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1、实验八、转基因生物的实验八、转基因生物的实验八、转基因生物的实验八、转基因生物的GUSGUS检测检测检测检测实验目的：实验目的：实验目的：实验目的：通过通过通过通过GUS(GUS(- - 葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶) )活性测定，活性测定，活性测定，活性测定，了解报告基因在基因工程中的应用。了解报告基因在基因工程中的应用。了解报告基因在基因工程中的应用。了解报告基因在基因工程中的应用。技术应用：技术应用：1. Gus基因与目的基因连接构建融合基因基因与目的基因连接构建融合基因进行组织定位；进行组织定位； 2. gus基因与启动子连接来研究启动子的表达的组织基因与启动子连接
2、来研究启动子的表达的组织特异性。特异性。要求：要求：了解通过显色反应检验外源基因的表达情况了解通过显色反应检验外源基因的表达情况的方法，了解报告基因的概念。的方法，了解报告基因的概念。材料：材料： 转化的植物组织、器官、原生质体、转化的植物组织、器官、原生质体、 种子的胚及萌发的幼苗等。种子的胚及萌发的幼苗等。 非转化的相同材料（阴性对照）。非转化的相同材料（阴性对照）。试剂试剂： 5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯（XGluc） ；N-N-二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton-100；
3、 K3 Fe(CN) 6 （铁氰化钾）；铁氰化钾）；K4 Fe(CN) 6 （亚铁氰化钾）亚铁氰化钾）原理原理 适宜的反应条件下，适宜的反应条件下，- 葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶（GUS）可将可将X XGlucGluc水解成蓝色物质，因水解成蓝色物质，因此具有此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。相关知识链接标记基因标记基因 标记基因是帮助对转基因生物体进行标记基因是帮助对转基因生物体进行筛选和鉴定的一类外源基因，包括筛选和鉴定的一类外源基因，包括选择标选择标记基因记基因和和报告基因报告基因。常用的常用
4、的选择标记基因选择标记基因包括有抗生素抗性基包括有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因（因和除草剂抗性基因（Bar 基因）。标记基因）。标记基因通常与目的基因构建在同一表达载体基因通常与目的基因构建在同一表达载体上，一起转入生物，但有时，标记基因本上，一起转入生物，但有时，标记基因本身就是目的基因，如除草剂抗性基因。身就是目的基因，如除草剂抗性基因。报告基因报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合
5、基因，或与其它目的基因相融相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。得到转化体。报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功能的研究实验中。能的研究实验中。报告基因必须具备的报告基因必须具备的条件条件(1)已被克隆和已被克隆和全序列全序列已测定已测定; (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被表达产物在受
6、体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物转染的细胞中无相似的内源性表达产物; (3) 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。(4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的 检测。检测。常见的报告基因：常见的报告基因：在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：以下几种： 常用的报告基因包括常用的报告基因包括葡萄糖苷酸酶报告基因葡萄糖苷酸酶报告基
7、因(gus), 胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶章鱼碱合成酶基因基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶新霉素磷酸转移酶(NPTll)、氯霉素氯霉素乙酰转移酶基因乙酰转移酶基因(cat)、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-gal，-galactosidase)、萤光素酶萤光素酶(luc，luciferase)、和和绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因(gfp，green fluorescence protein)等等. 利用报告基因表达载体的研究技术的利用报告基因表达载体的研究技术的优点优点：其一，避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告基其一，避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告
8、基因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响.第二，易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性，第二，易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性，采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容易解决这一问
9、题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。gus基因简介基因简介gusgus基因是目前常用的一种报告基因，是基因是目前常用的一种报告基因，是D D 葡葡萄糖苷酸酶萄糖苷酸酶( (gusgus) )基因，其表达产物基因，其表达产物-葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶 (GUS)(GUS)能催化裂解一系列的能催化裂解一系列的葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸 ，它可以，它可以将将5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-葡萄糖苷酸酯（葡萄糖苷酸酯（X XGlucGluc）分解为
10、蓝色的物质分解为蓝色的物质, ,也可以将也可以将4-4-甲基甲基- -伞形花酮伞形花酮-D-D-葡萄糖苷酯葡萄糖苷酯(4-MUG)(4-MUG)分解为蓝色物质。分解为蓝色物质。 其检测方法简其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。gusgus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。药品配方药品配方1 1）X XGlucGluc母液：母液：X-X-GlucGluc，用，用N-N-N-N-二甲基酰胺二甲基酰胺(DMF)(DM
11、F)配成配成20mM20mM的贮存液，分装成每管的贮存液，分装成每管100L100L，保保存于存于-20-20。2 2）X XGlucGluc基液（基液（50mM PBS50mM PBS， pH7.0pH7.0）。）。配制方法：配制方法：50mM NaH50mM NaH2 2POPO4 40.78g/100ml0.78g/100ml；50mM 50mM NaNa2 2HPOHPO4 4 1.79g/100ml 1.79g/100ml共同溶解；共同溶解； NaNa2 2EDTA EDTA （10mM10mM，372mg372mg），），Triton-100Triton-100（0.10.1，10
12、0l100l）, K, K3 3 Fe(CN) Fe(CN) 6 6 （铁氰化钾）（铁氰化钾）（0.5mM0.5mM，16.5mg16.5mg）K K4 4 Fe(CN) Fe(CN) 6 6 （亚铁氰化钾）（亚铁氰化钾）（0.5mM0.5mM，21.1mg21.1mg）染色液：染色液：50l X-50l X-GlucGluc母液母液450l450l基液基液染色方法染色方法将准备好的试材浸泡在染液，于将准备好的试材浸泡在染液，于25372537保温保温1 1小时至过夜。小时至过夜。叶片等绿色材料转入叶片等绿色材料转入70%70%乙醇中脱色乙醇中脱色2323次，至阴性对照材料呈白色。次，至阴性对照材料呈白色。肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为小点即为GusGus表达位点。表达位点。实验步骤实验步骤将准备好的拟南芥植株放入小将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；入染色液浸没试材，封好盖子；37培养箱中温育培养箱中温育1小时至过夜小时至过夜；将浸染过的试材转入将浸染过的试材转入70%或或95%乙醇中脱乙醇中脱色色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。呈白色为止。观察结果。观察结果。
