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1、生物技术药物制剂生物技术药物制剂药剂教研室药剂教研室 本章学习要求：本章学习要求：掌掌握握生生物物技技术术的的概概念念和和生生物物技技术术药药物物的的特特点点和和理理化化性质。性质。掌握蛋白质类药物的处方与工艺。掌握蛋白质类药物的处方与工艺。熟悉掌握蛋白质类药物新型给药系统和评价方法。熟悉掌握蛋白质类药物新型给药系统和评价方法。主要内容主要内容第一节第一节概概述述蛋白质类药物的结构特点与理化性质蛋白质类药物的结构特点与理化性质蛋白质类药物的评价方法蛋白质类药物的评价方法第二节第二节多肽、蛋白质类药物的注射给药多肽、蛋白质类药物的注射给药第三节第三节多肽、蛋白质类药物的非注射制剂多肽、蛋白质类药
2、物的非注射制剂第四节第四节基因传递系统基因传递系统第一节第一节概概述述生物技术或称生物工程（生物技术或称生物工程（biotechnology),是应用生是应用生物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括基因工程，细胞工程与酶工现代生物技术主要包括基因工程，细胞工程与酶工程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。二、二、生物技术药物产品
3、生物技术药物产品生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40多种，正在研究的数百种之多，这些药物均属肽类多种，正在研究的数百种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。与蛋白质类药物。1、定义、定义系指由重组产品、天然生化药物、微生物药物、海系指由重组产品、天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物药物的总称。洋药物和生物药物的总称。2、现代生物药物的分类、现代生物药物的分类(1)基因重组多肽、蛋白质类治疗剂基因重组多肽、蛋白质类治疗剂(即重组即重组DNA技技术术)；(2)基因药物基因药物(基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核
4、酸核酸)；(3)天然生物药物天然生物药物(动物、植物、微生物和海洋生物动物、植物、微生物和海洋生物药物药物)；(4)合成和部分合成生物药物。合成和部分合成生物药物。3、生物技术药物的特点、生物技术药物的特点多数受胃酸及消化酶的降解破坏多数受胃酸及消化酶的降解破坏其生物半衰期亦较短，需频繁注射给药其生物半衰期亦较短，需频繁注射给药即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也较低即使皮下或肌肉注射，其生物利用度也较低长期注射易造成患者心理和生理的痛苦长期注射易造成患者心理和生理的痛苦另外，多数多肽和蛋白质类药物不易被亲脂性膜所另外，多数多肽和蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取，很难通过生物屏障。摄取，很难通过
5、生物屏障。三、生物技术药物及其制剂的发展前景三、生物技术药物及其制剂的发展前景1、发展概况、发展概况自自1982年第一个重组药物：人工胰岛素上市以来，年第一个重组药物：人工胰岛素上市以来，第二代生物技术药物正在取代第一代多肽、蛋白质第二代生物技术药物正在取代第一代多肽、蛋白质类替代治疗剂。类替代治疗剂。第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的药物；药物；第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的自然界不存在的新的重组药物。自然界不存在的新的重组药物。生物技术药物的发展生物技术药物的发展到到1998年为
6、止年为止,全球已有全球已有65个生物技术药物问市个生物技术药物问市,另有另有2600多个生物技术药物正处于临床前的研究阶多个生物技术药物正处于临床前的研究阶段段,700多个生物技术药物正进行临床评价多个生物技术药物正进行临床评价,其中其中200多种已进入四期临床或最后审批阶段多种已进入四期临床或最后审批阶段,估计估计2000年全球生物技术药物的销售额会超过年全球生物技术药物的销售额会超过200亿美元亿美元,而近年内生物技术药品将占新药总数的而近年内生物技术药品将占新药总数的20%以上。以上。生物技术药物有着广阔的发展前景。生物技术药物有着广阔的发展前景。生物技术药物的发展生物技术药物的发展美国
7、一直稳居生物技术药物研发榜首，已上市美国一直稳居生物技术药物研发榜首，已上市116个药物，个药物，治疗数百种疾病，治疗数百种疾病，2000年产值超过年产值超过200亿美元；已有亿美元；已有723种生种生物技术药物正在通过物技术药物正在通过FDA审批。审批。德国已超过日本，到德国已超过日本，到2001年底已有年底已有68种药物上市，正在临床种药物上市，正在临床试验的有试验的有100多个。多个。日本多数药物是与美国合作的产物，已上市的有日本多数药物是与美国合作的产物，已上市的有50个药物。个药物。我国已批准上市的品种有我国已批准上市的品种有21种，主要通过跟踪研究与创仿相种，主要通过跟踪研究与创仿
8、相结合的方法，目前已步入自主创新阶段，并以结合的方法，目前已步入自主创新阶段，并以“新型生物技新型生物技术药物和疫苗术药物和疫苗”作为发展重点。作为发展重点。生物技术药物的发展生物技术药物的发展目前以生物技术，微电子，新材料，新能源，海洋目前以生物技术，微电子，新材料，新能源，海洋工程和空间技术等为主要内容的新技术革命浪潮正工程和空间技术等为主要内容的新技术革命浪潮正以万钧之势迅猛发展。以万钧之势迅猛发展。在新技术革命中，生物技术又是各国优先发展的领在新技术革命中，生物技术又是各国优先发展的领域。传统的经典制药工业由于基因工程，细胞融合，域。传统的经典制药工业由于基因工程，细胞融合，酶工程，结
9、构修饰等现代生物技术的渗入，使医药酶工程，结构修饰等现代生物技术的渗入，使医药产品的发展进入了一个新的时期。尽管这类产品目产品的发展进入了一个新的时期。尽管这类产品目前还不太多，但它代表了医药产品发展的方向。前还不太多，但它代表了医药产品发展的方向。随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给药物制剂带发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给药物制剂带来新的挑战，由于生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性能来新的挑战，由于生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性能很不稳定，极易变质，因此如何将这类药物
10、制成稳定，安全，很不稳定，极易变质，因此如何将这类药物制成稳定，安全，有效的制剂，就是摆在我们面前的一大难题。有效的制剂，就是摆在我们面前的一大难题。运用制剂手段将注射用药制成口服或其他途径给药，亦即研运用制剂手段将注射用药制成口服或其他途径给药，亦即研究新的给药系统，也是一项十分艰巨的任务。由于这类药物究新的给药系统，也是一项十分艰巨的任务。由于这类药物及其制剂疗效独特应用日益广泛，因而具有进一步研究的价及其制剂疗效独特应用日益广泛，因而具有进一步研究的价值和广阔的发展前景。值和广阔的发展前景。生物技术药物的发展生物技术药物的发展表表已上市的部分常见生物技术药物已上市的部分常见生物技术药物表
