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1、内江师范学院 通识课微生物与人类课程公共邮箱：课程公共邮箱：内江师范学院化学与生命科学院内江师范学院化学与生命科学院遗传学教研室遗传学教研室Welcome to My Microbes and Man Class内江师范学院 通识课微生物与人类第2讲 微生物实验技术（1）内江师范学院 通识课微生物与人类内容提要微生物实验最基本的原理与微生物培养的主要工作(The five Is)发酵工程菌种保藏显微术内江师范学院 通识课微生物与人类？讲在课前作为一名学生，是否应该接受老师的权威表述？你的回答是什么？ Yes?这当然是正确的，因为每一位教师在教学中所说的每一件事都是经过考证、研究证明是新的，合理
2、的。这个课堂的学习，最终应该让大家学习到这个学科研究的知识框架，了解当代微生物学知识的一个全景内江师范学院 通识课微生物与人类了解如何进行微生物的操作很重要？但是，这种依据是否过于简单？你的这个“是”，是否还应该加上一些附加条件？比如对这些知识的得来有个基本的认识？在一个依赖于高度发达的技术的社会，作为一个普通的人要以批判的眼光去看待科学研究的结果，正确判定哪些应该是大家公认的，而哪些可能是冒险。哲学的说法即：要有证伪的态度与能力真理只能被证伪而不能被证实。必须具备相应的知识，并能对新出现的知识有正确的评判。内江师范学院 通识课微生物与人类卡尔波普尔著作猜想与反驳提出科学和非科学划分的证伪原则
3、。证伪主义使人们相信所有的科学都只是一种猜测和假说，它们不会被最终证实，但却会被随时证伪。最好的假说是终极真理的代名词，和科学精神相悖。偶然真理：经验科学应该服从一种证伪主义。应采用试错法。这是指人们应该大胆地提出假说和猜测，然后去寻找和这一假说不符合的事例。根据事例对假说进行修正，不断重复这一过程，乃至将最初的假说全盘否定。试错法对理论的修改和完善是没有止境的，试错法的结果只能是一个较好的假说，但不是最好的假说。内江师范学院 通识课微生物与人类卡尔波普尔著作猜想与反驳证伪主义至少存在两个优点。第一，科学理论的表达一般为全称判断，而经验的对象是个别的。所以，经验如果用来证实理论，那么它将是无法
4、穷尽一般的理论的。比如，再多的白羊也不能证明所有的羊都是白的，而只要一只黑羊就能证明所有的羊都是白的这个理论是错误的。所以，经验的真正意义在于可以证伪科学理论。第二，证伪主义可以避免对错误理论的辩护和教条。如果坚持实证主义，那么一旦出现与理论相悖的经验，人们便会做出特殊的设定或限制以使得理论能满足经验。但实际上这样的设定往往是极不科学的。内江师范学院 通识课微生物与人类了解如何进行微生物的操作很重要？科学的精神正是“通识”课程的本意：科学总是寻求发现和了解客观世界的新现象，研究和掌握新规律，总是在不懈地追求真理。科学是认真的、严谨的实事求事的，同时科学又是创造的，科学的最基本态度之一就是疑问，
5、科学的最基本精神之一就是批判（-第一推动丛书，总序）。而如何才能做到这些呢？这就必须对学科的本源，实验原理和操作手段有所了解。内江师范学院 通识课微生物与人类实验实验由实验操作学习开始，会使学习更有兴趣，得到的知识更能记住。微生物学由此研究对象的独特性，其研究手段极具特色，并已经在生物科学技术领域得到广泛应用内江师范学院 通识课微生物与人类The five Is微生物实验最基本的原理Pure Culture微生物研究的基础内江师范学院 通识课微生物与人类微生物学最基本的理念与最基础的工作p最基本理念（纯培最基本理念（纯培养，无菌操作，群养，无菌操作，群体研究）体研究）p最基础的工作最基础的工作
6、_ _培养培养基与分离纯化基与分离纯化内江师范学院 通识课微生物与人类根本原理-生命由“种子产生”在19世纪 后叶，巴斯德的一个著名实验之后，一个基本的观念即被人们广泛接受：即生命物即生命物质不能由非生命物质产生。质不能由非生命物质产生。(实验是什么？)在一个巧妙设计的容器中装入灭过菌的肉汤，并能接触空气和保温，而又不使生活在空气中的微生物进入。-20世纪60年代，在伦敦皇家研究所还能见到19世纪后期保存的那些约翰丁德尔配制的陈年肉汤。内江师范学院 通识课微生物与人类微生物学研究面临的几个问题微生物群体是形形色色的”大杂烩“Most habitats (such as the soil and
7、 the human mouth) harbor microbes in complex associations.研究通常只能在实验室“人工”环境开展Second, to maintain and keep track of such small research subjects, microbiologists usually have to grow them under artificial conditions. “感杂”必需防止A third difficult in working with microbes is that they are invisible and wid
8、ely distributed, and undesirable ones can be introduced into an experiment and cause misleading results. 内江师范学院 通识课微生物与人类p微生物学实验最基本的理念（1）灭过菌的物质在适当条件下将保持无菌状态，除非有人去感染它!这就是微生物学最基本的原理。（2）当我们制备出灭菌的肉汤，用单一的品种去感染，可以保持微生物的“纯一纯一”-微生物培养物微生物培养物。内江师范学院 通识课微生物与人类p微生物学实验室最基本的理念微生物学研究的基础是必须首先想法培育出不被从另处而来的微生物污染(感染)的
