高中生物选修一的课件集

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1、专题专题1果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作一、制作果酒果醋的微生物：一、制作果酒果醋的微生物：酵母菌酵母菌真菌真菌醋酸菌醋酸菌细菌细菌二、两种微生物的分类地位二、两种微生物的分类地位1.制作果酒制作果酒酵母菌酵母菌2.制作果醋制作果醋醋酸菌醋酸菌菌种菌种名称名称生物学生物学分类分类代谢代谢类型类型适宜适宜温度温度繁殖方繁殖方式式对氧的需求对氧的需求酵母菌酵母菌真核生真核生物物异养异养兼性厌氧兼性厌氧最适最适2020出芽生出芽生殖殖前期需氧，前期需氧，后期不需氧后期不需氧醋酸菌醋酸菌 原核生原核生物物异养异养需氧需氧30303535二分裂二分裂一直需氧一直需氧控制空气的一些措施控制空气的一些措施

2、控制空气的一些措施控制空气的一些措施三、繁殖方式和代谢类型三、繁殖方式和代谢类型出出出出芽芽芽芽生生生生殖殖殖殖二二二二分分分分裂裂裂裂生生生生殖殖殖殖比较比较果酒制作果酒制作果醋制作果醋制作制作制作原理原理 酵母菌先在有酵母菌先在有氧条件下大量繁殖，氧条件下大量繁殖，再在无氧条件下进再在无氧条件下进行酒精发酵行酒精发酵 醋酸菌在氧气、醋酸菌在氧气、糖源充足时糖源充足时, ,将糖分解将糖分解成醋酸；成醋酸； 当缺少糖源时，当缺少糖源时，将乙醇变为乙醛，再将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸将乙醛变为醋酸四、四、制作原理和发酵条件的比较制作原理和发酵条件的比较制作果酒制作果酒制作果酒制作果酒制作果醋

3、制作果醋制作果醋制作果醋最适发最适发最适发最适发酵温度酵温度酵温度酵温度18181818252525253030303035353535对氧对氧对氧对氧的需求的需求的需求的需求前期：需氧前期：需氧前期：需氧前期：需氧后期：不需氧后期：不需氧后期：不需氧后期：不需氧需充足氧需充足氧需充足氧需充足氧pHpHpHpH酸性环境酸性环境酸性环境酸性环境（3.33.53.33.5）酸性环境酸性环境酸性环境酸性环境（5.46.35.46.3）发酵时间发酵时间发酵时间发酵时间1010101012 d12 d12 d12 d7 7 7 7 8 d 8 d 8 d 8 dC6H12O6+6O2+6H2O 6CO2

4、+12H2O+能量能量酶酶1、有氧呼吸：、有氧呼吸：C6H12O6 2C2H5OH+2 CO2+能量能量酶酶2、无氧呼吸：、无氧呼吸：酵母菌酵母菌制酒制酒制作果酒（前期需氧，后期厌氧）制作果酒（前期需氧，后期厌氧）出芽生殖，出芽生殖，出芽生殖，出芽生殖，增加酵母菌数量增加酵母菌数量增加酵母菌数量增加酵母菌数量产生酒精产生酒精产生酒精产生酒精1 1、若氧气、糖源充足时若氧气、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，其反应式：分解成醋酸，其反应式：酶酶 C6H12O6 3CH3COOH（醋酸）（醋酸）2 2、若缺少糖源，氧气不足时，若缺少糖源，氧气不足时，醋酸菌将乙醇变为

5、醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，其反应式：乙醛，再将乙醛变为醋酸，其反应式： 酶酶2C2H5OH+O2 2CH3CHO（乙醛）（乙醛）+2H2O酶酶2CH3CHO+O2 2CH3COOH（醋酸）（醋酸）醋酸菌醋酸菌制醋制醋制作果醋（一直需要氧）制作果醋（一直需要氧） 五、实验流程示意图五、实验流程示意图1 1、材料的选择与处理材料的选择与处理 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，除去枝梗。除去枝梗。、取葡萄、取葡萄500g500g，去除枝梗和腐烂的叶子。，去除枝梗和腐烂的叶子。、用清水冲洗葡萄、用清水冲洗葡萄1 12 2次除去污物。次除去污物