11、表已上市的部分常见生物技术药物已上市的部分常见生物技术药物蛋白质类药物的结构特点与理化性质蛋白质类药物的结构特点与理化性质一、蛋白质的结构特点一、蛋白质的结构特点(一一)蛋白质的组成和一般结构蛋白质的组成和一般结构蛋白质是由许多氨基酸按一定排列顺序通过肽键相连而成的蛋白质是由许多氨基酸按一定排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。多肽链。蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成，肽链数目，末端组成，蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成，肽链数目，末端组成，氨基酸排列顺序和二硫键的位置等。氨基酸排列顺序和二硫键的位置等。组成蛋白质的氨基酸有组成蛋白质的氨基酸有20多种。多种。连接氨基酸之间的键称为酰胺键，又称连接氨基
12、酸之间的键称为酰胺键，又称肽键肽键，是蛋白质中氨，是蛋白质中氨基酸之间连接最基本的共价键。基酸之间连接最基本的共价键。蛋白质结构蛋白质结构蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构：蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构：一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。(二二)蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构包
13、括二级，三级与四级结蛋白质的高级结构包括二级，三级与四级结构：构：二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有有螺旋结构与螺旋结构与折叠形式。折叠形式。螺旋与螺旋与折叠折叠(二二)蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合的方式，系一条多肽链中所有间排列或组合的方式，系一条多肽链中所有原子的空间排部。原子的空间排部。四级结构是指具有三
14、级结构的蛋白质的各亚四级结构是指具有三级结构的蛋白质的各亚基聚合而成的大分子蛋白质。基聚合而成的大分子蛋白质。蛋白质高级结构示意图蛋白质高级结构示意图蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构胰岛素的四级结构可以由两个以上的分子量为胰岛素的四级结构可以由两个以上的分子量为6000或或12000的小亚基聚合而成。的小亚基聚合而成。所谓亚基就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这所谓亚基就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这些多肽链彼此以非共价链相连，每一条多肽链都有些多肽链彼此以非共价链相连，每一条多肽链都有自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚单位（亚基）。单
15、位（亚基）。二条亚基的四级结构二条亚基的四级结构六条亚基的四级结构六条亚基的四级结构蛋白质分子的空间结构蛋白质分子的空间结构蛋白质分子的构象又叫空间结构、蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体高级结构、立体结构、结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。丰富多彩的蛋白质世界丰富多彩的蛋白质世界蛋白质分子的空间结构与生物活性蛋白质分子的空间结构与生物
16、活性蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象（conformation)时才有生物活性，时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力（作用力（hydrophobicforce)、离子键、范德华力、离子键、范德华力、二硫键与配位键。二硫键与配位键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。白质构象是弱作用力。维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力蛋白质分子中二级结构蛋白质分子中二级结构螺旋、螺旋、折叠的形成依靠氢折叠的形成依
17、靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。疏水作用力也称疏水键，系两个疏水基为了避开水疏水作用力也称疏水键，系两个疏水基为了避开水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力范德华力对稳定和维持三级，四级结构十分重要。范德华力对稳定和维持三级，四级结构十分重要。离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子是通过配位键少蛋
18、白质含有金属离子，而金属离子是通过配位键与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非氨基酸通过配位组成。氨基酸通过配位组成。金属离子配位键金属离子配位键二、蛋白质的理化性质二、蛋白质的理化性质(一一)蛋白质的一般理化性质蛋白质的一般理化性质1、旋光性、旋光性蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。(一一)蛋白质的一般理化性质蛋白质的一般理化性
19、质2、紫外吸收紫外吸收大部分蛋白质均含有带苯丙氨酸，酪氨酸与色氨酸，大部分蛋白质均含有带苯丙氨酸，酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收。显示强吸收。(一一)蛋白质的一般理化性质蛋白质的一般理化性质3、蛋白质两性本质与电学性质、蛋白质两性本质与电学性质蛋白质除了肽链蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和末端有自由的氨基和C-末端有自末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，这些解离基团在一定这些解离基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。条件下都能发生解离而带电。
20、因此蛋白质是两性电解质，在不同因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质条件下蛋白质会成为阳离子，阴离子或二性离子。会成为阳离子，阴离子或二性离子。(二二)蛋白质不稳定的原因蛋白质不稳定的原因1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解，共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解，氧化和消旋化，氧化和消旋化，此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键的断裂与交换。换。有时几种反应同时进行有时几种反应同时进行1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳
21、定性蛋白质在其等电点（蛋白质在其等电点（IP）时一般最稳定，溶时一般最稳定，溶解也最少。解也最少。在蛋白质等电点相应的在蛋白质等电点相应的pH所有离子的净电荷所有离子的净电荷为零，因而减少了电荷排斥和蛋白质伸展的为零，因而减少了电荷排斥和蛋白质伸展的趋势。趋势。1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性(1)蛋白质水解蛋白质水解蛋白质可被酸，碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分蛋白质可被酸，碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐步变小，成为分子量大小不等的子断裂，分子量逐步变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。肽段和氨基酸。水解分完全水解与不完全水解。水
