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1、肿瘤化疗耐药性机理肿瘤化疗耐药性机理及肿瘤化疗敏感性检测及肿瘤化疗敏感性检测一一. .肿瘤化疗耐药性肿瘤化疗耐药性( (一一) )概述概述 化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。19461946年年Gillman和和 Phillips报道报道氮芥类药物氮芥类药物治疗造血系统治疗造血系统肿瘤以来，化疗已取得长足进步。肿瘤以来，化疗已取得长足进步。5050年代年代氟脲嘧氟脲嘧啶啶、环磷酰胺环磷酰胺，7070年代年代顺铂顺铂的开发都成为化疗史的开发都成为化疗史上的里程碑，目前临床应用的抗肿瘤
2、药物已达上的里程碑，目前临床应用的抗肿瘤药物已达6060余种。通过不懈的基础与临床研究，揭示了化疗余种。通过不懈的基础与临床研究，揭示了化疗的部分规律，形成了现行的联合用药、大剂量间的部分规律，形成了现行的联合用药、大剂量间断给药、多途径多方式给药等有助于提高疗效的断给药、多途径多方式给药等有助于提高疗效的治疗策略。治疗策略。 目前化疗已使绒癌、恶性葡萄胎、何杰金目前化疗已使绒癌、恶性葡萄胎、何杰金病、睾丸精原细胞瘤等获得治愈的机会，使乳病、睾丸精原细胞瘤等获得治愈的机会，使乳腺癌、儿童淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤等腺癌、儿童淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤等得以缓解，存活期得到延长，从而化疗成为
3、恶得以缓解，存活期得到延长，从而化疗成为恶性肿瘤治疗的主要手段之一。性肿瘤治疗的主要手段之一。 但临床抗肿瘤药物治疗的总有效率仅但临床抗肿瘤药物治疗的总有效率仅1414。阻碍化疗取得更好疗效的原因是：阻碍化疗取得更好疗效的原因是：1.1.现行化疗的盲目性、凭经验治疗：现行化疗的盲目性、凭经验治疗：个体化治疗个体化治疗2.2.化疗的耐药性：化疗的耐药性：设法防治耐药设法防治耐药、逆转耐药性逆转耐药性3.3.抗肿瘤药物的毒性：抗肿瘤药物的毒性：联合用药等措施联合用药等措施( (二二) )耐药性类型：耐药性类型：先天性耐药先天性耐药( (natural resistance): ): 肿瘤一开始就肿
4、瘤一开始就对抗肿瘤药物有耐药性，主要与药理学、生物对抗肿瘤药物有耐药性，主要与药理学、生物化学和肿瘤细胞增殖动力学有关。化学和肿瘤细胞增殖动力学有关。获得性耐药获得性耐药( (acquired resistence) )：肿瘤最初对抗肿瘤最初对抗肿瘤药物敏感，应用后产生的耐药性。肿瘤药物敏感，应用后产生的耐药性。根据耐药谱分为：根据耐药谱分为：原药耐药原药耐药( (primary drug resistence,PDR) )：只对原只对原抗肿瘤药物产生耐药，而对其他抗肿瘤药物不抗肿瘤药物产生耐药，而对其他抗肿瘤药物不产生交叉耐药。产生交叉耐药。多药耐药多药耐药( (multiple drug
5、resistence.MDR) )：由一由一种抗肿瘤药物诱发，但同时又对其他多种结构种抗肿瘤药物诱发，但同时又对其他多种结构和功能差异的抗肿瘤药物产生交叉耐药。和功能差异的抗肿瘤药物产生交叉耐药。( (三三) )多药耐药产生机理：多药耐药产生机理： 1.1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)和和谷胱甘肽谷胱甘肽-S-转转移酶移酶(glutathione-s-transferase,GST) GSH与与GST密切配合密切配合启动肿瘤细胞内解毒机启动肿瘤细胞内解毒机制而使化疗药物失活制而使化疗药物失活，参与耐药机理的形成。如，参与耐药机理的形成。如苯丙酸氮芥、环磷酰胺、顺铂、阿霉素