6、。 讨论：讨论：你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会六、实验操作六、实验操作2 2、清洗（、清洗（WHYWHY？）？）3 3、榨汁榨汁 将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。4 4、发酵：发酵装置如下、发酵：发酵装置如下5 5、注意事项、注意事项将葡萄汁装人发酵瓶，将葡萄汁装人发酵瓶， 要留大约要留大约1 13 3的空间的空间 ( (如图右图所示

7、如图右图所示) )，并封，并封闭充气口。闭充气口。（为什么？）（为什么？） 塑料瓶中不能装满葡萄液汁，应留一定空间，塑料瓶中不能装满葡萄液汁，应留一定空间，有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖形成种群优势。有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖形成种群优势。防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染70%70%70%70%酒精消毒酒精消毒酒精消毒酒精消毒制葡萄醋制葡萄醋的过程中，要适时的过程中，要适时通过充气口充气通过充气口充气。 将温度严格控制在将温度严格控制在30303535， 时间控制在前时间控制在前7

8、78d8d左右。左右。制葡萄酒制葡萄酒的过程中，要的过程中，要严格密闭严格密闭， 将温度严格控制在将温度严格控制在18182525， 时间控制在时间控制在101012d12d左右左右，可通过出料口对发酵，可通过出料口对发酵的情况进行。及时的监测。的情况进行。及时的监测。 专题专题2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题课题1 1微生物的实验室培养微生物的实验室培养. .微生物的类群微生物的类群微微生生物物原核类原核类: :真核类真核类非细胞类：非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结构简单个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌酵母菌、霉菌、食用菌真菌：真

9、菌：原生生物：原生生物： 显微藻类、原生生物显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形（如：草履虫、变形虫等）虫等）病毒、类病毒、朊病毒病毒、类病毒、朊病毒微生物的共同特点：微生物的共同特点：一一. .微生物基础知识微生物基础知识1.1.细菌的形态细菌的形态细菌主要是以二分裂的方式细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）进行增殖（如右图）2.2.细菌的繁殖细菌的繁殖3.3.细菌的菌落细菌的菌落. .定义：定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。一定形态结构的子细

10、胞群体，叫做菌落。. .特征：特征： 大小、形状、光泽度、颜色、硬度、大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。透明度等。. .功能：功能： 每种细菌在一定条件下所形成的菌落，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以可以作为菌种鉴定的重要依据作为菌种鉴定的重要依据。几种菌落及其形态几种菌落及其形态4.4.病毒的结构病毒的结构 : :由核酸和蛋白质构成。由核酸和蛋白质构成。病毒的结构病毒的结构吸附吸附吸附吸附注入注入注入注入合成合成合成合成释放释放释放释放组装组装组装组装5.5.病毒的繁殖病毒的繁殖病毒的增殖一般可分五个阶段，即：病毒的增殖一般可分五个阶段，即：吸附吸附注入核酸注入核酸合成核酸和蛋

11、白质合成核酸和蛋白质组装组装释放释放6.6.病毒的营养方式病毒的营养方式：寄生：寄生微生物需要的五大类营养要素物质是：微生物需要的五大类营养要素物质是：. .微生物需要的营养物质及功能微生物需要的营养物质及功能1.1.碳源碳源 2.2.氮源氮源 3.3.生长因子生长因子 4.4.无机盐无机盐 5.5.水水：凡是能为微生物提供所需碳元素的：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。营养物质。无机碳源：无机碳源：COCO2 2；NaHCONaHCO3 3等等有机碳源：有机碳源：糖类糖类、脂肪酸、花生、脂肪酸、花生粉饼、石油等粉饼、石油等构成细胞物质和一些代谢产物构成细胞物质和一些代谢产物异养微生物的

12、能源异养微生物的能源. .概念概念. .来源：来源：. .作用：作用：1.1.微生物的碳源微生物的碳源无机氮源：无机氮源：无机氮源：无机氮源：N N N N2 2 2 2、NHNHNHNH4 4 4 4+ + + +、NONONONO3 3 3 3- - - -、NHNHNHNH3 3 3 3等。等。等。等。有机氮源：有机氮源：有机氮源：有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等基酸等基酸等基酸等凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供N N N N元素的营养物质。元素的营养物质。元素