9、纯一的种系。微生物学研究技术在整体上与生物学其它领域的技术有明显的区别。你可以抓住一条狗、一株植物植物，用各种方式，想各种办法去观察它们，但你目前不能对某个单个的微生物进行这些工作!（3）群体研究微生物学家们的研究策略，同化学家们一样(化学家们总是从对成千上万个分子而非单一分子研究中得到信息)，研究对象通常是群体群体。内江师范学院 通识课微生物与人类可见，微生物实验室最基本的要求是必须做好微生物的控制。让我们认识其中几个基本的概念： Sterile (灭菌), relates to the completely absence of viable microbe; Aseptic(防腐), r
10、elates to prevention of infection; Pure culture (纯培养)refers to growth of a single species of microbes.p微生物学实验室最基本的理念内江师范学院 通识课微生物与人类工作的基础：无菌技术无菌技术无菌技术无菌技术无菌技术: : : :容易想到,要取得纯培养的培养的成功成功，必须做到培养基的组成必须适合微生物的需要，而且培养基、玻璃器皿、器械也一定要是无菌的。此外，在操作中要把被来自空气里微生物污染的可能性减少到最小(感杂）。微生物学上把这种技术叫做无菌技术无菌技术无菌技术无菌技术。无菌操作技术已经成
11、为高端生物技术的基本要求（生物发酵，组织培养，胚胎克隆，干细胞研究）。内江师范学院 通识课微生物与人类微生物实验室风风淋淋室室内江师范学院 通识课微生物与人类p微生物学最基础的工作CULTURE（1） 培养基：微生物学上的培养基，即微生物可以在其内部或是表面生长的一种“汤”或是胶冻。其中含有微生物生长所需要的少量铁、镁、磷、钠、钾、钙等元素、铵盐的氮源及某种碳化合物。试想：如果你有这样一杯“肉汤”，用1克土去感染这种溶液，会有什么结果？内江师范学院 通识课微生物与人类一杯肉汤的故事一杯肉汤的故事我们相信，在自然的任何一口水池、一片沼泽我们相信，在自然的任何一口水池、一片沼泽类类似的故事，正在不
12、断重复。似的故事，正在不断重复。我们是一群土壤细菌，小杆状身姿最大方！好氧菌首先生长，氧化糖类而迅速耗尽氧气厌氧菌如梭菌等生长于深层，产生恶心臭味。并有二氧化碳释放（厌氧呼吸）（厌氧呼吸）接下来是硝酸盐呼吸！硫酸盐呼吸接下来是硝酸盐呼吸！硫酸盐呼吸如果有甲烷球菌，则它们是笑到最后如果有甲烷球菌，则它们是笑到最后者（碳酸盐呼吸）者（碳酸盐呼吸）早就告诉过你们，圆才是永恒的！地球不都早就告诉过你们，圆才是永恒的！地球不都是圆的吗？是圆的吗？内江师范学院 通识课微生物与人类纯培养 pure culture，axenic culture纯培养：单一种类存在的状态下所进行的生物培纯培养：单一种类存在的状
13、态下所进行的生物培养。所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养。所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。可说是一种纯培养。纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（LPasteur）和柯赫（和柯赫（RKoch）建立起来的。在自然界中，）建立起来的。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一些在理的生物及进行
14、寄生性营养的生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。论上不可能进行纯粹培养的生物。内江师范学院 通识课微生物与人类纯培养 pure culture，axenic culture微生物学纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.克隆与菌落纯：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture，克隆）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。而一般通过简单划线而得的仅称菌落纯。得到纯培养的过程称为分离纯化 。内江师范学院 通识课微生物与人类p微生物学实验最基础的工作平
15、板和单菌落分离技术平板和单菌落分离技术微生物中最常的是一种带盖的平皿，称为培养皿。平板：平板：皿中装入以琼脂为凝固剂的液态培养基，冷却后凝固形成一个平面，用于微生物的分离和培养称为平板。菌落：菌落：各个彼此分开微生物个体在固体平面上，每个分开的微生物个体在胶冻状的固体培养基中生长时，将繁殖出同类微生物的肉眼可见群落，称为菌落菌落。内江师范学院 通识课微生物与人类培养基的种类与分类内江师范学院 通识课微生物与人类Types Of Media培养基按物理性状分类Physical form按化学性状分类Chemical composition按功能进行分类Functional type内江师范学院
16、通识课微生物与人类按物理性状分类液体培养基半固体培养基固体培养基活体培养基内江师范学院 通识课微生物与人类液体培养基(a)Liquid media（液体培养基） tend to flow freely when the container is tilted(b)一种用于鉴别的液体培养基A selective medium for identifying this species (肠道菌鉴别).on the left(o) is a clear, uninoculated broth, the broth in the center is growing without a color ch