6、、丝裂霉苯丙酸氮芥、环磷酰胺、顺铂、阿霉素、丝裂霉素等。素等。 胞胞内内GSH浓度与浓度与-谷氨酰半胱氨酸合成酶谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( (-GCS-GCS) )、谷胱甘肽合成酶谷胱甘肽合成酶(GS)、谷胱甘肽还原谷胱甘肽还原酶酶(GR)活性有关；与活性有关；与谷氨酸谷氨酸、半胱氨酸半胱氨酸、甘氨酸甘氨酸的含量有关。的含量有关。 GSH含量及相关酶：含量及相关酶： GST 、-GCS-GCS、 GS、 GR活性是活性是GSH引起耐药的相关因子。引起耐药的相关因子。具体机理具体机理： GST可催化可催化GSH与亲电性抗肿瘤药物迅速结合，与亲电性抗肿瘤药物迅速结合，加速抗肿瘤药物的降解，使药物在靶
7、部位的积加速抗肿瘤药物的降解，使药物在靶部位的积蓄迅速减少，从而达不到致死浓度。蓄迅速减少，从而达不到致死浓度。GST可催化亲脂性抗肿瘤药物与胆红素及甾体可催化亲脂性抗肿瘤药物与胆红素及甾体化合物等结合，加速药物的排泄，并保护膜脂化合物等结合，加速药物的排泄，并保护膜脂质成分免受自由基等损伤。质成分免受自由基等损伤。清除细胞毒性代谢产物，如过氧化物和自由基清除细胞毒性代谢产物，如过氧化物和自由基被被GSH还原成毒性较低醇类物质。还原成毒性较低醇类物质。阻止药物与靶细胞阻止药物与靶细胞DNA结合，并加强对损伤结合，并加强对损伤DNA的修复能力，降低抗肿瘤药物的细胞毒作的修复能力，降低抗肿瘤药物的
8、细胞毒作用。用。 2.2.P-P-糖蛋白糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp): : P-gp由多药耐药基因由多药耐药基因( (mdr) )编码分子量为编码分子量为17KD17KD，具有能量依赖性药泵跨膜糖蛋白。使具有能量依赖性药泵跨膜糖蛋白。使ATPATP水解成水解成ADPADP，释放能量，并在释放能量，并在MgMg2+2+的作用下，与细的作用下，与细胞内抗肿瘤药物结合并运输到细胞外，胞内抗肿瘤药物结合并运输到细胞外，P-gp可将可将亲脂类亲脂类化疗药物泵出细胞外化疗药物泵出细胞外，也可能同时，也可能同时存在多存在多种药物结合点而将多种药物泵出细胞外种药物结合点而将多种药物泵出细
9、胞外，引起耐，引起耐药。药。 P-gp高高表达伴随预后不良，可作为肿瘤患表达伴随预后不良，可作为肿瘤患者预后评价的指标。者预后评价的指标。 P-gp也可也可存在许多正常组织：脑、肺、肝、存在许多正常组织：脑、肺、肝、肾、结肠等处。肾、结肠等处。 3.3.多多药药耐药相关蛋白耐药相关蛋白 ( (mulitidrug related protein,MRP) ) 分子量为分子量为19KD19KD的能量依赖性药泵跨膜糖的能量依赖性药泵跨膜糖蛋白，蛋白， MRP增高可将带负电荷药物如阿霉增高可将带负电荷药物如阿霉素、表阿霉素、素、表阿霉素、Vp16、长春新碱、长春花碱、长春新碱、长春花碱、放线菌素等泵
10、出细胞；放线菌素等泵出细胞； MRP能能识别并转运与识别并转运与GSH耦合的底物；耦合的底物； MRP能使细胞内药物分能使细胞内药物分布发生改变，使重要的攻击靶点（胞核）药布发生改变，使重要的攻击靶点（胞核）药物减少，从而产生耐药。物减少，从而产生耐药。 4.4.拓扑异构酶拓扑异构酶 ( (topoisomerase,TOPO) ) TOPO是是催化催化DNA拓扑结构改变的酶，即引拓扑结构改变的酶，即引起起DNA二二维、三维结构改变的酶系统。它直接参维、三维结构改变的酶系统。它直接参与细胞的增殖，与与细胞的增殖，与DNA复制、转录、姊妹染色体复制、转录、姊妹染色体的分离及基因的表达密切相关，可