13、的营养物质。元素的营养物质。主要用于合成蛋白质、核酸及含主要用于合成蛋白质、核酸及含主要用于合成蛋白质、核酸及含主要用于合成蛋白质、核酸及含N N N N的代谢产的代谢产的代谢产的代谢产物。物。物。物。2.2.微生物的氮源微生物的氮源. . . .概念：概念：概念：概念：. . . .来源：来源：来源：来源：. . . .作用：作用：作用：作用：3.3.生长因子生长因子. . . .常见的生长因子：常见的生长因子：常见的生长因子：常见的生长因子：. . . .概念：概念：概念：概念：. . . .作用：作用：作用：作用：微生物生长不可缺少的微量有机物。微生物生长不可缺少的微量有机物。微生物生长

14、不可缺少的微量有机物。微生物生长不可缺少的微量有机物。酶和核酸的组成成分。酶和核酸的组成成分。酶和核酸的组成成分。酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。. .培养基培养基 培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制而成由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质。基质。1.1.培养基的类型和用途培养基的类型和用途2.2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方方( (参考教材附录内容参考教材附录内容) )3

15、.3.不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、氮氮源源、无机盐无机盐、等等营养物质，另外还需要满足微营养物质，另外还需要满足微生物生长对生物生长对pHpH、特殊营养物质特殊营养物质, ,例如例如: :生长因子生长因子( (即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物, ,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) )以及以及氧氧气气、二氧化碳二氧化碳、渗透压渗透压等等的要求。的要求。 划分划分标准准培养基种培养基种类特点特点用途用途物理性物理性质化学成分化学成分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基用途用途鉴

16、别培养基培养基培养基的种类培养基的种类不加凝固不加凝固剂加凝固加凝固剂，如，如琼脂脂工工业生生产观察微生物的运察微生物的运动、分分类鉴定定微生物分离、微生物分离、鉴定、定、活菌活菌计数、保藏菌数、保藏菌种种含化学成分不明确的天然物含化学成分不明确的天然物质工工业生生产培养基成分明确培养基成分明确分分类、鉴定定在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质, ,以抑制不需要的微生物的以抑制不需要的微生物的生生长, ,促促进所需要的微生物的所需要的微生物的生生长培养、分离出特培养、分离出特定微生物定微生物在培养基中加入某种指示在培养基中加入某种指示剂或化学或化学药品品, ,用以用以鉴别不同种不

17、同种类的微生物的微生物鉴别不同种不同种类微微生物生物选择培养基培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长沉淀生长沉淀生长backbackbackback半固体培养基：半固体培养基：( (是否运动是否运动) ) 无动力无动力无动力无动力有动力有动力有动力有动力( ( ( (弥散弥散弥散弥散) ) ) )固体培养基：菌落固体培养基：菌落分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞几种选择培养基几种选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养

18、基分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基backbackbackback血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子； 激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细

19、人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。（如血清）。. .无菌技术无菌技术1.1.1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念无菌技术的概念无菌技术的概念 无菌操作泛指无菌操作泛指无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂在培养微生物的操作中，所有防止杂在培养微生物的操作中，所有防止杂在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。菌污染的方法。菌污染的方法。菌污染的方法。消毒定义：消毒定义：消毒定义：消毒定义： 利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理方法，杀死利用化学或物理

20、方法，杀死部份部份部份部份微生物的过程。微生物的过程。微生物的过程。微生物的过程。2.2.2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别 灭菌的定义：灭菌的定义：灭菌的定义：灭菌的定义：以化学试剂或物理方法消灭以化学试剂或物理方法消灭以化学试剂或物理方法消灭以化学试剂或物理方法消灭所有所有所有所有微生物，包微生物，包微生物，包微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到到到到完全无菌完全

21、无菌完全无菌完全无菌之过程。之过程。之过程。之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。也是最重要的技术。也是最重要的技术。也是最重要的技术。煮沸消毒法：煮沸消毒法：100100煮沸煮沸5-6min5-6min。巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-7570-75下煮下煮30min30min或或 8080下煮下煮15min15min。化学药剂消毒法：用化学药剂消毒法：用75%75%酒精、新洁尔酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。

22、紫外线消毒。紫外线消毒。. .消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌：干热灭菌：160-170 160-170 下加下加热热1-2h1-2h。高压蒸气灭菌：高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min. .灭菌的方法：灭菌的方法： 最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。分不

