第八章酶子化学修饰ppt课件

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1、第第8 8章章 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰Chemical Modification of Enzyme Moleculel酶的活性中心酶的活性中心l酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的l酶化学修饰的基本原理酶化学修饰的基本原理l酶化学修饰的方法学酶化学修饰的方法学l酶化学修饰的种类酶化学修饰的种类l修饰酶的化学性质修饰酶的化学性质l酶化学修饰的应用和局限性酶化学修饰的应用和局限性主要内容主要内容 一、活性中心的概念一、活性中心的概念v 酶的必需基团酶的必需基团 (essential group): 与酶活性有关的基团与酶活性有关的基团v 酶的活性中心酶的活性中心 (active cente

2、r): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域 第一节第一节 酶的活性中心（酶的活性中心（active site）酶酶分分子子非必需基团非必需基团必需基团必需基团活性中心活性中心必需基团必需基团活性中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心 与底物相与底物相结合，使底结合，使底物与酶的一物与酶的一定构象形成定构象形成复合物复合物 影响底物中某些影响底物中某些化学键的稳定，化学键的稳定，催化底物发生化催化底物发生化学反应并将其转学反应并将其转化成产物化成产物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的

3、基团 Active siteu The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. u The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multi

4、ple weak interactions.u 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高: Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝）（兰天果拌猪肉丝）u 某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基 和羟基）是酶的必需基团。和羟基）是酶的必需基团。 活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团半胱氨酸半胱氨酸谷氨酸谷氨酸丝氨酸丝氨酸组氨酸组氨酸天冬氨酸天冬氨酸赖氨酸赖氨酸酪氨酸酪氨酸二、酶活性中心的共性二、酶活性中心的共性(1) 活性部位只占酶分子活性部位只占酶分子很小的一部分很小的一部分（1-2%）。）。(2) 活性

5、部位是一个活性部位是一个三维实体三维实体。(3) 活性中心位于酶分子表面的活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝疏水性裂缝中。中。 (4) 活性中心构象活性中心构象不是固定不变的不是固定不变的（诱导契合）。（诱导契合）。(5) 酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。等次级键结合。1. 物理学方法物理学方法2. 化学修饰法化学修饰法3. 动力学参数法动力学参数法4. 蛋白质工程蛋白质工程 三、研究酶活性中心的方法三、研究酶活性中心的方法（P13P13） 用用X射线衍射法射线衍射法直直接检测底物或其类似物接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合

6、物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相（包括酶和底物）的相对位置。对位置。1. 物理学方法物理学方法2. 化学修饰法化学修饰法u 根据所用修饰试剂不同，分为根据所用修饰试剂不同，分为: 1) 非专一性化学修饰非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。u若某基团被修饰后：若某基团被修饰后： 酶活性不变酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团该基团可能是酶的必需基团,但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合

7、。合。 活性中心基团的鉴定标准活性中心基团的鉴定标准 失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加先加S或竞或竞 加共价修饰剂加共价修饰剂 透析除去透析除去S或竞或竞 活性不丧失活性不丧失差别标记差别标记底物或抑制剂存在底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰化学修饰含同位素标记含同位素标

8、记 的同样试剂的同样试剂2) 专一性化学修饰（基团专一性修饰）专一性化学修饰（基团专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。基酸残基的侧链基团。3) 亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。成的含有活泼反应基团的底物类似物。u 作用机制：作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。修饰标记。u 亲和修饰剂：亲和修饰剂：与与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲

9、和力结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。的基团形成稳定的共价键。3) 亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰）化学修饰的专一性化学修饰的专一性3. 动力学参数法动力学参数法 pH-酶活力关系的研究，可得到参与反应的必酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需基团的需基团的pK值，通过比较分析估计基团的种类。值，通过比较分析估计基团的种类。4. 蛋白质工程蛋白质工程 将酶相应的将酶相应的cDNA定点突

10、变定点突变，突变的，突变的cDNA只表只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。一、酶化学修饰一、酶化学修饰1. 限制酶大规模应用的原因：限制酶大规模应用的原因：1) 易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；2) 容易受产物和抑制剂的抑制；容易受产物和抑制剂的抑制；3) 工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；的最适酸度和温度范围内；4) 底物不溶于水，或酶的米式常数过高；底

