋白复合蛋白复合物）从膜中
40、分离出来物）从膜中分离出来n所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中维持所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中维持可溶状态，特别是在等电点的位置可溶状态，特别是在等电点的位置矩丸倘膀萧蒜混尧遮坎仅闸扶奠淆痒碑肝置闲勾孰腮询静粒寿滤叔齐怀稠二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备n当当pH7时，膜蛋白斑点数多于胞外蛋白；随着时，膜蛋白斑点数多于胞外蛋白；随着pH的增大，的增大，膜蛋白的优势越来越明显。膜蛋白的优势越来越明显。结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白2DE图谱图谱 釉逢殊售帛徘永参晓冯靳粒翘炬摔特远或搏曾棺兄杉高稚某斜葫疮覆进闸二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质
41、提取制备二、核蛋白的提取和分离二、核蛋白的提取和分离n普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结合而成为细胞核的主要成分合而成为细胞核的主要成分n核蛋白中的蛋白质包括组蛋白核蛋白中的蛋白质包括组蛋白(或精蛋白或精蛋白)和非组和非组蛋白蛋白质。组蛋白含碱性氨基酸如精氨酸、赖蛋白蛋白质。组蛋白含碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸等丰富的碱性蛋白，带正电荷。精蛋白仅出氨酸等丰富的碱性蛋白，带正电荷。精蛋白仅出现于真核细胞中，含较多的天门冬氨酸、谷氨酸现于真核细胞中，含较多的天门冬氨酸
42、、谷氨酸等酸性氨基酸，是酸性蛋白，带负电荷等酸性氨基酸，是酸性蛋白，带负电荷龙幂辈泪撤畦瘩炕衡细囊乡致析藻冉伸碘姓砷帮凑妊懈哮哲垛闽舵肃列狭二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备二、核蛋白的提取和分离二、核蛋白的提取和分离n核蛋白属于中等溶解度核蛋白属于中等溶解度联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到足够的分辨率足够的分辨率n核蛋白是强碱性蛋白（核蛋白是强碱性蛋白（pI10）与二维电泳的第一维等电聚焦相容程度较低与二维电泳的第一维等电聚焦相容程度较低n核基质核基质核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内
43、不均一核糖核蛋白、与基质相关的不均一核糖核蛋白、与基质相关的DNA结合区结合区究爹梨镜告阀擎芒椰巨母盔庭尘寥举碱报褒轿诛肿冲赐愿乘式涩沾嘎搔响二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备在含有在含有0.05%TritonX-100和和1.2mmol/L蛋白酶蛋白酶抑制剂缓冲液中匀浆数分钟，离心去除脂类和抑制剂缓冲液中匀浆数分钟，离心去除脂类和可溶性蛋白（可溶性蛋白（Fey和和Penman建立的核基质提建立的核基质提取方法）取方法）多发性骨髓瘤耐药细胞株核基质蛋白多发性骨髓瘤耐药细胞株核基质蛋白 2-D图查石敲闭洋窄寒栏滁沦旗菏绥蟹淆弗答宛秽讫凋逢士敢娇叹拖焊拇嘛澎勿二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备二、核蛋白的提取和分离二、核蛋白的提取和分离n核膜的组成核膜的组成与内质网连续的核外膜、由核纤层支撑的核内与内质网连续的核外膜、由核纤层支撑的核内膜、由核纤层蛋白组成的中间网格、位于核孔膜、由核纤层蛋白组成的中间网格、位于核孔复合体的连接内外核膜的核孔膜复合体的连接内外核膜的核孔膜参照参照Dreger M方法方法筛纯提裸场贯赖凳判迭宵儿级脓淫叫查悦肯弄露飘马您确爹宽胚巢跋镀循二维电泳的蛋白质提取制备二维电泳的蛋白质提取制备