22、解分完全水解与不完全水解。1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性(2)蛋白质的氧化蛋白质的氧化蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸可以在一些氧化剂蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸可以在一些氧化剂作用下氧化。作用下氧化。常用氧化剂有分子氧、过氧化氢、过甲酸、常用氧化剂有分子氧、过氧化氢、过甲酸、氧自由氧自由基等。基等。1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性(3)外消旋作用外消旋作用(racemization)某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，
23、使原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或或L-型型化合物转变为化合物转变为D-型和型和L-型各型各50%的混合物，彼此旋的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。作用。1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性(4)二硫键及其交换二硫键及其交换二硫键（二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键。学键。它是由两个半胱氨酸侧链上的疏基（它是由两个半胱氨酸侧链上
24、的疏基（-SH）脱氢相连而成。脱氢相连而成。二硫键把同一肽链或不同肽链（肽链间）的不同部二硫键把同一肽链或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性蛋白质分子中二硫键的数目愈多，则结构稳定性和蛋白质分子中二硫键的数目愈多，则结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强。抗拒外界因素的能力也愈强。蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性。的三级结构，因此影响其生物活性。2、由非共价键
25、引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性引起蛋白质不可逆失活作用的三种主要类型引起蛋白质不可逆失活作用的三种主要类型聚集（聚集（aggregation)，宏观沉淀，和表面吸附与蛋宏观沉淀，和表面吸附与蛋白质变性，白质变性，这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。非共价的静电力，氢键，疏水的相互作用以及蛋白非共价的静电力，氢键，疏水的相互作用以及蛋白质的水化，可以因温度于质的水化，可以因温度于pH而发生改变。而发生改变。2、由非共价键引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性蛋白质的不可逆失活，一般以自然状态开始蛋白质的不可逆失活，一般以自然状态开始可逆
26、的伸展，随着温度的增加，溶液中的蛋可逆的伸展，随着温度的增加，溶液中的蛋白质分子在熔融温度白质分子在熔融温度(Tm)从天然的状态转变从天然的状态转变为伸展状态。为伸展状态。溶液溶液pH可以影响静电的相互作用。可以影响静电的相互作用。Tm为为50%分分子伸展时的子伸展时的温度。温度。2、由非共价键引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性(1)蛋白质的聚集与沉淀蛋白质的聚集与沉淀蛋白质聚集蛋白质聚集(凝集，凝集，aggregation)是蛋白质分子结合是蛋白质分子结合的微观过程。的微观过程。蛋白质沉淀蛋白质沉淀(precipitation)指可见蛋白质颗粒的生指可见蛋白质颗粒的生成。成。不可逆的聚
27、集往往是由于蛋白质伸展所致。不可逆的聚集往往是由于蛋白质伸展所致。2、由非共价键引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性蛋白质溶液振摇可以导致聚集与沉淀，蛋白质溶液振摇可以导致聚集与沉淀，这是由于空气氧化，界面变性，吸附于容器这是由于空气氧化，界面变性，吸附于容器或机械应力所致。或机械应力所致。2、由非共价键引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性(2)蛋白质的吸附蛋白质的吸附蛋白质和多肽吸附于容器、滤器或输液系统材料的蛋白质和多肽吸附于容器、滤器或输液系统材料的表面，表面，当蛋白质溶液浓度较低时，由于吸附药物损失相对当蛋白质溶液浓度较低时，由于吸附药物损失相对就较高。就较高。2、由非共价键引
28、起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性(3)蛋白质的变性蛋白质的变性蛋白质在受到一些物理因素或化学试剂影响会导致蛋白质在受到一些物理因素或化学试剂影响会导致蛋白质性质发生变化，蛋白质性质发生变化，破坏蛋白质分子三维结构有关氢键及其他弱破坏蛋白质分子三维结构有关氢键及其他弱键键(二级结构以上的高级结构的破坏二级结构以上的高级结构的破坏)，导致蛋，导致蛋白质生物活性的丧失白质生物活性的丧失(抗原性改变，生物功能丧抗原性改变，生物功能丧失失)同时还伴随一些物化常数的变化。同时还伴随一些物化常数的变化。如发生溶解度的降低、旋光值改变、如发生溶解度的降低、旋光值改变、光吸收系数的增大、粘度改变、光吸收系
29、数的增大、粘度改变、聚集，沉淀等。聚集，沉淀等。但蛋白质的一级结构即肽键没有被破坏但蛋白质的一级结构即肽键没有被破坏,这种现象称为蛋白质的变性这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。2、由非共价键引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性蛋白质的变性也可以说是从肽链的折叠（蛋白质的变性也可以说是从肽链的折叠（refolding)状态变状态变到伸展（到伸展（unfolding)状态。状态。天然蛋白质在体内条件下，天然蛋白质在体内条件下，具有呈现全部生物功能所需要的精确的构象。具有呈现全部生物功能所需要的精确的构象。变性作用是天然蛋白质分子结构的松解变性作用是天然蛋白质分子结构的松解，
30、即由原来有规则，紧密结构变成即由原来有规则，紧密结构变成无规则，松散结构。无规则，松散结构。2、由非共价键引起的不稳定性、由非共价键引起的不稳定性变性可以分可逆变性和不可逆变性。变性可以分可逆变性和不可逆变性。除去变性因素，蛋白质构象可以恢复原状的，除去变性因素，蛋白质构象可以恢复原状的，叫可逆变性。叫可逆变性。盐析盐析影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素温度的影响：温度的影响：蛋白质在蛋白质在5060C的溶液中，经过一定时间，的溶液中，经过一定时间，往往发生变性。往往发生变性。有些蛋白质热变性是可逆的，有些是不可逆有些蛋白质热变性是可逆的，有些是不可逆的。的。不可逆热变性往往发生沉淀和聚