11、物不溶于水，或酶的米式常数过高；5) 酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。酶制剂的应用。 第二节第二节 酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的1) 通过通过分子修饰分子修饰的方法来改变已分离出来的天然的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。酶的活性。蛋白质水平蛋白质水平2) 通过通过基因工程基因工程方法改变编码酶分子的基因而达方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。到改造酶的目的。核酸水平核酸水平2. 改变酶特性的两种主要方法：改变酶特性的两种主要方法：l 酶酶的的化学修饰（化学修饰（chemical modification）通过化学基团

12、的引入或除去，使酶的共价结构发生通过化学基团的引入或除去，使酶的共价结构发生改变。改变。l 酶的选择性化学修饰：酶的选择性化学修饰：在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基发生共价的化学改变。或其功能基发生共价的化学改变。3. 酶化学修饰的概念酶化学修饰的概念1. 研究酶的结构与功能的关系（研究酶的结构与功能的关系（50年代末）年代末）探测酶活性必需氨基酸的性质和数目探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构

13、变化与运动酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶的固定化技术酶纯度的分析与检测酶纯度的分析与检测二、酶化学修饰的目的二、酶化学修饰的目的2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围（范围（70年代末之后）年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（

14、针对特异性反应降低生物识别能力）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。二、酶化学修饰的目的二、酶化学修饰的目的一、增强酶天然构象的稳定性与耐热性一、增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联，使酶的天然构象产生多点交联，使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。二、保护酶活性部位与抗抑制剂二、保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶的活性部了酶的活性部

15、位。位。第三节第三节 酶化学修饰的基本原理酶化学修饰的基本原理酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子，酶分子，“遮盖遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上敏感键免遭破坏。2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。受蛋白水解酶破坏的可能性。三、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶三、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成酶蛋白氨基酸组成的抗原决定

16、簇，与修饰剂形成了共价键。了共价键。 破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成面形成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。维持酶活性部位微环境相对稳定。四、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境四、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 一、充分认识酶分子的特性一、充分认识酶分子的特性 包括酶的包括酶的 1. 活性部位情况活性部位情况 2. 稳定条件及反

17、应最佳条件稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性侧链基团的化学性质及反应活泼性第四节第四节 酶化学修饰的方法学酶化学修饰的方法学要考虑要考虑 1. 修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）子量） 2. 修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）的反应活性基团） 3. 修饰剂上反应基团的活化方法与条件修饰剂上反应基团的活化方法与条件二、修饰剂的选择二、修饰剂的选择要注意要注意 1. 酶与修饰剂的分子比例酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、反应体系的溶剂性质

18、、盐浓度、pH条件条件 3. 反应温度及时间反应温度及时间三、反应条件的选择三、反应条件的选择 一、酶的表面化学修饰一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）（一）大分子修饰（大分子结合修饰）（二）小分子修饰（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）（三）交联修饰（交联法）（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）（四）固定化修饰（共价偶联法） 二、酶分子内部修饰二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰（三）金属离子置换修饰第五节第五节

19、酶化学修饰的种类酶化学修饰的种类（一）大分子修饰（大分子结合修饰）（一）大分子修饰（大分子结合修饰）P295n 定义：定义： 利用利用水溶性大分子水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 n 修饰剂：修饰剂： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、）、右旋糖酐（右旋糖酐（dextran）、）、肝素肝素（heparin）、糖肽（、糖肽（glycopeptide）等。）等。n 修饰方法：修饰方法： 修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合

20、。1. 聚乙二醇的修饰反应聚乙二醇的修饰反应聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）：线性大分子，具有良好的生物：线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，可消除酶分子的抗原性，广泛用于酶的修饰。原性，可消除酶分子的抗原性，广泛用于酶的修饰。PEG末端活化末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，产生许多有用的性质，如可在广泛的产生许多有用的性质，如可在广泛的pH范围内溶范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率