23、被破坏。 有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌。为。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。不能通过。 而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。 二二. .实验

24、操作实验操作( (以培养大肠杆菌为例以培养大肠杆菌为例) ). .制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基1.1.计算计算2.2.称量称量3.3.溶化溶化4.4.灭菌灭菌: : 将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa100kPa、温度为、温度为121121，灭菌，灭菌151530min30min。5 5. .倒平板倒平板: : 待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯左右时，在酒精灯附近倒平板。附近倒平板。2d2d后观察平板，无杂菌污染才可后观察平板，无杂菌污染才可用来接种用来接种。倒倒平平板板操操作作. .纯化大肠杆菌纯化大肠

25、杆菌平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法。微生物的接种的微生物的接种的常用接种方法有常用接种方法有：1.1.平板划线的操作方法平板划线的操作方法平板划线的操作平板划线的操作一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。状的菌落。2.2.稀释涂布平板稀释涂布平板的操作方法的操作方法4.4.菌种的保存菌种的保存接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长

26、成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。3.3.微生物的恒温培养微生物的恒温培养. .长期保存：长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法. .临时保藏：临时保藏：三三. .结果分析与评价结果分析与评价 . . . .培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 1 1 12d2d2d2d后无菌落生长后无菌落生长后无菌落生长后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制

27、备。，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。. . . .接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求

28、的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。. . . .是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录培养培养培养培养12h12h12h12h与与与与24h24h24h24h后的

29、大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。些细微的变化。些细微的变化。些细微的变化。营养类型营养类型营养类型营养类型能源能源能源能源氢的供体氢的供体氢的供体氢的供体基本碳源基本碳源基本碳源基本碳源微生物举例微生物举例微生物举例微生物举例代谢类型代谢类型光能无机营养光能无机营养光能无机营养光能无机

30、营养( ( ( (光能自养型光能自养型光能自养型光能自养型) ) ) )光能有机营养光能有机营养光能有机营养光能有机营养( ( ( (光能异养型光能异养型光能异养型光能异养型) ) ) )化能无机营养化能无机营养化能无机营养化能无机营养( ( ( (化能自养型化能自养型化能自养型化能自养型) ) ) )化能有机营养化能有机营养化能有机营养化能有机营养( ( ( (化能异养型化能异养型化能异养型化能异养型) ) ) )光光光光光光光光无无无无机机机机物物物物有有有有机机机机物物物物无机物无机物无机物无机物有机物有机物有机物有机物无机物无机物无机物无机物有机物有机物有机物有机物二氧化碳二氧化碳二氧

31、化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳及简单有及简单有及简单有及简单有机物机物机物机物二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳有机物有机物有机物有机物大多数已知细大多数已知细大多数已知细大多数已知细菌和全部真核菌和全部真核菌和全部真核菌和全部真核微生物微生物微生物微生物硝化细菌硝化细菌硝化细菌硝化细菌氢细菌氢细菌氢细菌氢细菌紫色非硫细菌紫色非硫细菌紫色非硫细菌紫色非硫细菌蓝细菌蓝细菌蓝细菌蓝细菌绿色硫细菌绿色硫细菌绿色硫细菌绿色硫细菌藻类藻类藻类藻类本课题知识小结本课题知识小结: :课题课题2 2土壤中分解尿素的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数细菌的分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素

32、的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶脲酶脲酶 + H+ H2 2O O+ CO+ CO2 22NH2NH3 33 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒

33、状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例： PCRPCR技术技术技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的时要根据它对生存环境的要求，到要求，到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度7070808

34、00 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶多聚酶链式反应链式反应是一是一种在种在体外将少量体外将少量DNADNA大量大量复制复制(PCR)(PCR)的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。. .筛选菌株筛选菌株 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，点，包括营养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等；方法：方法： 抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株

35、的的生长生长结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微，同时抑制或阻止其他微生物生长。生物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4

36、gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素，只，只，只，只有能合成有能合成有能合成有能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物才的微生物才的微生物才的微生物才能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为能分解尿素，以尿素作为氮源。氮源。氮源。

37、氮源。缺乏缺乏缺乏缺乏脲酶的微生物脲酶的微生物脲酶的微生物脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿养基就能够选择出分解尿素的微生物。素的微生物。素的微生物。素的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生