31、集现象。不可逆热变性往往发生沉淀和聚集现象。一般来说，热变性仅涉及非共价键的变化。一般来说，热变性仅涉及非共价键的变化。影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素pH对蛋白质构象的影响：对蛋白质构象的影响：大多数蛋白质，仅在大多数蛋白质，仅在pH4-10的范围内是稳定的范围内是稳定的，超过这个范围，就发生变性，的，超过这个范围，就发生变性，也有些蛋白质只有当也有些蛋白质只有当pH2时，才发生变性。时，才发生变性。影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素有机溶剂的影响：有机溶剂的影响：大多数蛋白质水溶液在加入一定量的有机溶剂后蛋大多数蛋白质水溶液在加入一定量的有机溶剂后蛋白质就开始析出沉淀。白质就
32、开始析出沉淀。脱水脱水影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素盐的影响：盐对蛋白质构象稳定性的影响是很复盐的影响：盐对蛋白质构象稳定性的影响是很复杂的。杂的。蛋白质水溶液中加入少量无机盐会增加蛋白质表面蛋白质水溶液中加入少量无机盐会增加蛋白质表面负荷，增强蛋与水的作用从而使蛋白质在水中溶液负荷，增强蛋与水的作用从而使蛋白质在水中溶液度增大，这种现象称为盐溶（度增大，这种现象称为盐溶（saltingin)。在高盐浓度情况下，本来与蛋白质结合的自由水与在高盐浓度情况下，本来与蛋白质结合的自由水与盐解离产生的离子进形配位，蛋白质表面水层被破盐解离产生的离子进形配位，蛋白质表面水层被破坏，最终导致蛋白
33、质之间的相互作用增加而发生聚坏，最终导致蛋白质之间的相互作用增加而发生聚集，这种现象叫盐析（集，这种现象叫盐析（saltingout)。影响蛋白质变性的因素影响蛋白质变性的因素表面活性剂对蛋白质构象的影响：表面活性剂对蛋白质构象的影响：长链的脂肪酸（如月桂酸）或相应的表面活性剂长链的脂肪酸（如月桂酸）或相应的表面活性剂（如十二烷基硫酸钠）很容易与蛋白质反应，（如十二烷基硫酸钠）很容易与蛋白质反应，常常引起蛋白质解离，在很低的浓度下，就能引起常常引起蛋白质解离，在很低的浓度下，就能引起蛋白质变化。蛋白质变化。蛋白质类药物的评价方法蛋白质类药物的评价方法一、液相色谱法一、液相色谱法液相色谱法是评价
34、蛋白质的纯度与稳定性有力的工具。液相色谱法是评价蛋白质的纯度与稳定性有力的工具。在蛋白质分析中通常采用反相高压液相色谱法在蛋白质分析中通常采用反相高压液相色谱法RP-HPLC、离子交换色离子交换色谱谱IEC与分子排阻色谱与分子排阻色谱SEC。反相色谱是以非极性固定相与含水的极性流动相为基础的分反相色谱是以非极性固定相与含水的极性流动相为基础的分析方法。析方法。应用反相应用反相HPLC，由于有机溶剂，疏水的相互作用及分离时由于有机溶剂，疏水的相互作用及分离时所用低所用低pH值，会使蛋白质变性。值，会使蛋白质变性。然而该方法对几种蛋白质特别有用，并被广泛地用于胰岛素然而该方法对几种蛋白质特别有用，
35、并被广泛地用于胰岛素制剂的质量分析。制剂的质量分析。蛋白质类药物的评价方法蛋白质类药物的评价方法二、光谱法二、光谱法通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外可见吸收光谱用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外可见吸收光谱UV、旋光色散旋光色散ORD、圆二色圆二色谱谱CD、荧光、红外荧光、红外IR和拉曼和拉曼Raman光谱。光谱。紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度。紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度。光散射可用测定制剂
36、中蛋白质的聚集数量，光散射可用测定制剂中蛋白质的聚集数量，散射强度是单位体积散射中心数的函数。散射强度是单位体积散射中心数的函数。蛋白质类药物的评价方法蛋白质类药物的评价方法三、电泳三、电泳电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生特征性迁移，迁移率是所带净电荷和它的大小函数，以此来特征性迁移，迁移率是所带净电荷和它的大小函数，以此来分离混合蛋白质。分离混合蛋白质。在蛋白质的分析中广泛使用十二烷基硫酸钠在蛋白质的分析中广泛使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶聚丙烯胺凝胶电泳（电泳（SDS-PAGE），），等电点聚焦等电点聚焦(isocl
37、ectricfocusing，IEF)和毛细管电泳（和毛细管电泳（EC）法。法。SDS-PAGE电泳用于测定蛋白质亚单位组成和分子量。电泳用于测定蛋白质亚单位组成和分子量。EC优点是：分辨率高、灵敏度高、分析时间短、易于自动优点是：分辨率高、灵敏度高、分析时间短、易于自动化。化。蛋白质类药物的评价方法蛋白质类药物的评价方法四、生物活性测定与免疫测定四、生物活性测定与免疫测定生理活性检测是利用体内模型或体外组织或细胞对活性蛋白生理活性检测是利用体内模型或体外组织或细胞对活性蛋白质多肽的特异生物学反应，通过剂量质多肽的特异生物学反应，通过剂量(或浓度或浓度)效应曲线进行效应曲线进行定量（绝对量或比
38、活性单位）。定量（绝对量或比活性单位）。用理化方法代替生物活性测定时，需建立两种方法之间的相用理化方法代替生物活性测定时，需建立两种方法之间的相关性。关性。免疫测定优点是可用于定量化学分析不能检测的情况。免疫测定优点是可用于定量化学分析不能检测的情况。蛋白质类药物制剂的评价蛋白质类药物制剂的评价1、制剂中药物的含量测定；、制剂中药物的含量测定；2、制剂中药物的活性测定；、制剂中药物的活性测定；3、制剂中药物的体外释药速率测定；、制剂中药物的体外释药速率测定；4、制剂的稳定性研究（物理和化学稳定性）；、制剂的稳定性研究（物理和化学稳定性）；5、体内药动学研究；、体内药动学研究；6、刺激性和生物相
39、容性研究。、刺激性和生物相容性研究。生物技术药物的特点生物技术药物的特点1蛋蛋白白质质或或多多肽肽类类药药物物大大多多为为内内源源性性物物质质，临临床床使使用用剂剂量量小，药理活性高，副作用小，很少有过敏反应；小，药理活性高，副作用小，很少有过敏反应；2蛋蛋白白质质或或多多肽肽类类药药物物稳稳定定性性差差，在在酸酸碱碱环环境境或或体体内内酶酶存存在下极易失活；在下极易失活；3蛋蛋白白质质或或多多肽肽类类药药物物分分子子量量大大，还还时时常常以以多多聚聚体体形形式式存存在在，很很难难透透过过胃胃肠肠道道粘粘膜膜的的上上皮皮细细胞胞层层，故故吸吸收收很很少少，不不能能口服给药，一般只有注射给药一种
40、途径；口服给药，一般只有注射给药一种途径；4蛋白质或多肽类药物体内生物半衰期较短，从血中消除蛋白质或多肽类药物体内生物半衰期较短，从血中消除较快，因此在体内的作用时间较短，往往不能充分发挥其作较快，因此在体内的作用时间较短，往往不能充分发挥其作用。用。生物技术药物给药系统的研究开发生物技术药物给药系统的研究开发（1）对对于于蛋蛋白白质质或或多多肽肽类类药药物物的的普普通通注注射射剂剂，关关键键是是提提高高其稳定性；其稳定性；（2）对对于于体体内内生生物物半半衰衰期期较较短短的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽类类药药物物，需需要研究其长效制剂，以延长作用时间；要研究其长效制剂，以延长作用时间；（3）对
41、对于于需需要要长长期期给给药药的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽类类药药物物，要要研研究究可可减少给药次数的新剂型；减少给药次数的新剂型；（4）研研究究开开发发生生物物技技术术药药物物的的非非注注射射给给药药新新剂剂型型，如如鼻鼻腔腔给药系统、肺部给药系统及口服给药系统等。给药系统、肺部给药系统及口服给药系统等。（5）基因传递系统需要解决安全性、靶向性等问题。）基因传递系统需要解决安全性、靶向性等问题。第二节第二节多多肽肽、蛋白质药物的注射给药、蛋白质药物的注射给药一、一、蛋白质类药物的一般处方组成蛋白质类药物的一般处方组成目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，一为