11、以影响细胞许的分离及基因的表达密切相关，可以影响细胞许多重要的生物学功能，是多重要的生物学功能，是细胞维持正常生理活动细胞维持正常生理活动所必需的酶所必需的酶。 TOPO根据其断裂根据其断裂DNA单链或双链而分为单链或双链而分为、 。 TOPO 是喜树是喜树碱、蒽环类抗肿瘤药物的重碱、蒽环类抗肿瘤药物的重要靶点，要靶点， TOPO 是是许多插入物、许多插入物、Vp16等的重等的重要靶点。这些药物通过该酶与要靶点。这些药物通过该酶与DNA交链形成共价交链形成共价复合物，引起复合物，引起DNA永久性损伤，导致肿瘤细胞死永久性损伤，导致肿瘤细胞死亡。若该亡。若该酶含量减少酶含量减少，活性降低活性降低
12、，复合物形成减复合物形成减少而产生耐药少而产生耐药。 5.5.肺耐药蛋白肺耐药蛋白 (lung resistance (lung resistance pyotein,pyotein,LRPLRP) ) LRP LRP为分子量为分子量110KD110KD穹窿蛋白（穹窿作穹窿蛋白（穹窿作为胞浆中的一种细胞器，所含的核糖蛋白颗为胞浆中的一种细胞器，所含的核糖蛋白颗粒粒5050为为LRPLRP）。）。LRPLRP可能介导顺铂、卡铂、可能介导顺铂、卡铂、烷化剂等一些烷化剂等一些P-gp和和MRP不能介导的药物不能介导的药物从核到胞浆重新分布从核到胞浆重新分布因而产生耐药。因而产生耐药。 6.6.二二氢
13、氢叶酸还原酶叶酸还原酶 ( (dihydrofolate reductase,DHFR) DHFR分子量为分子量为22KD，是细胞内叶酸代谢是细胞内叶酸代谢的关键酶，能催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，四的关键酶，能催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，四氢叶酸在胸腺嘧啶合成酶作用下参与氢叶酸在胸腺嘧啶合成酶作用下参与DNA、RNA、蛋白质的合成。氨甲碟呤蛋白质的合成。氨甲碟呤(MTX)是一种叶是一种叶酸类似物，能竞争性地与靶酶酸类似物，能竞争性地与靶酶DHFR的活性位点的活性位点结合而使其失活，导致细胞内四氢叶酸含量下降，结合而使其失活，导致细胞内四氢叶酸含量下降，细胞细胞DNA合成异常，引起细胞死亡。合成
14、异常，引起细胞死亡。MTX产生产生耐药因素与耐药因素与DHFR基因突变有关基因突变有关。 7.7.O O6-6-烷基鸟嘌呤烷基鸟嘌呤DNADNA烷基转移酶烷基转移酶 ( (O6-alkylguanine DNA alkyltransferase,AGT) ) AGT由甲基鸟嘌呤转移酶基因编码，由甲基鸟嘌呤转移酶基因编码，AGT能修复损伤能修复损伤DNA，即即修复许多烷化剂类抗肿瘤修复许多烷化剂类抗肿瘤药物所诱导形成药物所诱导形成O O6-6-烷基鸟嘌呤烷基鸟嘌呤DNA加成物加成物，因，因而使肿瘤细胞产生耐药。而使肿瘤细胞产生耐药。 8.8.醛脱氢酶醛脱氢酶 (aldehydrase,ALDH)
15、 环磷酰胺（环磷酰胺（CTX）进入人体后在肝脏进入人体后在肝脏内经内经P450羟化形成羟化形成4-羟环磷酰胺，它与羟环磷酰胺，它与醛醛磷酰胺磷酰胺存在互变异构，醛磷酰胺经历一次存在互变异构，醛磷酰胺经历一次消除反应，形成丙烯醛与磷酰胺芥。消除反应，形成丙烯醛与磷酰胺芥。磷酰磷酰胺芥胺芥对肿瘤细胞产生细胞毒作用，而对肿瘤细胞产生细胞毒作用，而ALDH能将醛磷酰胺氧化成无毒性的羧基能将醛磷酰胺氧化成无毒性的羧基磷酰氨磷酰氨，不对肿瘤细胞产生细胞毒作用，不对肿瘤细胞产生细胞毒作用，从而出现肿瘤细胞耐药。从而出现肿瘤细胞耐药。 9.9.蛋白激酶蛋白激酶C C (protrin kinase C, PK