17、ange(-), and on the right is a broth with grown and color change(+)注释与说明：液体培养基是生物发酵的基本方式。图b为三种液体培养基，其左为未接种，中右为注意接种后的不同表现。内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类(2) 半固体培养基Semisolid Media Contain a small amount (0.3%0.5%) of Agar.半固体培养基是琼脂含量低半固体培养基是琼脂含量低(0.3%0.5%)的一种培养基，的一种培养基，其物理性状为柔软的浆糊状。其物理性状为柔软的浆糊状。可用于细菌
18、的运动性及生理可用于细菌的运动性及生理特性研究（如细菌的微好氧特性研究（如细菌的微好氧特性研究）。特性研究）。内江师范学院 通识课微生物与人类SIM培养基培养基 (sulfur indole motility medium，硫醚吲哚机动培养基，硫醚吲哚机动培养基):Possible results starting from the far left are: no growth, no motility; motility; motility and produce of hydrogen sulfide gas(硫化氢气体硫化氢气体)内江师范学院 通识课微生物与人类(3) Solid Me
19、dia 固体培养基固体培养基分可反复液化及不同液体两种固体培养基分可反复液化及不同液体两种固体培养基分可反复液化及不同液体两种固体培养基分可反复液化及不同液体两种类类类类型（型（型（型（LiquefiableLiquefiable and nonliquefiablenonliquefiable : Liquefiable solid media, sometimes called reversible solid mediareversible solid media, contain a solidifying agent that changes its physical propert
20、ies in response to temperature.）注释与说明：凡呈固体形态的培养基皆可称固体培养基，有直接用天然固体物质的，也有加各种凝固剂（如琼脂）。同时也分可液化及不可液化两类 。内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类伟大的发现琼脂, a complex polysaccharide (多聚糖) isolated from the red alga gelidium. 内江师范学院 通识课微生物与人类伟大的发现琼脂, a complex polysaccharide (多聚糖) isolated from the red alga gelidium.
21、 琼脂做固化剂的优点: (1) 适当的凝固点及溶点solid at room temperature, and it melts(liquefies) at the boiling temperature of water ( 100). Once liquefied, agar does not resolidfy until it cools to 42 , so it can be inoculated and poured in liquid form at temperature (45 -50) that will not harm the microbes or the hand
22、ler. (注意:混菌法最佳温度是451 ）内江师范学院 通识课微生物与人类 (2) 很好的可塑造性 Agar is flexible and moldable, and it provided a basic framework to hold moisture and nutrients, (3) 非易降解物it is not a digestible nutrient for most microorganisms.一般用量：Any medium containing 1% to 5% agar usually has the word agar in its name某某琼脂. 内江师
23、范学院 通识课微生物与人类Animal inoculation: “living media”内江师范学院 通识课微生物与人类按培养基化学成份（Chemical Content of Media ）Two types:合成培养基 Synthetic (chemically defined)复杂培养基 Complex or nonsynthetic内江师范学院 通识课微生物与人类给我一个有效的培养基，让我完成工作（按功能划分培养基）为了获得单一类型的微生物的培养物，微生物学中最常用的技术有两种它们是富集与分离（ (1)富集培养 ； (2) 单菌落分离技术。）这个工作也跟培养基密切相关。内江师范学
24、院 通识课微生物与人类富集培养基富集培养基选择选择培养基培养基鉴别鉴别培养基培养基培养基的配方戏法人人会变，巧妙各有不同内江师范学院 通识课微生物与人类研究工作的开端：找到它们，并培养出来！研究工作的开端：找到它们，并培养出来！富集培养基：富集培养基：An enrich medium contains complex organic substances such as blood, serum, hemoglobin, or special growth factor (specific vitamins, amino acids. ) that certain species must h
