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1、实验二、双向琼脂扩散实验二、双向琼脂扩散实验二、双向琼脂扩散实验二、双向琼脂扩散试验试验试验试验实验目的：实验目的：了解双向琼脂扩散的原理和用途。掌握抗体效价的测定方法。观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉沉淀反应。淀反应。沉淀反应
2、中的抗原叫沉淀反应中的抗原叫沉淀原（沉淀原（precipitinogen）,与沉与沉淀原发生反应的抗体称为淀原发生反应的抗体称为沉淀素（沉淀素（precipitin）。沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应琼脂扩散反应。实验原理实验原理将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的。沉淀线的特征与抗原抗
3、体的浓度、浓度、纯度和扩散速率纯度和扩散速率等有关。等有关。双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验一种抗原抗体系统只出现一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带一条沉淀带根据沉淀带出现的根据沉淀带出现的数目数目、位位置以及相邻二置以及相邻二条沉淀带之间的条沉淀带之间的融合、交叉、分枝融合、交叉、分枝等情况，等情况，就可了解该复合抗原的组成。就可了解该复合抗原的组成。 免疫学及免疫学检验 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散
4、率Ag Ab沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系 免疫学及免疫学检验 (1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。A1：待检抗原；A2：标准抗原抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。 免疫学及免疫学检验材料与试剂材料与试剂1琼脂粉琼脂粉2平皿平皿3打孔器打孔器4生理盐水或其他缓冲液生理盐水或其
5、他缓冲液5. 抗原、抗体抗原、抗体操作方法操作方法1称取一定量的琼脂粉，按称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理的比例加入生理盐水或缓冲液，煮沸融化。盐水或缓冲液，煮沸融化。2将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm3mm。自然冷却。自然冷却。3根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径之间的距离，包括两孔的半径35mm）打成梅）打成梅花形孔图。花形孔图。4挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。5在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔
6、化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。6吸取样品加入孔内吸取样品加入孔内(约约15ul)，以加满为度。，以加满为度。7加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，盘中，37自由扩散自由扩散24h48h。结果判定结果判定用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。213456双向免疫扩散凝胶染色图双向免疫扩散凝胶染色图1. 1.双扩散用于疾病诊断：双扩
7、散用于疾病诊断：双扩散用于疾病诊断：双扩散用于疾病诊断： 以以以以IBDIBD诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加诊断为例，中心孔加IBDIBD标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别标准阳性血清，周围孔分别加加加加IBDIBD标准抗原、生理盐水、标准抗原、生理盐水、标准抗原、生理盐水、标准抗原、生理盐水、待检抗原待检抗原待检抗原待检抗原1.2.3.41.2.3.4。2. 2.双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测：双扩散用于抗体检测： 以以以以免疫鸡免疫鸡免疫鸡免疫鸡IBDIBD抗体检测为例，中抗体检测为例，中抗体检测为例，中抗体检测为例，中心孔加心孔加心孔加心孔加IBDIBD标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔标准抗原，周围孔分别加分别加分别加分别加IBDIBD标准阳性血清标准阳性血清标准阳性血清标准阳性血清. .、 IBDIBD阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清阴性血清、待检血清1.2.3.41.2.3.4。