42、溶液型注射剂，一为溶液型注射剂，另一种是冷冻干燥型注射剂。另一种是冷冻干燥型注射剂。溶液型使用方便，但需在低温（溶液型使用方便，但需在低温（28C）下保存。下保存。冷冻干燥型比较稳定，但工艺较为复杂。冷冻干燥型比较稳定，但工艺较为复杂。1.溶液型注射剂溶液型注射剂在设计多在设计多肽肽、蛋白质药物的溶液型注射剂时、蛋白质药物的溶液型注射剂时，一般要考虑加一般要考虑加入缓冲剂和稳定剂入缓冲剂和稳定剂;有时还可加入防腐剂有时还可加入防腐剂。多肽多肽、蛋白质药物溶液型注射剂一般要求在、蛋白质药物溶液型注射剂一般要求在28下保存下保存，不能冷冻或振摇，取出后在室温下一般要求在，不能冷冻或振摇，取出后在室
43、温下一般要求在612h内使内使用。用。在多在多肽肽、蛋白质药物的溶液型注射剂中常用的稳定剂包括缓、蛋白质药物的溶液型注射剂中常用的稳定剂包括缓冲剂冲剂、盐类、表面活性剂类盐类、表面活性剂类、及及糖类、氨基酸和人血清白蛋糖类、氨基酸和人血清白蛋白白(HSA)等。等。溶液型蛋白质类药物的稳定化方法溶液型蛋白质类药物的稳定化方法（1）缓冲剂）缓冲剂一般说来一般说来pH值和离子强度对蛋白质的稳定性及溶解度都有很值和离子强度对蛋白质的稳定性及溶解度都有很大影响，通常在蛋白质药物溶液配制中采用适当的缓冲系统大影响，通常在蛋白质药物溶液配制中采用适当的缓冲系统是很必要的。是很必要的。（2）盐类）盐类盐类除了
44、影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶液度盐类除了影响蛋白质的稳定性外，其浓度对蛋白质的溶液度与聚集均有很大影响。与聚集均有很大影响。（2）盐类）盐类在低浓度下可能以盐溶为主在低浓度下可能以盐溶为主,而高浓度下则可能发生盐析。而高浓度下则可能发生盐析。在适当的离子和浓度下在适当的离子和浓度下,无机盐可增加蛋白质的表面电荷无机盐可增加蛋白质的表面电荷,促进了蛋白质与水的作用促进了蛋白质与水的作用,从而增加其溶解度从而增加其溶解度；相反相反,无机盐可通过与水的更强的作用无机盐可通过与水的更强的作用,破坏蛋白质的表面破坏蛋白质的表面水层水层,促进了蛋白质之间的相互作用而使其产生聚集等。促进了蛋白质
45、之间的相互作用而使其产生聚集等。在多在多肽肽、蛋白质药物的溶液型注射剂中常用的盐类有、蛋白质药物的溶液型注射剂中常用的盐类有NaCl和和KCl等。等。（3）表面活性剂表面活性剂离子型表面活性剂常会引起蛋白质变性。离子型表面活性剂常会引起蛋白质变性。少量的非离子型的表面活性剂少量的非离子型的表面活性剂(主要是聚山梨主要是聚山梨酯酯类类)具有防止蛋白质聚集的作用。具有防止蛋白质聚集的作用。可能的机理是表面活性剂倾向性地分布于气可能的机理是表面活性剂倾向性地分布于气/液或液或液液/液界面液界面,防止蛋白质在界面的变性等。防止蛋白质在界面的变性等。聚山梨聚山梨酯酯类可用于单抗制剂和球蛋白制剂等。类可用
46、于单抗制剂和球蛋白制剂等。（4）糖类糖类糖类与多元醇等可增加蛋白质药物在水中的稳定性糖类与多元醇等可增加蛋白质药物在水中的稳定性,这可能与糖类促进蛋白质的优先水化有关。这可能与糖类促进蛋白质的优先水化有关。常用的糖类包括庶糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖常用的糖类包括庶糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖；常用的多元醇有甘油常用的多元醇有甘油、甘露醇、山梨醇、甘露醇、山梨醇、PEG和和肌醇等。肌醇等。（5）血清蛋白血清蛋白血清蛋白可以稳定多血清蛋白可以稳定多肽肽、蛋白质药物、蛋白质药物人血清蛋白（人血清蛋白（HAS）可用于人体可用于人体,在一些市售的生物在一些市售的生物技术药物制剂中已被技术药物制剂中已被用作
47、稳定剂用作稳定剂,用量用量为为0.1%0.2%。HAS易被吸附易被吸附,可减少可减少蛋白质药物的损失蛋白质药物的损失；可部分降低产品中痕量可部分降低产品中痕量蛋白质酶等蛋白质酶等对蛋白类药物对蛋白类药物的破坏的破坏；可保护蛋白质的构象可保护蛋白质的构象；也可作为冻干保护剂也可作为冻干保护剂,如如在白介素在白介素2、干扰素和组、干扰素和组织纤溶酶原激活素织纤溶酶原激活素(t-PA)等制剂中。等制剂中。（5）血清蛋白血清蛋白HAS易易干扰多干扰多肽肽、蛋白质药物的分析、蛋白质药物的分析,对产品纯度的影响对产品纯度的影响应予以注意。应予以注意。干扰素类干扰素类白介素白介素-2EPO尿激酶尿激酶单抗制
48、剂、单抗制剂、组织纤维酶原激活剂组织纤维酶原激活剂肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子球蛋白制剂球蛋白制剂乙肝疫苗乙肝疫苗HAS可稳可稳定定（6）氨基酸氨基酸一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨一些氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺酰胺等等,可可以增加蛋白质药物在给定以增加蛋白质药物在给定pH下的溶解度下的溶解度,并可提高其稳定并可提高其稳定性性,用量一般为用量一般为0.5%5%,其中其中,甘氨酸比较常甘氨酸比较常用。用。氨基酸除了可降低表面吸附和保护蛋白质的构象之外氨基酸除了可降低表面吸附和保护蛋白质的构象之外,还可还可防止多防止多肽肽、蛋白质药物热变性与聚集。、蛋白质药物热变性与聚集。氨
49、基酸类可稳定干扰素、氨基酸类可稳定干扰素、EPO、尿激酶和门冬、尿激酶和门冬酰胺酰胺酶等。酶等。2.注射用无菌粉末注射用无菌粉末多多肽肽、蛋白质药物注射用无菌粉末在临用时加注射用水或专、蛋白质药物注射用无菌粉末在临用时加注射用水或专门的稀释液溶解门的稀释液溶解,如人生长激素如人生长激素(hGH)冻干制剂配有冻干制剂配有2.5ml的稀释液的稀释液(装于装于5ml安瓿安瓿中中),其中含其中含0.3%的防腐剂的防腐剂(甲甲酚酚)和和1.7%的等张调节剂的等张调节剂(甘油甘油),pH为为7.5。溶解后一般也要求在溶解后一般也要求在28下保存下保存,不能不能冷冻或振摇冷冻或振摇,并并按要求在规定时间内使
50、用按要求在规定时间内使用,有的还需要避光。有的还需要避光。设计多设计多肽肽、蛋白质药物的注射用无菌粉末、蛋白质药物的注射用无菌粉末（冷（冷冻干燥制剂更为常用）时，一般可考冻干燥制剂更为常用）时，一般可考虑加入填充虑加入填充剂、缓冲剂和稳定剂等。剂、缓冲剂和稳定剂等。固体状态蛋白质药物的固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺稳定性与工艺在一些蛋白质药物不能采用溶液型制剂时，在一些蛋白质药物不能采用溶液型制剂时，往往用冷冻干燥与喷雾干燥的工艺解决这类制剂的往往用冷冻干燥与喷雾干燥的工艺解决这类制剂的稳定性问题，稳定性问题，这两种工艺均可用于热敏感药物的脱水以延缓溶液这两种工艺均可用于热敏感药物的脱水以延
51、缓溶液中常见的分解作用。中常见的分解作用。(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥制备蛋白质类药物制剂主要考虑两个问题：冷冻干燥制备蛋白质类药物制剂主要考虑两个问题：一是选择适宜的辅料，优化蛋白质药物在干燥状态一是选择适宜的辅料，优化蛋白质药物在干燥状态下的长期稳定性。下的长期稳定性。二是考虑辅料对冷冻干燥过程一些参数的影响，如二是考虑辅料对冷冻干燥过程一些参数的影响，如最高与最低干燥温度，干燥时间，冷冻干燥产品的最高与最低干燥温度，干燥时间，冷冻干燥产品的外观等。外观等。(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂关于蛋白质类药物添加剂的选择，首先要认识到虽关于蛋白质
