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1、二、基因工程的基本程序二、基因工程的基本程序载体质粒载体质粒外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主细胞主细胞选出含有重选出含有重组组DNADNA的细的细胞扩增胞扩增表达表达abbAAb第二章第二章基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节其他工具酶第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。l一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2l二、限制性核酸内切
2、酶的制备方法l三、限制性核酸内切酶分类和命名l四、型限制性核酸内切酶的基本特性l五、影响限制性内切酶活性的因素分类：识别和切割位点不固定，随机性。：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。四、型限制性核酸内切酶的基本特性识识别别序序列列：1.47个核苷酸组成的特定核苷酸序列2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。EcoR5-GAATTC-33-CTTAAG-5l经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-G
3、ACGTC-53-GACGTC-5(2)5-P单链延伸的粘性末端.如：EcoR5-GAATTC-35-GAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAG-52.平末端如:Sma5-CCCGGG-33-GGGCCC-5两种特殊的限制酶(1)同尾酶识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamH和Bgl(2)同裂酶识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:Mbo和Sau3A共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。l五、影响限制性内切酶活性的因素l1.DNA的纯度l2.DNA的甲基化l（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌l（2）研究基因工程DNA的
4、甲基化程度l（3）改变限制酶的识别特性l3.温度l4.分子结构l5.限制酶的缓冲液l星号活性lEcoR切GAATTCEcoR*切pupuATpypy或AATT第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接l一、DNA连接酶DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口.温度l二、DNA分子的体外连接二、DNA分子的体外连接l1粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化l2平末端DNA片段的连接l（1）T4DNA连接酶法l（2）同聚物加尾法l（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子第三节其他工
5、具酶l一、大肠杆菌DNA聚合酶l二、DNA聚合酶大片段（Klenow酶）l三、T4DNA聚合酶l四、逆转录酶l五、末端脱氧核苷酰转移酶l六、核酸酶S1l七、核酸酶BAL31l八、外切核酸酶l九、T4多聚核苷酸激酶l十、碱性磷酸酶l十一、甲基化酶命名命名 HindH:Haemophilus嗜血杆菌属in:influenzae流感d:Rd株：该菌株中第三个被分离到的限制酶同尾酶BamHI和BglIIAGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglBamHIAGATCCTCTAGGT4连接酶AGATCC（连接后的切点均不能被上述两种酶切）TCTAGG一、大肠杆菌DNA聚合酶l1.三种活性l（1
6、）5-3聚合酶活性（在有dNTP时）l（2）3外切酶活性（无dNTP时大亚基活性）l（3）5外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）l2.在基因工程中的应用：缺口平移标记技术。二、DNA聚合酶大片段（Klenow酶）l1.DNA聚合酶活性（切除小亚基，保留大亚基）l2.3外切酶活性（无dNTP时）l3.在基因工程中的应用l（1）标记粘性末端.-32PdNTPl标记平末端-32PdNTPl（2）将5端伸出的末端填平l（3）可用来反转录合成双链cDNA。l（4）补平粘性末端。三、T4DNA聚合酶l具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。取代
7、反应四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA为模板2.3外切酶活性能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。应用：l1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNAl2.制备探针。五、末端脱氧核苷酰转移酶l可催化DNA片段上的3-OH端加接脱氧核糖核苷酸。l常用于同种碱基多聚体接尾反应l核素标记DNA片段的3端六、核酸酶S1可以降解单链DNA和RNAl(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。l(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转
8、录反应合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成无发夹结构的cDNA。l(3)可用核酸酶S1分析DNARNA杂交分子的结构。十、碱性磷酸酶l该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5端的磷酸切除，产生5-OH。l应用：(1)用该酶催化切除DNA或RNA5端的磷酸,然后加上-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5端。(2)用于避免单酶切后质粒自我环化。十一、甲基化酶l常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识别的5GATC3或5GAAT3序列的5腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可
9、在限制识别的5CCAGG3或5CCTGG3序列的5胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解，保护酶切位点。核酸酶BAL31从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。外切核酸酶能从线性DNA的3-OH末端沿35方向切去单核苷酸，制造3端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。T4多聚核苷酸激酶能将ATP上的位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5-OH上，可将-32P-ATP中的32P连接到5端的5-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素标记。八、外切核酸酶它的功能是将带有3-OH末端的双链DNA从3到5 端方向切除，产生5 单核苷酸