21、下降等。解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降等。修饰方法：修饰方法：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均嗪法、羰叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均嗪法、羰二亚胺法、重氮法二亚胺法、重氮法。 (1) 叠氮法叠氮法(2) 琥珀酸酐法琥珀酸酐法（3）三氯均嗪法）三氯均嗪法（4）羰二亚胺法）羰二亚胺法（5）重氮法）重氮法2. 糖类的修饰反应：糖类的修饰反应：(1) 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应右旋糖苷：右旋糖苷： -葡萄糖通过葡萄糖通过 -1, 6-糖苷键连接而成，糖苷键连接而成，双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。修饰方法：

22、修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法溴化氰法、高碘酸氧化法。(2) 糖肽（糖肽（Glycopeptide)的修饰反应的修饰反应: 糖肽：人纤维蛋白或糖肽：人纤维蛋白或 - 球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。分子上的游离氨基活化后可与酶分子上的氨基反应。修饰方法：修饰方法：2,3-异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。异氰酸甲苯活化法、戊二醛法。(3) 聚乳糖修饰反应：聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。酶分子上氨基反应。3. 其他大分子多聚物的修饰反应其他

23、大分子多聚物的修饰反应(1) 聚聚N - 乙烯吡硌烷酮乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为用水溶性的分子量为10,000的的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。，经过开环水解活化后，与酶结合。(2) 聚乙烯醇聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。基共价连接。(3) 聚丙烯醇聚丙烯醇(PAA):用分子量为用分子量为250,000的的PAA，经过经过N - 羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。(4) 聚顺丁烯二酸酐

24、聚顺丁烯二酸酐:用分子量为用分子量为98,000的聚顺丁烯二的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。(5) 聚氨基酸：聚氨基酸：用分子量为用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。以与酶发生反应。聚丙烯醇聚丙烯醇(PAA)修饰酶修饰酶:4. 天然大分子对酶的修饰反应天然大分子对酶的修饰反应(1) 肝素：肝素：由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均由

25、氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为分子量约为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。，是一种含硫酸酯的黏多糖。经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。脂等活性。修饰方法：羰二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法修饰方法：羰二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法(2) 人血清白蛋白：人血清白蛋白：相对分子质量大相对分子质量大修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活性酯法修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活性酯法5. 大分子修饰酶的应用大分子修饰酶的应用u PEG超氧化物歧化酶（超

26、氧化物歧化酶（SOD） PEG溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（ASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期u 用用Dextran修饰修饰 -淀粉酶，淀粉酶， 淀粉酶，胰蛋白淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：酶、过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。（二）小分子修饰（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）P285u 定义：定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链上特定的功能基团

27、发生化学反应。u 侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。u 20种不同氨基酸的侧链基团中只有种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸极性氨基酸的侧的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。链易被修饰，它们一般具有亲核性。u 侧链基团修饰剂：侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。采用的各种小分子化合物。 根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R基的极性，基的极性，20种氨基酸可分成种氨基酸可分成4类类。u 非极性非极性R基氨基酸基氨基酸（共（共8种）：种）： 丙氨酸丙氨酸 (A

28、lanine, Ala, A), 亮氨酸亮氨酸 (Leucine, Leu, L), 缬氨酸缬氨酸 (Valine, Val, V), 异亮氨酸异亮氨酸 (Isoleucine, Ile, I), 苯丙氨酸苯丙氨酸 (Phenylalanine, Phe, F), 色氨酸色氨酸 (Tryptophan, Trp, W), 甲硫氨酸甲硫氨酸 (Methionine, Met, M), 脯氨酸脯氨酸 (Proline, Pro, P)u 无电荷的极性无电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共7种）：种）： 丝氨酸丝氨酸 (Serine, Ser, S), 苏氨酸苏氨酸 (Threonine, Thr,

29、 T), 酪氨酸酪氨酸 (Tyrosine, Tyr, Y), 半胱氨酸半胱氨酸 (Cysteine, Cys, C), 天冬酰胺天冬酰胺 (Asparagine, Asn, N), 甘氨酸甘氨酸 (Glycine, Gly, G), 谷氨酰胺谷氨酰胺 (Glutamine, Gln, Q)u带正电荷的极性带正电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共3种）：种）： 赖氨酸赖氨酸 (Lysine, Lys, K), 精氨酸精氨酸 (Arginine, Arg, R), 组氨酸组氨酸 (Histidine, His, H)u带负电荷的极性带负电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共2种）：种）： 天冬氨酸