52、类药物添加剂的选择，首先要认识到虽然冻干可以使蛋白质药物稳定，但不应忽略有些然冻干可以使蛋白质药物稳定，但不应忽略有些蛋蛋白质药物在冻干过程中反而失去活性。白质药物在冻干过程中反而失去活性。另外，高浓度的盐、缓冲组分的结晶或缓冲液另外，高浓度的盐、缓冲组分的结晶或缓冲液pKa对温度敏感而导致对温度敏感而导致pH变化，浓缩时蛋白质有限的溶变化，浓缩时蛋白质有限的溶液度等均能导致蛋白质药物失活。液度等均能导致蛋白质药物失活。(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂在选择冻干制剂的缓冲体系时，要考虑到温度对在选择冻干制剂的缓冲体系时，要考虑到温度对pH和缓冲系统溶液度的影响。和缓冲系统溶液
53、度的影响。冻干状态与溶液状态的稳定机制不同，冻干状态的冻干状态与溶液状态的稳定机制不同，冻干状态的稳定机制可能是除去水化层后，辅料作为水的替代稳定机制可能是除去水化层后，辅料作为水的替代物结合在蛋白质上。物结合在蛋白质上。(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂单剂量的蛋白质药物的量一般很少，冻干过程中和单剂量的蛋白质药物的量一般很少，冻干过程中和除去水分后，瓶内只剩很少的物质，也不会形成冻除去水分后，瓶内只剩很少的物质，也不会形成冻干饼块，因此用填充剂来改善产品的外观。干饼块，因此用填充剂来改善产品的外观。甘露醇是最常使用的填充剂，它还可作冻干保护剂。甘露醇是最常使用的填充剂，它还
54、可作冻干保护剂。其他羟基醇如山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐也其他羟基醇如山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐也可用作增容填充剂。可用作增容填充剂。(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂糖类与多元醇还具有冻干保护剂的作用。糖类与多元醇还具有冻干保护剂的作用。在冷冻干燥过程中随着周围的水被除去蛋白质容易在冷冻干燥过程中随着周围的水被除去蛋白质容易发发生生变性变性,而糖类和多元醇等多而糖类和多元醇等多羟羟基化合物可代替基化合物可代替水分子水分子,使使蛋白蛋白质与之产生氢键（质与之产生氢键（水置换假说水置换假说）。）。这对这对蛋白质药物的稳定是十分有利的。蛋白质药物的稳定是十分有利的。(1)冷冻
55、干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂溶液中的成分也可以影响冷冻干燥过程中与热有关溶液中的成分也可以影响冷冻干燥过程中与热有关的工艺参数。的工艺参数。冻干过程中与热有关的性质有：制剂的冷冻温度，冻干过程中与热有关的性质有：制剂的冷冻温度，有可能使饼状物熔化或坍塌的温度，有可能使产品有可能使饼状物熔化或坍塌的温度，有可能使产品发生降解的温度。发生降解的温度。(1)冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂在冻干过程中还应考虑药物的含水量与饼状物的物在冻干过程中还应考虑药物的含水量与饼状物的物理状态理状态(无定性或晶形无定性或晶形)，其物理状态与冷冻过程的，其物理状态与冷冻过程的温度及添加剂有
56、关。无定形的水分含量一般较高。温度及添加剂有关。无定形的水分含量一般较高。水分的增加会降低饼状物的物理稳定性并可能导致水分的增加会降低饼状物的物理稳定性并可能导致贮藏过程中饼状物的坍塌。此外水分也可以影响蛋贮藏过程中饼状物的坍塌。此外水分也可以影响蛋白质的化学稳定性。白质的化学稳定性。DSC是表征与优化冻干工艺有用的技术。是表征与优化冻干工艺有用的技术。(2)喷雾干燥蛋白质药物制剂喷雾干燥蛋白质药物制剂喷雾干燥的特点是所得产品可以控制颗粒大小与形喷雾干燥的特点是所得产品可以控制颗粒大小与形状，生产出流动性很好的球状颗粒。此项工艺对制状，生产出流动性很好的球状颗粒。此项工艺对制备蛋白质类药物的控
57、释制剂特别是发展新的给药系备蛋白质类药物的控释制剂特别是发展新的给药系统是很有用的。统是很有用的。在喷雾干燥过程中也可加入稳定剂。在喷雾干燥过程中也可加入稳定剂。喷雾干燥的缺点是操作过程中损失大，特别是小规喷雾干燥的缺点是操作过程中损失大，特别是小规模生产，水分含量高。模生产，水分含量高。二、新型注射给药系统二、新型注射给药系统要延长蛋白质药物在体内血浆半衰期就需要改变蛋要延长蛋白质药物在体内血浆半衰期就需要改变蛋白质的体内药物动力学性质，可以对蛋白质的分子白质的体内药物动力学性质，可以对蛋白质的分子进行进行化学修饰化学修饰以抑制其药理清除达到延长蛋白质类以抑制其药理清除达到延长蛋白质类药物血
58、浆半衰期的目的。药物血浆半衰期的目的。PEG化化除了化学修饰外，用控制药物释放除了化学修饰外，用控制药物释放来延长药物在体内的作用时间，来延长药物在体内的作用时间，达到提高疗效的目的。达到提高疗效的目的。这方面的研究有这方面的研究有控释微球制剂与脉冲式给药系统控释微球制剂与脉冲式给药系统。（一）控释微球制剂（一）控释微球制剂为了达到蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物为了达到蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂可降解的微球制剂目前已经实际应用的生物可降解材料有聚乳酸目前已经实际应用的生物可降解材料有聚乳酸（PLA）或聚乳酸乙醇共聚物（或聚乳酸乙醇共聚物（PLGA）聚丙交酯聚丙交
59、酯-乙交酯乙交酯（一）控释微球制剂（一）控释微球制剂首次经首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂就是醋酸批准的蛋白质类药物微球制剂就是醋酸亮丙瑞林亮丙瑞林PLGA微球。微球。PLGA微球O/O液中干燥法液中干燥法O/W液中干燥法液中干燥法 A B C(A) PLGA 15000 (B) PLGA 20000 (C) PLGA 30000PLA微球微球光镜照片（光镜照片（160）PLA微球微球电镜照片电镜照片(2000) 国外开发的国外开发的LHRH及其类似物缓释注射剂及其类似物缓释注射剂药物药物生物生物半衰期半衰期剂型剂型商品名商品名骨架骨架缓释时缓释时开发公司开发公司LHRH亮亮 丙丙 瑞瑞
60、 林林(leuprorelin)活性活性/min材料材料间间/月月181516微球微球ProstapSR，PLGA1Abott/武田武田Enantone，75 25Lucrin，Lupron，Tap-144SR微球微球PLA3武田武田(1996年年向欧美提出向欧美提出新药申请新药申请)曲曲普普瑞瑞林林(triptorelin)10030微球微球DecapeptylPLCG1Ipsen/50 50Ferring布布舍舍瑞瑞林林(buserelin)2580注射埋注射埋PLCG1Hoechst植剂植剂75 25高高舍舍瑞瑞林林(goserelin)75注射埋注射埋ZoladexPLCG1ICI植剂
61、植剂50 50那那法法瑞瑞林林(nafarelin)200144微球微球PLCASyntex/South50 50Res.Inst.(期临床期临床)国外开发的国外开发的LHRH及其类似物缓释注射剂及其类似物缓释注射剂研究中的其它多肽、蛋白质药物微球注射剂研究中的其它多肽、蛋白质药物微球注射剂 药物药物适应证适应证剂型剂型骨架骨架研究进展研究进展材料材料促红细胞生成促红细胞生成肾功能不全肾功能不全微球微球PLGA体外缓释体外缓释素素(EPO)贫血贫血50 502周周-干扰素干扰素肉芽瘤肉芽瘤微球微球PLGA体外缓释体外缓释(rhIFN-)50 507d白介素白介素(IL-)肿瘤免疫肿瘤免疫微球微