16、C) PKCPKC是一种是一种CaCa2+2+、磷脂依赖性蛋白质激酶，磷脂依赖性蛋白质激酶，使多种蛋白质的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化，影使多种蛋白质的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化，影响细胞内生物信息的传导，在调节细胞代谢、分响细胞内生物信息的传导，在调节细胞代谢、分化、增殖、癌变中具有重要作用。在化、增殖、癌变中具有重要作用。在MDRMDR细胞中细胞中加入维拉帕米、三氟拉嗪，细胞内加入维拉帕米、三氟拉嗪，细胞内PKCPKC活性降低活性降低5050，MDRMDR出现完全或部分逆转。出现完全或部分逆转。 PKCPKC在在MDRMDR中的机理是中的机理是增加增加P-gp的磷酸化的磷酸化，而，而P-gp磷酸
17、化是其依赖磷酸化是其依赖ATPATP向细胞外转运药物的必向细胞外转运药物的必要条件。用要条件。用PKCPKC抑制剂抑制剂H7H7可使可使P-gp磷酸化程度降磷酸化程度降低低3030；用；用PKCPKC激活剂可加速激活剂可加速P-gp磷酸化。磷酸化。10.10.凋亡基因失活与抗凋亡基因激活凋亡基因失活与抗凋亡基因激活 凋亡基因凋亡基因 baxbax、 bclbcl-Xs -Xs 、p53p53等失活；等失活；抗凋亡基因抗凋亡基因 bcl-2 bcl-2 、bclbcl-Xl-Xl、ber/ablber/abl等激活，等激活， Bcl-2Bcl-2蛋白蛋白过表达可通过抑制过表达可通过抑制P53P5
18、3蛋白活性、蛋白活性、抑制抑制c-mycc-myc诱导的凋亡、与诱导的凋亡、与BaxBax蛋白形成异二蛋白形成异二聚体等途径导致肿瘤细胞对许多化疗药物诱聚体等途径导致肿瘤细胞对许多化疗药物诱导的凋亡不敏感，参与肿瘤细胞多药耐药。导的凋亡不敏感，参与肿瘤细胞多药耐药。 ( (四四) )多药耐药模型的建立多药耐药模型的建立 1.1.体外耐药细胞系的建立：体外耐药细胞系的建立： 药物浓度递增持续作用法、药物浓度递增持续作用法、 大剂量药物间歇诱导法、大剂量药物间歇诱导法、 采用转基因方法。采用转基因方法。 2.2.体内耐药细胞系的建立：体内耐药细胞系的建立：( (五五) )耐药株细胞检测耐药株细胞检
19、测1.1.细胞形态变化：光镜、电镜观察细胞形态变化：光镜、电镜观察2.2.细胞生长曲线：计算群体倍增时间细胞生长曲线：计算群体倍增时间3.3.耐药指数：耐药指数：耐药株耐药株IC50/亲代株亲代株IC504.4.细胞染色体检测：染色体均匀染色区、双微核。细胞染色体检测：染色体均匀染色区、双微核。5.5.免疫细胞化学法：免疫细胞化学法：P-gp、MRP、 GST-、bcl-2等。等。6.6.细胞内酶的测定：细胞内酶的测定：O O6-6-烷基鸟嘌呤烷基鸟嘌呤DNADNA烷基转烷基转移酶、谷胱甘肽移酶、谷胱甘肽和谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶测定转移酶测定7,7,流式细胞仪测定：流式细胞仪测定：P-
20、gp、bcl-2等及细胞周期等及细胞周期分布分布8.8.细胞内药物浓度测定：用电感耦合等离子体细胞内药物浓度测定：用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定细胞内铂、阿霉素等浓原子发射光谱仪测定细胞内铂、阿霉素等浓度。度。 9.9.多药耐药基因多药耐药基因mRNAmRNA的检测：的检测：PCRPCR、NorthernNorthern印印迹分析、迹分析、 原位杂交等。原位杂交等。10.10.耐药株稳定性测定：细胞冻存与复苏耐药株稳定性测定：细胞冻存与复苏二二 抗癌药物敏感试验抗癌药物敏感试验 ( (anti-cancer drug sensitivity test) )( (一一) )分类分类 1.1