30、天冬氨酸 (Aspartic acid, Asp, D), 谷氨酸谷氨酸 (Glutamic acid, Glu, E)烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应u 几种重要的修饰反应：几种重要的修饰反应：1. 化学修饰反应的类型化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应烷基化反应试试剂剂特特点点：烷烷基基上上带带活活泼泼卤卤素素，导导致致酶酶分分子子的的亲亲核核基团（如基团（如NH2，-SH等）发生烷基化。等）发生烷基化。可作用基团：可作用基团： 氨氨基基（Lys，Arg），巯巯基基（Cys），羧羧基基（Asp、Glu），），甲硫基（甲硫基（Met），

31、），咪唑基（咪唑基（His）。）。修饰剂：修饰剂：2, 4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应烷基化反应 2) 酰基化反应酰基化反应试剂特点：试剂特点： 含含有有 结结构构，作作用用于于侧侧链链基基团团上上的的亲亲核核基基团团，使之酰基化。使之酰基化。可作用基团：可作用基团： 氨氨基基，巯巯基基，醇醇羟羟基基（Ser、Thr），酚酚羟羟基基（Tyr）酰基化反应酰基化反应 3) 氧化和还原反应氧化和还原反应试剂特点：试剂特点：具有氧化性或还原性。具有氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 可可被被氧氧化化的的侧侧链链

32、基基团团：巯巯基基、甲甲硫硫基基、吲吲哚哚基基、咪唑基、酚基等。咪唑基、酚基等。还原剂：还原剂：2-巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。 可被还原的侧链基团：二硫键可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于还原逆回，用于保护巯基保护巯基。 4) 芳香环取代反应芳香环取代反应u 试剂：卤（碘）化、硝化试剂试剂：卤（碘）化、硝化试剂（四硝基甲烷）（四硝基甲烷）I2+HI(NO2)4C+(NO2)3CH2. 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1) 氨基的化学修饰：氨基的化学修饰：u来源：来源：Lys、 Arg、Hisu修饰反应

33、：修饰反应：酰基化、烷基化酰基化、烷基化u酰基化酰基化修饰剂修饰剂: 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）、）、丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）u烷基化烷基化修饰剂：修饰剂： 2, 4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）、）、碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等亚硝酸等三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸碘乙酸 2) 羧基的化学修饰羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。 常用常用水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目。量测定酶分子中羧基的数目。+水溶性碳化二亚胺水溶性

34、碳化二亚胺3) 胍基的化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：Arg修饰反应：修饰反应：本质上是本质上是羰基羰基对对氨基氨基酰基化酰基化。修饰剂：修饰剂： 丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1，2环己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛4) 巯基的化学修饰巯基的化学修饰 来源：来源：Cys 修饰反应修饰反应: 烷基化烷基化 修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM)E-SH+R-XE-SR+HXN-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEM）:常用的专一修饰巯基试剂常用的专一修饰巯基试剂ESH5) 二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原：还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇巯基乙醇、二硫苏糖

35、醇（DTT） 6) 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：His 修饰反应修饰反应: 酰基化、烷基化酰基化、烷基化 酰基化酰基化修饰剂修饰剂: 焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）+C2H5OH+CO2 烷基化烷基化修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸+ICH2COOH+HI7）酚羟基的化学修饰）酚羟基的化学修饰来源：来源：Tyr修饰反应：修饰反应：芳香环取代反应芳香环取代反应修饰剂：修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）碘、硝化试剂（四硝基甲烷）8）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰 来源：来源：Trp 修饰反应：修饰反应：氧化反应氧化反应 修饰剂：修饰剂：

36、N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂Lys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺Arg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮Cys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚酚羟基羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷Trp吲哚基吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺溴

37、代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂u 对修饰效果的解释须十分小心：对修饰效果的解释须十分小心：任何一种修饰剂不是绝对专一的。任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，失活， 不一不一定是活性中心基团被共价修饰。定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团不易被修饰。必需基团不易被修饰。（三）交联修饰（交联法）（三）交联修饰（交联法） 分子内交联分子内交联：提高酶稳定性的有效方法之一：提高酶稳定性的有效方法之一例：胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚

38、胺活化后，可例：胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。 分子间交联分子间交联：形成杂化酶：形成杂化酶例：用戊二醛交联胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以降例：用戊二醛交联胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型，可酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型，可在体内将它们输送到同一部位而提高药效。在体内将它们输送到同一部位而提高药效。（四）固定化修饰（共价偶联法）（四）固定化修饰（共价

39、偶联法） 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生、最适温度和稳定性发生改变。改变。（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）P285蛋白主链修饰利用酶分子主链的切断和连接，蛋白主链修饰利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。变，从而改变酶的特性和功能的方法。采用酶法采用酶法 酶蛋白主链修饰主

40、要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法（用酶原激活法（用专一性较强的专一性较强的蛋白酶或肽酶蛋白酶或肽酶为修饰剂）。为修饰剂）。u 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：况中的一种：1. 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2. 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3. 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。部位，酶活力提高。u 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，后两种情况，肽链的水解

41、在限定的肽键上进行，称称肽链有限水解。肽链有限水解。 应用实例应用实例1 1）提高酶活力：）提高酶活力：u 胃蛋白酶原的激活胃蛋白酶原的激活 u 天门冬氨酸切除天门冬氨酸切除1010个氨基酸残基，可使其活力提个氨基酸残基，可使其活力提高高4-54-5倍。倍。胰蛋白酶原（胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活的激活 2）消除抗原性）消除抗原性一般大分子的外源蛋白抗原性较强，经肽链有限一般大分子的外源蛋白抗原性较强，经肽链有限水解，降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。水解，降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除

42、去了了2/3肽链，酶活性不变，抗原性大大降低。肽链，酶活性不变，抗原性大大降低。u 肽链上氨基酸发生置换，引起酶蛋白空间构象的肽链上氨基酸发生置换，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。改变，从而改变酶的某些特性和功能。u 方法：化学修饰法、蛋白质工程方法：化学修饰法、蛋白质工程（二）氨基酸置换修饰（二）氨基酸置换修饰1. 化学修饰法化学修饰法例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的的丝氨酸丝氨酸转换为转换为半胱氨酸半胱氨酸，修饰后，该酶失去对，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯蛋白质和多肽的水解能力，却出

43、现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。酯等底物水解的活性。化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。生产。2. 蛋白质工程：利用基因操纵技术。蛋白质工程：利用基因操纵技术。u定点突变定点突变1、基因序列分析、基因序列分析2、蛋白质结构分析、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达、酶基因克隆表达6、变异特性分析、变异特性分析u改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能改变酶分子中所含的金

44、属离子，使酶的特性和功能发生改变。发生改变。u例：例：-淀粉酶中的钙离子淀粉酶中的钙离子(Ca2+)，谷氨酸脱氢酶中的，谷氨酸脱氢酶中的锌离子锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+、Zn2+) u从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种

45、金属催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。（三）金属离子置换修饰（三）金属离子置换修饰第六节第六节 修饰酶的化学性质修饰酶的化学性质一、热稳定性：一、热稳定性： 一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性（子构象的稳定性（表表6-1）。）。二、抗原性：二、抗原性： 修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前

46、比较公修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好（方面效果较好（表表6-2）。）。三、对各类失活因子的抵抗力三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然化学修饰酶与天然酶相比，对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均酶相比，对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（有不同程度的提高（表表6-3）。）。四、修饰酶在体内的半衰期：四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（半衰期得到有效延长（表表6-4） 。五、最适五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适大多数酶

47、经化学修饰后，最适pH发生发生了变化，这在应用上具有重要意义（了变化，这在应用上具有重要意义（表表6-5） 。六、六、Km 的变化的变化:有些酶经化学修饰后，有些酶经化学修饰后，Km变大，变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。（这可能是由于屏蔽效应引起的。（表表6-6）第七节第七节 酶化学修饰的应用和局限性酶化学修饰的应用和局限性一、酶化学修饰的应用一、酶化学修饰的应用n 医药方面：医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。低免疫原性和抗原性。n 生物技术领域