38、物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基尿素尿素尿素尿素6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板( (血细胞计数板血细胞计数板），在

39、显微镜，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。下计算一定容积里样品中微生物的数量。. .统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一

40、个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的

41、重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不不一一致致，意意味味着着操操作作有有误误，需需要要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平板中个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M某同学在稀释倍数为106

42、的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影

43、响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或或者者是是混混入入了了其其他他的的含氮物质含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对

44、照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学由其他同学用与用与A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的湿湿润润土土壤壤中

45、中取取样样。先先铲铲去去表表层层土土3 3 cmcm左左右右，再再取取样样，将将样样品品装装入入事事先先准准备备好的信封中。好的信封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基” 一一 土壤取样土壤取样数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%70%90%90%是细菌是细菌取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 二二 制备培养基制备培养基 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。准备准备牛肉膏蛋白胨

46、培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释每个稀释度下需要度下需要3个选择培养基，个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要需要8个灭菌试管和个灭菌试管和1个灭菌移液管个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了基是否起到了选择选择作用。作用。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁

47、称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030303030

48、0300300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（三）（三）样品的稀释样品的稀释问问题题：为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 18

49、5185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。. .取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落

50、数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。. .微生物的培养与观察微生物的培养与观察

51、在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察操作提示操作提示 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的

52、小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。 三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间 三、三、四四. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物

53、有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。1.1.在以在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚

54、红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将升高，指示剂将变红变红，说明该细菌能够，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。2.2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到滤膜放到 伊红伊红- -美蓝美蓝 培养基上培养，大培养基上培养，大肠杆菌肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记算得出水，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。样中大肠杆菌的数量。五五. .课外延伸课外延伸大肠杆菌呈深紫色大肠杆菌呈深紫色, ,中心有或无金属光泽中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌

55、在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :专题专题3 3植物组织培养技术植物组织培养技术一、基础知识一、基础知识课题课题1 1：菊花的组织培养菊花的组织培养（1 1）细胞的分化）细胞的分化概念：概念： 在个体发育中，在个体发育中，由一个或一种由一个或一种细胞增殖产生细胞增殖产生的后代，在形的后代，在形态、结构、生态、结构、生理功能上发生理功能上发生稳定性差异的稳定性差异的过程过程 过程：过程：1 1、植物的组织培养的基本过程、植物的组织培养的基本过程特点：特点：（2 2）稳定性：稳定性：（1 1）持久性：持久性：一般来说，分化了的细胞将

56、一直保持分化后一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到死亡的状态，直到死亡（3 3）普遍性：普遍性：原因：原因： 基因在特定的时间和空间条件下的选基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果择性表达的结果结果：结果： 形成不同的细胞和组织形成不同的细胞和组织（2 2）细胞的）细胞的全能性全能性定义：定义： 已经分化的细胞，仍然具有发育成完整已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能个体的潜能原理：原理： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的特有的全套遗传物质全套遗传物质，都有发育成为完，都有发育成为完整个体所必需的整个体所必需的全部基因全部基

57、因高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的该物种遗传性所需要的遗传物质遗传物质已分化的植物细胞，仍具有已分化的植物细胞，仍具有全能性全能性实例实例受精卵受精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞全能性的比较全能性的比较: :（3 3）植物组织培养）植物组织培养细胞离体细胞离体必要条件：必要条件：一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件外界条件原理原理: :细胞的全能性细胞的全能性外植体：离体的器官

58、、组织、细胞外植体：离体的器官、组织、细胞相关概念相关概念: :脱分化：脱分化：再分化：再分化：细胞排列疏松而无规则细胞排列疏松而无规则, ,是高度液泡化的、成是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞无定形状态的薄壁细胞由高度分化的植物组织或细胞产由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。也叫去分化生愈伤组织的过程。也叫去分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程又可以重新分化成根或芽等器官的过程愈伤组织愈伤组织: :人参的愈伤组织人参的愈伤组织人参的愈伤组织人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织

59、2 2、影响植物组织培养的因素、影响植物组织培养的因素（1 1）植物材料的选择）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞枸杞愈伤组织的芽诱导比较难愈伤组织的芽诱导比较难B B、同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影、同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝上部新萌生的侧枝A A、植物材料的选择直接关系到实验的成败、植物材料的选择直接关系到实验的成败（2 2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，件的