62、球PLGA动物体内动物体内治疗治疗50 50缓释缓释7d75 25人粒细胞巨噬细人粒细胞巨噬细骨髓移植骨髓移植微球微球PLGA动物体内动物体内胞集落刺激因子胞集落刺激因子50 50缓释缓释9d(GM-CSF)人生长激素人生长激素生长不良生长不良微球微球PLGA动物体内动物体内(rhGH)肾功能不全肾功能不全50 50缓释缓释30d生长抑素生长抑素生长激素分生长激素分注射埋注射埋PLGA动物体内动物体内(somatostatin)泌亢进泌亢进植剂植剂50 50缓释缓释250d此类制剂尽管有发展前景，但仍存在许多问题，此类制剂尽管有发展前景，但仍存在许多问题，主要是由于体内多聚物降解而产生酸性环境
63、使蛋白主要是由于体内多聚物降解而产生酸性环境使蛋白分子不稳定，分子不稳定，因而在其他类型的生物技术产品的应用上受到限制。因而在其他类型的生物技术产品的应用上受到限制。常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的方法：方法：1、喷雾干燥法、喷雾干燥法2、复乳液中干燥法、复乳液中干燥法3、低温喷雾干燥法、低温喷雾干燥法4、超临界萃取法、超临界萃取法超临界萃取法超临界萃取法超临界流体既具有对溶质有较大溶解度的特点，又超临界流体既具有对溶质有较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和动运的特点。具有气体易于扩散和动运的特点。更为重要的是在临界点附近，压力和温度微
64、小的变更为重要的是在临界点附近，压力和温度微小的变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现为溶解度的变化。为溶解度的变化。超临界萃取法超临界萃取法在制备微粒中根据聚合物及药物的溶解特性在制备微粒中根据聚合物及药物的溶解特性又分为又分为超临界溶液快速膨胀（超临界溶液快速膨胀（rapidexpansionofsupercriticalsolution，RESS）技术技术和气体反溶剂（和气体反溶剂（gasantisolution,GAS）技术。技术。RESS技术技术RESS技术是将固体物质在一定的温度和压力下溶解技术是将固体物质在一定的温度和压力下溶解
65、在超临界流体中形成溶液，在超临界流体中形成溶液，然后将此高压溶液从一个细小的喷嘴然后将此高压溶液从一个细小的喷嘴(内径为几十微内径为几十微米，长约几个米，长约几个)喷射到常压的空间中，喷射到常压的空间中，由于超临界流体在减压的过程中变成了气体，由于超临界流体在减压的过程中变成了气体，溶解在其中的溶质就沉淀析出，产生直径从几百纳溶解在其中的溶质就沉淀析出，产生直径从几百纳米到几个微米左右的颗粒。米到几个微米左右的颗粒。GAS技术技术GAS技术是将溶质先溶解在某种有机溶剂中，技术是将溶质先溶解在某种有机溶剂中，然后将此溶液与超临界流体混合。然后将此溶液与超临界流体混合。由于有机溶剂可溶于超临界流体
66、而溶质不溶，由于有机溶剂可溶于超临界流体而溶质不溶，于是溶质析出形成微粒。于是溶质析出形成微粒。控释微球制剂控释微球制剂由于微球的注射剂量有限由于微球的注射剂量有限,在制备多肽、蛋白质药在制备多肽、蛋白质药物缓释微球时物缓释微球时,应选择日剂量小的药物应选择日剂量小的药物；微球的释药模式与药物的临床需求应基本吻合微球的释药模式与药物的临床需求应基本吻合；微球中药物的包封率要高微球中药物的包封率要高,释药时突释作用应较小释药时突释作用应较小(这是一个难题这是一个难题),释药模式要恒定释药模式要恒定,释药时间要达到要求。释药时间要达到要求。(二二)脉冲式给药系统脉冲式给药系统肝炎、破伤风、白喉等疾
67、病所用预防药物即疫苗或类毒素均肝炎、破伤风、白喉等疾病所用预防药物即疫苗或类毒素均为抗原蛋白，其中乙肝疫苗已能用生物技术制造。使用这些为抗原蛋白，其中乙肝疫苗已能用生物技术制造。使用这些疫苗全程免疫至少进行三次接种，才能确证免疫效果疫苗全程免疫至少进行三次接种，才能确证免疫效果由于种种原因，全世界不能完成全程免疫接种而发生辍种率由于种种原因，全世界不能完成全程免疫接种而发生辍种率达达70%因此为了提高免疫接种的覆盖率，减少一些重大疾病的死亡因此为了提高免疫接种的覆盖率，减少一些重大疾病的死亡率，世界卫生组织疫苗发展规化主要目标之一，就是将多剂率，世界卫生组织疫苗发展规化主要目标之一，就是将多剂
68、疫苗发展为单剂疫苗，疫苗发展为单剂疫苗，其中之一就是研制成脉冲式给药系统。其中之一就是研制成脉冲式给药系统。脉冲式给药系统示意图脉冲式给药系统示意图 研究中的一次性注射疫苗微球研究中的一次性注射疫苗微球 抗原抗原微球骨架材料微球骨架材料粒径粒径/m体内释药模式体内释药模式动物及用药途径动物及用药途径BSA乙烯醋酸乙乙烯醋酸乙0.3初始突释，以后初始突释，以后小鼠皮下埋植小鼠皮下埋植酯酯(EVAC)连续释药连续释药-核糖核核糖核EVAC0.3初始突释，以后初始突释，以后兔皮下埋植兔皮下埋植酸酶酸酶A连续释药连续释药BSAEVAC初始突释，以后初始突释，以后兔皮下埋植兔皮下埋植连续释药连续释药BS
69、A聚聚TTH-亚氨亚氨0.5克微球克微球(内内连续释药后期连续释药后期小鼠皮下埋植小鼠皮下埋植基碳酸盐基碳酸盐含含BSA50mg)减慢减慢卵清蛋白卵清蛋白PLGA50 505.34小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射34kDaSEBPLGA110小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射50 502050白喉类毒素白喉类毒素PLA30100初始突释，以初始突释，以小鼠气管滴注至小鼠气管滴注至49kDa后连续释药后连续释药肺、皮下注入肺、皮下注入MN-rgp120PLGA20100脉冲释药脉冲释药豚鼠皮下注入豚鼠皮下注入HSD白喉白喉PLGA65 35590连续释药连续释药大鼠、猴肌注大鼠、猴肌注类毒素类毒素PLAMN-rg
70、p120PLGA50 500.370.50小鼠皮下、肌注小鼠皮下、肌注34kDa及鼻腔用药及鼻腔用药各种多肽各种多肽PLGA0.450.60小鼠腹腔、肌内小鼠腹腔、肌内抗原抗原50 501.213.20注射注射6.2432.1注：BSA：牛血清白蛋白；SEB：葡萄球菌肠毒素类毒素；MN-rgp120：人免疫缺陷病毒(HIV-1)预防疫苗的蛋白亚单位 (三三)主要发展方向主要发展方向注射型给药系统主要以生物降解材料为载体，注射型给药系统主要以生物降解材料为载体，天然聚合物：明胶、葡聚糖、白蛋白、甲壳素等。天然聚合物：明胶、葡聚糖、白蛋白、甲壳素等。合成聚合物：合成聚合物：PLA、聚丙交酯、聚己内
71、酯、聚羟丁聚丙交酯、聚己内酯、聚羟丁酸等。酸等。(1)埋植型缓控释给药系统埋植型缓控释给药系统(棒状结构棒状结构)如：布舍瑞林如：布舍瑞林+PLA熔融混合熔融混合挤出条状物挤出条状物(直径为直径为1mm)切割成单剂量切割成单剂量(含含3.6mg药物药物/段段)灭菌灭菌密封于一次性注射器内密封于一次性注射器内(供皮下或肌肉注射，缓控释供皮下或肌肉注射，缓控释作用可达作用可达1年以上年以上)。(2)微球型缓控释注射给药系统微球型缓控释注射给药系统一般皮下或肌肉注射，粒径一般皮下或肌肉注射，粒径500um。主要制备技术：相分离法、复乳主要制备技术：相分离法、复乳-液中干燥法、喷雾液中干燥法、喷雾干燥
72、法、喷雾冷冻法、熔融挤出法等干燥法、喷雾冷冻法、熔融挤出法等(缓释作用可缓释作用可达达13个月个月)。(3)纳米型给药系统纳米型给药系统粒径粒径200nm，皮下或肌肉注射缓控释，静脉和动脉皮下或肌肉注射缓控释，静脉和动脉给药靶向性）给药靶向性）主要剂型有：脂质体、微乳和复乳、脂质纳米粒、主要剂型有：脂质体、微乳和复乳、脂质纳米粒、纳米球和纳米囊。纳米球和纳米囊。第三节第三节多肽、蛋白质药物非注射制剂多肽、蛋白质药物非注射制剂蛋白质和多肽类药物非注射途径包括鼻腔、口服、蛋白质和多肽类药物非注射途径包括鼻腔、口服、直肠、口腔、透皮、眼内和肺部给药，其中鼻腔似直肠、口腔、透皮、眼内和肺部给药，其中鼻