48、：生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热、酸、化学修饰酶能够提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐受性，改变酶的底物专一性和最碱和有机溶剂的耐受性，改变酶的底物专一性和最适适pH等酶学性质。等酶学性质。 n酶结构功能研究：酶结构功能研究：1. 研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；心研究；2. 确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的功能；3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量。测定酶分子中某种氨基酸的数量。二、酶蛋白化学修饰的局限性二、酶蛋白化学修饰的局限性1. 某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是是相对

49、的，相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。化学修饰剂。2. 化学修饰后酶的化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变构象或多或少都有一些改变，因，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3. 酶的化学修饰只能在酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基具有极性的氨基酸残基侧链侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4. 酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关酶化学修饰的结果对于研究酶结构

50、与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需必需”的，为什么是必需的，还得用的，为什么是必需的，还得用X射线射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚构与功能关系尚缺乏准确性缺乏准确性和和系统性。系统性。思考题：思考题：1. 酶活性中心的共性是什么？酶活性中心的共性是什么？2. 名词解释：酶分子化学修饰名词解释：酶分子化学修饰3. 酶分子的化学修饰方法有哪些？酶分子的化学修饰方法有哪些？4. 化学修饰剂与酶蛋

51、白反应的类型有哪些化学修饰剂与酶蛋白反应的类型有哪些？5. 酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修饰反应有哪些？饰反应有哪些？6. 分析说明修饰酶的性质。分析说明修饰酶的性质。表表6-1 天然酶和修饰酶的热稳定性比较天然酶和修饰酶的热稳定性比较 酶酶 修饰剂修饰剂 修饰酶修饰酶 处理条件处理条件(/时间时间) 残留酶活残留酶活(%)酰苷脱氢酶酰苷脱氢酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 过氧化氢酶过氧化氢酶 溶菌酶溶菌酶 尿激酶尿激酶糜蛋白酶糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min

52、100/30min 50/10min 100/30min 37/48h 37/24h 70 100 46 64 40 90 20 99 80 0 95 50 天然酶天然酶酶酶L-Asn 酶酶SOD酶酶 Gln-Aln 酶酶尿酸酶尿酸酶腺苷脱氢酶腺苷脱氢酶Arg 酶酶过氧化氢酶过氧化氢酶胰蛋白酶胰蛋白酶抗原性抗原性修饰剂修饰剂 - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶核糖核酸酶酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除降降 低低降降 低低消消 除除表表6-2 修饰酶的抗原性变化

53、修饰酶的抗原性变化表表6-3 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶酶抗抑制剂抗抑制剂抗蛋白酶抗蛋白酶修饰剂修饰剂抗失活剂抗失活剂过氧化氢酶过氧化氢酶核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白酶胰蛋白酶 - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶尿激酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗抗SDS抗大豆抑制剂抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂抗胎盘抑制剂抗尿素抗尿素抗抗SDS表表6-4 天然酶与修饰酶的半衰期比较天然酶与修饰酶的半衰期比较酶酶

54、羧肽酶羧肽酶Arg 酶酶Gln-Asn酶酶尿酸酶尿酸酶超氧化物岐化酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶过氧化氢酶修饰剂修饰剂半衰期半衰期天然酶天然酶修饰酶修饰酶白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白糖肽糖肽右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5 h17 h1.4 h1 h4 h6 min6 h12 h8 h20 h4 h8 h表表6-5 天然酶与修饰酶的最适天然酶与修饰酶的最适pH酶酶修饰酶修饰酶天然酶天然酶修饰剂修饰剂糜蛋白酶糜蛋白酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶吲哚吲哚-3 -链烷羟化酶链烷羟化酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶白蛋白白蛋白PEGPEG聚丙烯酸聚丙烯酸肝肝 素素10.57.4 - 8.55.0 - 5.59.08.83.58.28.28.09.0 表表6-6 天然酶与修饰酶的天然酶与修饰酶的Km值值