60、要求相对特殊，需配置适宜的培养基需配置适宜的培养基MSMS培养基主要成分包括：培养基主要成分包括：A A、大量元素大量元素: N: N、P P、 S S 、 K K、CaCa、MgMg等等B B、微量元素微量元素:B:B、MnMn、CuCu、ZnZn、FeFe、MoMo、I I、 CoCo等等C C、有机物、植物激素有机物、植物激素常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素赤霉素生长素类：生长素类：2 2，4 4二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2 2，4 4D D）、）、吲吲哚乙酸（哚乙酸（IAAIAA）、）、萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）、）、吲吲哚丁酸（哚丁

61、酸（IBAIBA）细胞分裂素类：细胞分裂素类：激动素（激动素（KTKT）、）、6 6苄基嘌呤苄基嘌呤（ 6 6BABA）、）、玉米素（玉米素（ZTZT）赤霉素类：赤霉素类：赤霉酸（赤霉酸（GA3GA3）（3 3）植物激素的影响）植物激素的影响生长素和细胞分裂素作用生长素和细胞分裂素作用植物中植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序使用顺序实验结果实验结果先使用生长素，后使用先使用生长素，后使用细

62、胞分裂素细胞分裂素有利于细胞分裂，但不有利于细胞分裂，但不利分化利分化先使用细胞分裂素后使先使用细胞分裂素后使用生长素用生长素细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化同时使用同时使用分化频率高分化频率高生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素： 有利于根的分化有利于根的分化生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素： 生长素生长素生长素生长素细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素再分化再分化再分化再分化植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养不需要光不需要光不需要光不需要光需要光需要光需要光需要光1 1、培育无病毒植株、培育无病毒植株2 2、 培养紫草愈伤组织培养紫草愈伤组织,

63、,提取紫草素（提取紫草素（治疗烫治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4 4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法4 4、植物组织培养的应用：植物组织培养的应用： 3 3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题或发芽率低等问题二、实验操作二、实验操作（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基M

64、SMS培养基包括培养基包括2020多种营养成分，实验室一般使多种营养成分，实验室一般使用用4 4。C C保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来制备1 1、配置各种母液、配置各种母液无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量2 2、配置培养基

65、、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml50ml或或100ml100ml 配制培养液配制培养液 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素添加植物激素3 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌灭菌1 1、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软

66、刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min20min左右左右 酒精处理酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为积分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 67s7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗立即将外植体取出，在无菌水中清洗 消毒液处理消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为放入质量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在无菌水中至少清洗取出后在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂

67、净消毒液消毒液（三）接种三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用室消毒是至关重要的。用7070的酒精喷雾使空的酒精喷雾使空气消毒，气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射外线照射2020分钟分钟1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无、无菌菌操作要求操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种4 4、接种注意事项、接

68、种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为数为7070的酒精溶液中消毒一次，然后在酒的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充分块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎

69、尖基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期

70、消毒。培养温度期间应定期消毒。培养温度18221822，每日用，每日用日光灯光照日光灯光照12h12h（五）移栽五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间（六）栽培六）栽培3 3、移栽、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，

71、适合栽培透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花况，适时浇水、施肥，直至开花专题4酶的研究与应用课题1 果胶酶在果汁 生产中的作用一、课题目标一、课题目标 1.1.简述果胶酶的作用；简述果胶酶的作用； 2.2.检测果胶酶的活性；检测果胶酶的活性； 3.3.探究温度和探究温度和pHpH对果胶酶活性对果胶酶活性的影响以及果胶酶的最适用量；的影响以及果胶酶的最适用量； 4.4.搜集有关果胶酶应用的资料。搜集有关果胶酶应用的资料。二、课题重点与难点二、课题重点与难点 课题重点

72、：课题重点： 温度和温度和pHpH对果胶酶活性的影响。对果胶酶活性的影响。课题难点：课题难点： 果胶酶的最适用量。果胶酶的最适用量。三、基础知识分析三、基础知识分析 知识要点知识要点: :1.1.果胶酶的作用；果胶酶的作用；2.2.酶的活性的定义；酶的活性的定义；3.3.影响酶活性的因素；影响酶活性的因素；4.4.果胶酶的用量。果胶酶的用量。 (一)细胞壁的结构及作用：作用是什么？作用是什么？特点？特点？结构组成？结构组成？保护植物细胞；支撑植物细胞弹性小；全透性纤维素、果胶1.1.果胶果胶植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分 植物细胞壁以及胞间层的主要组成植物细胞

