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1、变性蛋白的变性蛋白的复性复性一、蛋白质变性一、蛋白质变性由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化构象发生了异常变化，从而导致，从而导致生物活性的生物活性的丧失丧失以及物理、化学性质的异常变化以及物理、化学性质的异常变化 ，这种，这种现象称为蛋白质的变性现象称为蛋白质的变性( (denaturationdenaturation)。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂变性可以涉及次级键、二硫键的断裂但不涉及一级结构上肽键的断裂但不涉及一级结构上肽键的断裂二、二、蛋白质复性的意义蛋白质复性的意义目标蛋白质没有生物活性目标蛋白质没有生物活性(包涵包涵体
2、体) 分离回收分离回收包涵包涵体，体，溶解溶解包涵包涵体体(目标蛋白质恢复应有的天然构象目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性和活性) 三三、变性蛋白质的复性、变性蛋白质的复性 就是脱除变性剂使溶解的就是脱除变性剂使溶解的包涵体包涵体蛋白质的伸蛋白质的伸展肽链折叠成正确的空间结构。展肽链折叠成正确的空间结构。 包涵体形成的原因包涵体形成的原因主要是高水平表达主要是高水平表达的结果。的结果。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致的正确折叠的速率就会导致包涵包涵体的形成。体的形成。重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折重组蛋白在
3、大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。伴侣等。包涵体包涵体的分离和溶解的分离和溶解1 1、包涵体包涵体的分离的分离 收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使用使用低浓度的低浓度的变性剂洗涤沉淀。变性剂洗涤沉淀。2 2、包涵体包涵体的溶解的溶解 打断打断包涵包涵体蛋白分子内和分子间的各体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽链伸展。种化学键，使多肽链伸展。 一般一般用强的变性剂，如脲、盐酸胍或用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，硫氰酸盐，SDSSDS，各种溶解方法都各有利弊。，各
4、种溶解方法都各有利弊。蛋白复性方法蛋白复性方法1 1、稀释、透析复性法、稀释、透析复性法 蛋白质复性的最大问题，是在复性过程蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中中形形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。降低蛋白浓度可碍小或无阻碍的容易复性。降低蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。以减少中间体形成提高复性率。 所以，所以，在复性前用使用稀释、透析、过在复性前用使用稀释、透析、过滤滤及及凝胶过滤除去变性剂、还原剂凝胶过滤除去变性剂、还原剂，降低蛋，降低蛋白浓度。白浓
5、度。2 2、含有二硫键的蛋白的复性、含有二硫键的蛋白的复性 复性时涉及正确二硫键（分子内或复性时涉及正确二硫键（分子内或者分子间）的重建。者分子间）的重建。 空气氧化法空气氧化法加入氧化剂加入氧化剂- -还原还原转换试剂转换试剂 加入氧化型谷胱甘肽加入氧化型谷胱甘肽使用还原剂保护巯基使用还原剂保护巯基加入二硫苏糖加入二硫苏糖醇。醇。3 3、封闭蛋白的疏水簇促进复性、封闭蛋白的疏水簇促进复性 对蛋白质结构和序列的分析，确对蛋白质结构和序列的分析，确定出在蛋白中可能引起分子间相互作定出在蛋白中可能引起分子间相互作用的疏水簇用的疏水簇，破坏这种疏水簇的突变，破坏这种疏水簇的突变，可能会减少聚集。可能
6、会减少聚集。用特异性结合疏水用特异性结合疏水簇的单克隆抗体来封闭疏水簇，减少簇的单克隆抗体来封闭疏水簇，减少分子间结合引起的聚集。分子间结合引起的聚集。4 4、凝胶过滤层析复性、凝胶过滤层析复性 层析介质的隔离作用，降低了蛋白之层析介质的隔离作用，降低了蛋白之间相互作用产生的聚集，使复性浓度、复间相互作用产生的聚集，使复性浓度、复性率得到很大的提高。性率得到很大的提高。5 5、小分子添加剂促进复性、小分子添加剂促进复性6 6、分子伴侣或折叠酶促进的复性、分子伴侣或折叠酶促进的复性7 7、人工分子伴侣促进的复性、人工分子伴侣促进的复性色谱法复性过程的示意图色谱法复性过程的示意图基因工程药物的质量
7、控制基因工程药物的质量控制 一、一、基因工程药物与一般药物的对比基因工程药物与一般药物的对比1、基因工程药物、基因工程药物是利用活细胞作为表达系统，产物的是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构分子量较大，并有复杂的结构。2、许多基因工程药物是参与人体一些生理功能精密调、许多基因工程药物是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质。节所必需的蛋白质。3、宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、工艺、宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。放大等过程中，都有可能发生变化。二、基因工程药物的质控要点o原材料的控制o生产的控制o最终产品的质量控制
8、o产品的保存（一）（一）生物材料的质量控制生物材料的质量控制 表达载体和宿主细胞表达载体和宿主细胞 明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，表达载体的构建、结构和遗传特性表达载体的构建、结构和遗传特性 克隆基因的序列克隆基因的序列 提供插入基因和表达载体两端控制区的核苷酸序列。所有与表达有提供插入基因和表达载体两端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列应详细叙述关的序列应详细叙述 表达表达 详细叙述生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所详细叙述生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平采用的方法及表达水平（二）生产的控制（二）生产的