25、ave in order to grow. 注释与说明（1）growth factor ：生长因子，如特别的维生素、氨基酸。（2 ) fastidious指难养菌. （3）hemoglobin（血红蛋白）（4）pathogens 病原体 （5）红色字体分别为链球菌、奈氏球菌（致淋病）（6）agar 琼脂 ，blood agar 血琼脂。内江师范学院 通识课微生物与人类研究工作的开端：找到它们，并培养出来！研究工作的开端：找到它们，并培养出来！富集培养基富集培养基Bacteria that require growth factors and complex nutrients are term
26、ed fastidious. Blood agar, is widely used to grow fastidious streptococci and other pathogens. Pathogenic Neisseria (one species causes gonorrhea奈氏球菌，致淋病) are grown on Thayer-martin medium or chocolate agar, which is made by heating blood agar. 注释与说明（1）growth factor ：生长因子，如特别的维生素、氨基酸。（2 ) fastidious
27、指难养菌. （3）hemoglobin（血红蛋白）（4）pathogens 病原体 （5）红色字体分别为链球菌、奈氏球菌（致淋病）（6）agar 琼脂 ，blood agar 血琼脂。内江师范学院 通识课微生物与人类(a)血琼脂：Blood agar plate growing bacteria from the human throat.(b)巧克力琼脂Chocolate agar: commonly used to culture the fastidious gonococcus(gets it brown color from the heated blood, not from ch
28、ocolate.) 内江师范学院 通识课微生物与人类富集培养的基本做法富集培养基本是一种选择性培养基。这一培养的要点，就是“投其所好”。如：（1）在没有铵盐的含糖培养基中可能 得到某些固氮菌。（但请注意，随着固氮菌的生长，其它细菌也可能随着生长，从而使细菌群体变得十分混杂）用没有糖类但含有硫的培养基我们可能得到硫细菌，而用硫酸铁代替糖，则可能得到铁细菌。内江师范学院 通识课微生物与人类富集培养的基本做法（2）弱酸性含糖高的培养基，利于酵母和霉菌的生长。（3）隔绝空气（如将液体培养基装满并塞紧，或者如泡菜坛的做法，但应该注意，如果含糖高时，会出现蹦瓶！）（4）加热处理土壤后，再培养，可能得到产芽
29、孢的细菌，而将培养物置于高温下，则可以选择培养嗜热菌。内江师范学院 通识课微生物与人类富集培养的可能性是无限的，实际上，富集培养的可能性几乎是无限的，如我们完全可以设计出-利用酒精？橡胶？塑料？或是耐高盐？当然，医学微生物学家们通常很少做这个工作，因为富集过程已经完毕why?。但是，自然界的一些微生物，许多情况下，对我们的简单富集技术无动于衷，这是微生物学家们最为苦恼的事之一。藐视！内江师范学院 通识课微生物与人类纯化一但得到富集的群体，即得到了微生物的培养物，微生物学的研究就有了基础。如何使群体纯化，则是下一个首要的问题简单和常用的方法-平皿培养法：把一滴培养物涂布于一个平板上，使各个微生物
30、彼此分开，每个分离的微生物在平板的胶冻表面（或内部）生长，将繁殖出“菌落菌落”，而这些彼此相隔离的菌落可能就是一个纯化的微生物培养物 （菌落纯）（菌落纯）。内江师范学院 通识课微生物与人类The same mixed sample containing five different species is streaked onto the plates of general-purposeed nonselective medium and selectiev medium.内江师范学院 通识课微生物与人类鉴别培养基鉴别培养基（differential medium） 用于鉴别不同类型微生物的
31、培养基。在培养基中加入某种特殊的化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。内江师范学院 通识课微生物与人类Nondifferential and differential medium内江师范学院 通识课微生物与人类Contains 7.5% sodium chloride;A dye pinpoint(精确,指明) those species of Staphylococcous, turn red to a bright yellow.W
32、hereas many other species are inhibited by this high concentrationMacConkey agar differentiates between lactose-fermenting bacteria(pink-red) and lactose-negative bacteria (no dye reaction)内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类微生物实验室中5个最基础的工作1.接种2.培养3.分离4.观察、检查5.鉴定内江师范学院 通识课微生物与人类预备工作样品采集Specimen(待试物，样品)C
33、ollection取样（取样（Specimen collection）: nearly any object or material can serve as a source of microbes. Common ones are body fluids(体液) and tissues, food, water, or soil. Specimen are removed by some form of sampling(v.取样) device. This may be a swab(涂棒), syringe(注射器), or special transport system that