73、壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由成分之一，它是由半乳糖醛酸半乳糖醛酸聚合而成聚合而成的一种的一种高分子化合物高分子化合物，不溶于水。，不溶于水。果胶果胶: : 在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果果胶胶，瓦解植物细胞的，瓦解植物细胞的细胞壁细胞壁及及胞间层胞间层，使，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。，也使得浑浊的果汁变得澄清。果胶酶果胶酶 果胶酶并不特指某一种酶，而是分果胶酶并不特指某一种酶，而是分解果

74、胶的一类酶的总称，包括解果胶的一类酶的总称，包括多聚多聚半乳半乳糖醛酸糖醛酸酶酶、果胶分解酶果胶分解酶和和果胶脂酶果胶脂酶等。等。果胶酶果胶酶: :2.2.酶的活性与影响酶活性的因素酶的活性与影响酶活性的因素 指酶催化一定化学反应的能力。酶反指酶催化一定化学反应的能力。酶反应速度用应速度用单位时间单位时间内内单位体积单位体积中中反应物反应物的减少量的减少量或或生成物的增加量生成物的增加量来表示来表示. .(1)(1)酶的活性酶的活性(2)(2)影响酶活性的因素影响酶活性的因素 a.a.温度温度b.pHb.pH C. .酶的抑制酶的抑制剂剂. .果胶酶的用量果胶酶的用量()探究温度和探究温度和p

75、H对酶活性的影响对酶活性的影响四、实验设计1、设计实验方案、设计实验方案 A、确定温度确定温度/PH梯度（梯度（5C0/ 10C0）/PH5、6、7、8 探究控制温度探究控制温度/PH的方法和的方法和措施措施 你的实验变量是什么？如何设定？你的实验变量是什么？如何设定？ B、确定水果的种类、确定水果的种类确定制备果汁的方确定制备果汁的方法法 确定实验用的水果用量确定实验用的水果用量 确定果胶酶的确定果胶酶的用量用量控制测定果胶酶活性的方法控制测定果胶酶活性的方法()探究温度和pH对酶活性的影响2、实验操作步骤：、实验操作步骤：制备水果泥制备水果泥配制果胶酶配制果胶酶水果泥与果胶酶分别水浴保温水

76、果泥与果胶酶分别水浴保温将水果泥和果胶酶混合保温将水果泥和果胶酶混合保温过滤出果汁过滤出果汁记录果汁量记录果汁量改变不同的温度改变不同的温度/PH后重复以上实验后重复以上实验()探究温度和pH对酶活性的影响3、设计记录数据的表格、设计记录数据的表格4、得出结论与分析：、得出结论与分析：画曲线图；最适温度画曲线图；最适温度/PH是是温度温度/PH果汁果汁量量/ml在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：1 1与其他工业用酶基本相同，果胶酶的与其他工业用酶基本相同，果胶酶的适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用10 10

77、 作为温度梯度，设置的具体温度为作为温度梯度，设置的具体温度为10 10 、20 20 、30 30 、40 40 、50 50 和和60 60 等，也等，也可以尝试以可以尝试以5 5 作为温度梯度。作为温度梯度。2 2苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，反应物，水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水一般可按每个中等大小的苹果加水100100200 200 mLmL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。3 3果泥的用量可以采用果泥的用量可以采用5 5 mLmL左右，果左右，果胶

78、酶的用量可采用质量浓度为胶酶的用量可采用质量浓度为2%2%的果胶酶溶的果胶酶溶液液2 2 mLmL。4 4水浴时间可以为水浴时间可以为202030 min30 min。5 5过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。6 6探究探究pHpH对果胶酶活性的影响，只须对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成将温度梯度改成pHpH梯度，并选定一个适宜的梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的温度进行水浴加热。反应液中的pHpH可以通过可以通过体积分数为体积分数为0.1%0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。调节。( () )探究果胶酶的用量探究果胶酶的