9、控制1、培养过程的质量控制、培养过程的质量控制a、原始细胞库、原始细胞库 应详细记述种子材料的来源、方式、保应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新做全面检定。新的种子批时，应重新做全面检定。b b、有限代次的生产、有限代次的生产 提供培养生产浓度与产量恒定性、培养和诱导基因产提供培养生产浓度与产量恒定性、培养和诱导基因产物的数据，依据物的数据，依据宿主细胞宿主细胞- -载体系统的载体系统的稳定稳定特性特性，确定最高，确定最高允许
10、传种代数和细胞倍增数。允许传种代数和细胞倍增数。c c、连续培养生产、连续培养生产 应提供长期培养后表达基因的分子完整性资料，以及应提供长期培养后表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。宿主细胞的表型和基因型特征。 2、纯化过程的质量控制纯化过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、质、DNADNA与热源质控制在规定限度以下。与热源质控制在规定限度以下。 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分
11、及精制工序本酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。身引入的化学物质，并有检测方法。（三）（三）目标产品的质量控制目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括以下基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。性、稳定性和一致性。1 1. .理化性质鉴定理化性质鉴定肽图分析肽图分析：根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸的组成特点，根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸的组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位
12、点将多肽裂解成小片段，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。常用成小片段，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。常用方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱和毛细管电泳高效液相色谱和毛细管电泳氨基酸成分分析：氨基酸成分分析：应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。部分氨基酸序列分析：部分氨基酸序列分析：氨基端氨基端1515个氨基酸。个氨基酸。重组蛋白质的浓度测定：重组蛋白质的浓度测定：凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林福林- -酚法和紫外光谱法。酚法和紫外光谱法。相对分子量
13、测定：相对分子量测定：凝胶过滤法和凝胶过滤法和聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。2、纯度分析、纯度分析a、目的蛋白质含量测定、目的蛋白质含量测定根据蛋白质理化性质等来设计根据蛋白质理化性质等来设计常用方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相常用方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱。色谱。b b、产物杂质检测、产物杂质检测包括蛋白质和非蛋白质杂质。包括蛋白质和非蛋白质杂质。蛋白类：宿主细胞蛋白，采用免疫方法和电泳蛋白类：宿主细胞蛋白，采用免疫方法和电泳相结合；相结合；非蛋白类：病毒、细菌等微生物、热源质、内非蛋白类：病毒、细菌等微生物、热源质、内毒素、致敏原及毒素、致敏原及DNADNA。利用
14、微生物学方法检。利用微生物学方法检测无菌。热源质检测用家兔注射。测无菌。热源质检测用家兔注射。3、生物活性测定、生物活性测定 保证基因工程药物产品有效性的保证基因工程药物产品有效性的重要手段，需要进行动物体内试验和重要手段，需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。通过细胞培养进行体外效价测定。4 4、稳定性考察稳定性考察 是评价药品有效性和安全性的重要指是评价药品有效性和安全性的重要指标，也是确定药品储藏条件和使用期限的标，也是确定药品储藏条件和使用期限的主要依据。对温度、氧化、光照、离子浓主要依据。对温度、氧化、光照、离子浓度和机械剪切等环境因素都很敏感。度和机械剪切等环境因素都
15、很敏感。5 5、产品一致性保证：产品一致性保证： 生产周期长，影响因素多，必须生产周期长，影响因素多，必须对每一步都进行严格的控制。对每一步都进行严格的控制。（四）（四）产品的保存产品的保存 液态保存液态保存 （1 1）低温保存：液态蛋白质样品在）低温保存：液态蛋白质样品在-10-10到到- -2 20C以下冰冻保存。以下冰冻保存。 （2 2）在稳定）在稳定pHpH条件下保存：蛋白质较稳定条件下保存：蛋白质较稳定的的pHpH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的窄的pH pH 范围内才稳定。因此对保存液态蛋范围内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定
16、的白质样品时小心调到其稳定的pH pH 范围内。范围内。（3 3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。（4 4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。乙醇、二硫苏糖醇等。2 2、固态保存、固态保存 一般蛋白质含水量超过一般蛋白质含水量超过10%10%时容易失活。含水量降到时容易失活。含水量降到5%5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，但在时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，但在37C37C保保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是制成存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在放在干燥器中在4C4C可保存相当长的时间。可保存相当长的时间。 冷冻干燥法具有保持产品成分稳定，抑制微生物生冷冻干燥法具有保持产品成分稳定，抑制微生物生长和酶的降解，是之可长期保存等优点，时制备生物制长和酶的降解，是之可长期保存等优点，时制备生物制品的常规方法。品的常规方法。