34、holds, maintains, and preserves the microbes in the sample.内江师范学院 通识课微生物与人类接种与培养培养 Producing A Culture To cultivate, or culture, microorganisms, one introduce a tiny sample (the inoculums接种物) into a container of nutrient medium (培养基,pl. media), which provides the microbes with the appreciate nutrien
35、ts to sustain growth; Some microbes may require a live organism (animal, egg) as the inoculation medium.内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类2.1.2 分离: 从群体中分离出单个种类Separated One Species From AnotherThe end result of inoculation and incubation is isolation of the microbes in macroscopic form. Certain isolat
36、ion techniques are based on the concept that if an individual cell is separated from other cells and provided adequate space on a nutrient surface, it will grow into discrete mounds of cells called a colony（菌落）（菌落）.内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学
37、院 通识课微生物与人类倾倒平板技术稀释涂布平板法，可以用于样品计数，其稀释程度以最终每个平板上长出的菌落数约在30-300间为准。内江师范学院 通识课微生物与人类2.1.3 观察内江师范学院 通识课微生物与人类(a)Three tubes containing pure cultures of E.coli(white), micrococcous luteus(yellow), and Serratia mactescens(red)(b)A mixture of M.luteus and E.coli readily differentiated by their color.内江师范学院
38、 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类2.1.4 观察微生物是杆状？球状？螺旋状？微生物是杆状？球状？螺旋状？还是像个逗点？还是像个逗点？会游泳吗？呈链形排列还是葡萄会游泳吗？呈链形排列还是葡萄状？胡鞭毛吗？是否产生孢子？状？胡鞭毛吗？是否产生孢子？产酸、产气？产酸、产气？.内江师范学院 通识课微生物与人类内江师范学院 通识课微生物与人类鉴别之柯赫法则很重要龋齿感冒：普通感冒(现在已经明确知道它是一种病毒感染)引起分泌物增多，而后者则促进了多种细菌(有些无害，有些具有刺激性)，本世纪初期曾经认为这些细菌是各种伤风的病因，还提供多种抗菌剂来医治感冒。伤风应该认为是原发性病毒感染而诱
39、生继发性细菌感染。肠道紊乱而引起肠内微生物的明显改变通常是疾病的结果而不是病因。内江师范学院 通识课微生物与人类微生物无所遁形？微生物无所遁形？微生物常能狡滑地避开对其进行的检测。在菌种分离中得到更多的多样性是微生物学家孜孜以求的事。由含水沉积物或土壤这类富含微生物的自然环境中提取的脱氧核糖核酸表明，自然界中存在着实验室里培养不出来的一些细菌，它们是无法分离的“大多数”，无法将其归类于任一已知物种。Kluyver (已故卓越荷兰微生物学家)：所有的细菌培养物均是实验室的人工产物。内江师范学院 通识课微生物与人类注：N1、N2、N3、N4、N5分别表示牛肉膏蛋白胨的五个梯度培养基，Na离子浓度分
40、别为10、5、1、0.5、0.07g/L，其中N1为标准浓度培养基。10-7、10-6、10-5表示3个土样浓度。当我还是一个比较年轻的研究者时，用传统方法进行富集和当我还是一个比较年轻的研究者时，用传统方法进行富集和分离只能得到两到三种硫酸盐还原菌。几年后，在研究所中分离只能得到两到三种硫酸盐还原菌。几年后，在研究所中开发出了探寻这类细菌的新培养基和方法，使开发出了探寻这类细菌的新培养基和方法，使50多个品种得多个品种得到识别。到识别。 一位微生物学工作者。一位微生物学工作者。内江师范学院 通识课微生物与人类要使实验室中培养的微生物的表现与自然界中存在者相一致，究竟还需要多久？答案是无可奉告。 约翰波斯特盖特,英国现代微生物学家内江师范学院 通识课微生物与人类微生物常能表现出让人吃惊的菌落形状!形状隆起边缘垫形凸形的整齐 波状 叶状的 不规则（啮蚀状 丝状） 卷曲状点状内江师范学院 通识课微生物与人类枯草芽孢杆菌在枯草芽孢杆菌在营养物质缺少的营养物质缺少的平板上形成的平板上形成的,当当面对恶劣的生长面对恶劣的生长环境时环境时,细菌个体细菌个体之间能够协调形之间能够协调形动动,常形成精巧常形成精巧 结结构构(如图两种美丽如图两种美丽的雪花状菌落的雪花状菌落)内江师范学院 通识课微生物与人类Thanks!