79、用量 探究果胶酶的用量是建立在探究最适温探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和度和pHpH对果胶酶活性影响的基础之上的。对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是此时，研究的变量是 ，其，其他因素都应他因素都应 。果胶酶的用量果胶酶的用量保持不变保持不变方案方案：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的反应液的pH必须相同，否则将影响实验结必须相同，否则将影响实验结果的准确性。果的准确性。五、结果分析与评价五、结果分

80、析与评价 根据实验数据绘制出的温度和根据实验数据绘制出的温度和pHpH对对果胶酶活性影响的曲线图；果胶酶活性影响的曲线图； 不同果胶酶用量对出汁量影响的曲不同果胶酶用量对出汁量影响的曲线图（在浓度和体积相同的条件下）；线图（在浓度和体积相同的条件下）； 果胶酶最适温度、果胶酶最适温度、pHpH以及果胶酶的以及果胶酶的最适用量。最适用量。六、本课题知识小结六、本课题知识小结 专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离主要内容：主要内容：一、基础知识一、基础知识二、实验操作二、实验操作一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质

81、分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运

82、动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理4 4、具体过程、具体过程一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或

83、稍加稀释不引起溶液量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（ ）对溶液）对溶液（ ）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的缓冲液。使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不

84、同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察(红色红色)和科学研究其和科学研究其(活性活性)4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？（三）（三） 电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离

85、的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。各种分子的分离。3.3.类型类型: :琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分

86、子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N,NN,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取取决于它所带决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分

87、子的大分子的大小小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以可以在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS。（2 2）原理：）原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽由几条肽链组成的链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单单条肽链的分子量条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形能与各种蛋白质形成成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子量大大超过了蛋白质分子原有电荷量原有电

88、荷量。因因而掩盖了而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。电泳迁移率完全取决于分子的大小。（3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理作用机理: : 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）

89、纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白

90、血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一一一一肽链肽链肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团1.血液有哪些成分？血液有哪些成分？2. 2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哪种血液来提取血红蛋白？为什么？二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白

91、溶液：4 4、透析、透析：（：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍倍体积生理盐水体积生理盐水缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红

92、色透明得到红色透明液体。液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物暗红色沉淀物透析过程动画演示透析过程动画演示（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作-纯化纯化1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理

93、样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填步步骤操作要求操作要求操作要求操作要求色色谱柱垂直固定在支架上柱垂直固定在支架上计算称量凝算称量凝胶胶根据色根据色谱柱体柱体积计算凝胶用量算凝胶用量配制配制悬浮液浮液凝胶凝胶颗粒蒸粒蒸馏水水充分溶充分溶胀凝胶凝胶颗粒洗脱液粒洗脱液沸水浴沸水浴装填装填悬浮液浮液一次性一次性缓慢倒入；慢倒入；轻轻敲打敲打缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸立刻用磷酸缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡12h12h装配好的凝胶柱3 3、样品加入与洗脱、样

94、品加入与洗脱-调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样品品品品调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面洗脱洗脱洗脱洗脱收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质（1 1）调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。（2 2）滴加透析样品：）滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，

95、同时注意不要破坏凝破坏凝胶面。胶面。（3 3）样品渗入凝胶床：）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。（4 4）洗脱：）洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。（5 5）收集：）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集流出液，每5ml

96、5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（6 6）注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。目的：目的：目的：目的：血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样

97、品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得

98、不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是

99、否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血

100、红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判

101、断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？效果？效果？效果？四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价本课题作业本课题作业本课题作业本课题作业; ; ; ;1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? ?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液? ?它的作用是什么它的作用是什么? ?3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么? ?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? ?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比, ,红细胞有什么特点红细胞有什么特点? ?这一特点对你进行这一特点对你进行蛋

102、白质的分离有什么意义蛋白质的分离有什么意义? ?（1）计算：根据色谱柱的内体积计算所需）计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量凝胶量（2）凝胶溶胀：）凝胶溶胀：凝胶浸泡于蒸馏水充分溶凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液胀后，配成凝胶悬浮液（3）固定：固定：将色谱柱装置固定在支架上将色谱柱装置固定在支架上（4）装填：装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。（5）洗涤平衡：）洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的

103、操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH为为7.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡12小时小时。装填时装填时注意：注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时注意：注意：注意：注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终

104、生物大分子物质的分离效果。体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填4 4、用、用SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测定蛋白质的分子量时，可选用一组蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子已知分子量的标准蛋白量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的子量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以，可以测定测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。试剂出售。