73、腔似乎最有前景，然而口服给药是目前最受欢迎的给药乎最有前景，然而口服给药是目前最受欢迎的给药途经。途经。蛋白质类药物非注射途经系统存在的主要问题是蛋白质类药物非注射途经系统存在的主要问题是药物穿透粘膜能力差，易受酶的降解，以至生物利药物穿透粘膜能力差，易受酶的降解，以至生物利用度很低。用度很低。为了提高这类药物制剂的生物利用度，一般采用以为了提高这类药物制剂的生物利用度，一般采用以下方法：下方法：(1)对药物进行化学修饰或制成前体药物；对药物进行化学修饰或制成前体药物；(2)应用吸收促进剂；应用吸收促进剂；(3)使用酶抑制剂；使用酶抑制剂；(4)采用离子电渗法皮肤给药。采用离子电渗法皮肤给药。
74、吸收促进剂作用机制吸收促进剂作用机制(1)增强药物的热力学运动，使药物不易聚集，溶解增强药物的热力学运动，使药物不易聚集，溶解性增加，易于吸收；性增加，易于吸收；(2)改变上皮细胞的体积，使细胞间转运更易进行；改变上皮细胞的体积，使细胞间转运更易进行；(3)增加生物膜的流动性，使药物容易穿过，或引起增加生物膜的流动性，使药物容易穿过，或引起膜磷酯排列的混乱或是促进膜中蛋白的沥滤；膜磷酯排列的混乱或是促进膜中蛋白的沥滤；(4)抑制药物的水解。抑制药物的水解。(一一)鼻腔给药系统鼻腔给药系统鼻腔给药对多肽蛋白质药物在非注射剂型中是一个鼻腔给药对多肽蛋白质药物在非注射剂型中是一个较有希望的给药途经。
75、较有希望的给药途经。由于鼻腔粘膜中动静脉和毛细淋巴管分布十分丰富，由于鼻腔粘膜中动静脉和毛细淋巴管分布十分丰富，鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛，鼻腔粘膜鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛，鼻腔粘膜的穿透性较高而酶相对较少，对蛋白质类药物的分的穿透性较高而酶相对较少，对蛋白质类药物的分解作用比胃肠道粘膜为低，因而有利于药物的吸收解作用比胃肠道粘膜为低，因而有利于药物的吸收并直接进入体内血液循环。并直接进入体内血液循环。为了提高蛋白质类药物鼻腔给药的生物利用度，可为了提高蛋白质类药物鼻腔给药的生物利用度，可采用吸收促进剂。采用吸收促进剂。鼻腔给药常用吸收促进剂鼻腔给药常用吸收促进剂(1)胆酸盐
76、类：甘胆酸盐、胆酸盐、去氧胆酸盐、牛胆酸盐类：甘胆酸盐、胆酸盐、去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、葡萄糖胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、乌索去磺胆酸盐、葡萄糖胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、乌索去氧胆酸盐等。氧胆酸盐等。(2)脂肪酸及其酯类：癸酸酯、辛酸酯、月桂酸酯等。脂肪酸及其酯类：癸酸酯、辛酸酯、月桂酸酯等。(3)其它：十二烷基硫酸钠、柠檬烯、牛磺双氢褐霉其它：十二烷基硫酸钠、柠檬烯、牛磺双氢褐霉素钠、壳聚糖等。素钠、壳聚糖等。(二二)肺部给药系统肺部给药系统肺部具有巨大的可供吸收的表面积和十分丰富的毛肺部具有巨大的可供吸收的表面积和十分丰富的毛细血管细血管,从肺泡表面到毛细血管的转运距离极短从肺泡表面到毛细血管的转运
77、距离极短,而且肺部的酶活性较胃肠道低而且肺部的酶活性较胃肠道低,没有胃肠道那么苛没有胃肠道那么苛刻的酸性环境刻的酸性环境,在肺部吸收的药物可直接进入血液循环在肺部吸收的药物可直接进入血液循环,故可避开故可避开肝脏的首过效应。肝脏的首过效应。现在人们已越来越多地意识到现在人们已越来越多地意识到,肺部对那些在胃肠肺部对那些在胃肠道难以吸收的药物道难以吸收的药物(如大分子药物如大分子药物)来说可能是一来说可能是一个很好的给药途径。个很好的给药途径。早在早在1987年就有人进行了糖尿病患儿的年就有人进行了糖尿病患儿的胰胰岛素吸岛素吸入入治疗治疗；1993年以来很多人进行过糖尿病患者的年以来很多人进行过
78、糖尿病患者的胰胰岛素雾化岛素雾化吸入治疗吸入治疗,有人证实有人证实胰胰岛素吸入的生物利用度达岛素吸入的生物利用度达15%左右左右,有人证实有人证实胰胰岛素吸入可以调节餐后高血糖。岛素吸入可以调节餐后高血糖。近年来近年来胰胰岛素的肺部给药岛素的肺部给药系统又取得了较大进展系统又取得了较大进展,如如Aradigm公司开发了可精确控制给药量的雾化吸人装置公司开发了可精确控制给药量的雾化吸人装置(AERx),在健康志愿者和糖尿病患者身上达到了与皮下注射在健康志愿者和糖尿病患者身上达到了与皮下注射相似的降糖效果相似的降糖效果,而且重现性较好而且重现性较好；Dura和和Inhale公司则开发了公司则开发了
79、胰胰岛素的岛素的粉末粉末吸入装置吸入装置,在餐在餐后高血糖的控制与长期给药的疗效方面都获得了较好的结果后高血糖的控制与长期给药的疗效方面都获得了较好的结果,与皮下注射给药进行了二个月的比较与皮下注射给药进行了二个月的比较,对血糖的控制几乎对血糖的控制几乎相同相同,而且粉末吸而且粉末吸入入组没有出现肺部的损害。组没有出现肺部的损害。这些研究显示了多这些研究显示了多肽肽、蛋白质药物肺部给药系统的、蛋白质药物肺部给药系统的光明前景。光明前景。(二二)肺部给药系统肺部给药系统目前肺部给药系统存在的主要问题：目前肺部给药系统存在的主要问题：(1)长期给药后安全性评估；长期给药后安全性评估；(2)肺吸收分
80、子大小的限制；肺吸收分子大小的限制；(3)促进吸收的措施；促进吸收的措施；(4)稳定的蛋白质药物的处方设计等。稳定的蛋白质药物的处方设计等。(三三)口服给药系统口服给药系统蛋白质类口服给药主要存在的问题：蛋白质类口服给药主要存在的问题：(1)在胃内酸催化降解；在胃内酸催化降解；(2)在胃肠道内的酶水解；在胃肠道内的酶水解；(3)对胃肠道粘膜的透过性差；对胃肠道粘膜的透过性差；(4)在肝的首过效应。在肝的首过效应。蛋白质类口服给药主要剂型：蛋白质类口服给药主要剂型：(1)微乳制剂；微乳制剂；(2)纳米囊；纳米囊；(3)肠溶软胶囊；肠溶软胶囊；(4)微球制剂；微球制剂；(5)脂质体等。脂质体等。(
81、四四)口腔粘膜给药系统口腔粘膜给药系统口腔粘膜较鼻腔粘膜厚，但无角质层，面颊部血管口腔粘膜较鼻腔粘膜厚，但无角质层，面颊部血管丰富，药物吸收后可经颈静脉、上腔静脉直接进入丰富，药物吸收后可经颈静脉、上腔静脉直接进入全身，可胃肠消化液降解和肝的首过效应。全身，可胃肠消化液降解和肝的首过效应。口腔粘膜吸收主要改进药物的膜穿透性和抑制药物口腔粘膜吸收主要改进药物的膜穿透性和抑制药物的代谢。的代谢。口腔粘膜给药常用吸收促进剂有：口腔粘膜给药常用吸收促进剂有：甘胆酸钠、去氧胆酸钠、甘胆酸钠、去氧胆酸钠、梭链孢酸钠、聚氧乙烯梭链孢酸钠、聚氧乙烯(9)月桂基醚、月桂基醚、聚氧乙烯聚氧乙烯(9)辛基醚、辛基醚
82、、十二烷基硫酸钠、磷脂酰肌醇等。十二烷基硫酸钠、磷脂酰肌醇等。(五五)直肠给药系统直肠给药系统直肠内水解酶活性比胃肠道低，直肠内水解酶活性比胃肠道低，pH接近中性，接近中性，且药物吸收后可基本上避免肝的首过效应。且药物吸收后可基本上避免肝的首过效应。直肠给药常用吸收促进剂有：直肠给药常用吸收促进剂有：水杨酸、水杨酸、5-甲氧基水杨酸、甲氧基水杨酸、去氧胆酸钠、去氧胆酸钠、DL-苯基苯胺乙醚乙酸乙酯苯基苯胺乙醚乙酸乙酯(DL-phenylalanineethylacetoacetate)、聚氧乙烯聚氧乙烯(PEO-9-月桂基醚月桂基醚)、烯胺类烯胺类(enamine)衍生物如衍生物如D-甘氨酸钠、甘氨酸钠、D-亮氨酸亮氨酸钠、钠、D-苯丙氨酸钠等。苯丙氨酸钠等。（六）（六）经皮给药系统经皮给药系统皮肤的穿透性低是多肽和蛋白质药物经皮吸收的主皮肤的穿透性低是多肽和蛋白质药物经皮吸收的主要障碍，要障碍，但皮肤的水解酶活性相当低，为多肽和蛋白质药物但皮肤的水解酶活性相当低，为多肽和蛋白质药物经皮吸收创造了有利条件。经皮吸收创造了有利条件。