21、.体内法体内法：鸡胚接种移植法、动物眼前房移：鸡胚接种移植法、动物眼前房移植法、裸鼠及标准动物的肾包膜下移植法等。植法、裸鼠及标准动物的肾包膜下移植法等。它们不脱离肿瘤生长的体内环境、在组织学它们不脱离肿瘤生长的体内环境、在组织学和细胞动力学方面都与人体肿瘤内一致，因和细胞动力学方面都与人体肿瘤内一致，因而使试验结果与临床的符合率高。而使试验结果与临床的符合率高。 2.2.体外法体外法：人癌干细胞克隆形成测定法：人癌干细胞克隆形成测定法（HTCAHTCA）、）、四唑氮蓝显色反应法（四唑氮蓝显色反应法（MTT法）、法）、同位素掺入法、同位素掺入法、ATPATP生物发光法、琥珀酸脱氢生物发光法、琥
22、珀酸脱氢酶抑制法、染料排除法、流式细胞仪法、酶抑制法、染料排除法、流式细胞仪法、PCRPCR法等。它们具有快速、简便、与临床相关性法等。它们具有快速、简便、与临床相关性好、重复性好等优点。好、重复性好等优点。 ( (二二) )四唑氮蓝显色反应药敏试验（四唑氮蓝显色反应药敏试验（MTT法）法） 1.1.原理原理： 利用活细胞内线粒体脱氢酶能将利用活细胞内线粒体脱氢酶能将MTT转转化为蓝紫色衍生物化为蓝紫色衍生物( (formazan) )的原理来检测的原理来检测活细胞数目。活细胞数目。产物颜色深浅产物颜色深浅（可用吸光值表（可用吸光值表示）示）与活细胞数成正比与活细胞数成正比，吸光值可以在自动，
23、吸光值可以在自动酶标仪上连续记数，测定出肿瘤细胞未用药酶标仪上连续记数，测定出肿瘤细胞未用药与用药的吸光值，计算出肿瘤细胞存活率，与用药的吸光值，计算出肿瘤细胞存活率，从而预测患者体内肿瘤细胞对某种抗肿瘤药从而预测患者体内肿瘤细胞对某种抗肿瘤药物敏感程度。物敏感程度。2.2.方法：方法：计算：计算： 实验组吸光值实验组吸光值 肿瘤细胞存活率肿瘤细胞存活率 肿瘤细胞对照组吸光值肿瘤细胞对照组吸光值 肿瘤细胞抑制率肿瘤细胞抑制率1 1肿瘤细胞存活率肿瘤细胞存活率结果判定：肿瘤细胞抑制率结果判定：肿瘤细胞抑制率 7070 该药高度敏感该药高度敏感 肿瘤细胞抑制率肿瘤细胞抑制率50507070该药中度
24、敏感该药中度敏感 肿瘤细胞抑制率肿瘤细胞抑制率 50 50该药不敏感该药不敏感应用：应用：肿瘤患者个体化治疗中的作用：实体瘤、胸腹水、肿瘤患者个体化治疗中的作用：实体瘤、胸腹水、骨髓血、外周血等。骨髓血、外周血等。其他方面应用：其他方面应用： 逆转耐药测试，逆转耐药测试， 筛选新抗治疗药物（抗癌谱、半致死量等筛选新抗治疗药物（抗癌谱、半致死量等）， 其他细胞毒作用的药物如细胞因子、反义核其他细胞毒作用的药物如细胞因子、反义核苷酸的作用检测，苷酸的作用检测， 新合成人类替代材料对正常细胞的毒性作用。新合成人类替代材料对正常细胞的毒性作用。影响因素及注意事项：影响因素及注意事项：1.肿瘤细胞的病理
25、类型肿瘤细胞的病理类型2.肿瘤标本取材部位肿瘤标本取材部位3.肿瘤标本污染肿瘤标本污染4.肿瘤细胞纯度问题肿瘤细胞纯度问题存在问题：存在问题：1.误差问题误差问题2.在体内活化后再发挥抗肿瘤作用的药物在体内活化后再发挥抗肿瘤作用的药物（CTX）的检测的检测3.有色抗肿瘤注射药物（有色抗肿瘤注射药物（DNR、ADM、表阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌等）、片剂、粉剂抗肿瘤药物的检测米托蒽醌等）、片剂、粉剂抗肿瘤药物的检测4.化疗联合用药的药敏试验化疗联合用药的药敏试验 MTT法是代表整个肿瘤细胞群体的样本的法是代表整个肿瘤细胞群体的样本的药敏方法。它可更好地预测肿瘤细胞对药物药敏方法。它可更好地预测肿瘤细胞对药物反应。它简便、快捷、成功率高、与临床相反应。它简便、快捷、成功率高、与临床相关性较高，在研究抗肿瘤药物相互作用、耐关性较高，在研究抗肿瘤药物相互作用、耐药修饰剂应用、新抗肿瘤药物筛选及其他试药修饰剂应用、新抗肿瘤药物筛选及其他试剂的细胞毒检测等方面，剂的细胞毒检测等方面，MTT法都有它的应法都有它的应用和研究价值。用和研究价值。
