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1、微生物限度检查及效价检查技术微生物限度检查技术目录一、总则环境、要求二、微生物限度检查概述及限度标准三、微生物限度检查计数方法四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验五、供试品检查：检验量、供试品检查六、控制菌检查法一、总则环境：微生物计数试验在不低于GMP现行版要求的D级洁净环境、局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。要求：全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果
2、使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容二、微生物限度检查概述及限度标准1、微生物限度检查的范围（1）根据药品使用要求，把药品划为两大类：规定灭菌药品如注射剂、严重烧伤、眼科用药非规定灭菌药物：包括一般的口服固体制剂药物，这类药物允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有致病菌存在。（2）染菌量检查：需氧菌、霉菌酵母菌对药品的污染程度。（3）控制菌检查：大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（膏剂）二、微生物限度检查概述及限度标准2、微生物限度检查的意义药品染菌对使用者的潜在危害l药品中所含致病菌，这是造成药源性感染疾病的直接原因。l药品染菌还可使其产
3、生霉变、酸败等理化性质改变造成药品失效、变质，甚至产生毒素，危害使用者的健康。l为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。二、微生物限度检查概述及限度标准药品染菌反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。l微生物限度检查的各项数据，是对药品生产工艺、生产环境、质量管理及人员素质的综合评价依据之一。l只有优良的GMP企业，才能提供优质的医药产品，凡工艺条件、生产管理水平、生产人员素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品染菌必然严重，不合格率高。二、微生物限度检查概述及限度标准药品微生物限度检查的特殊性l活体细胞l分布不匀l多数处于受损状态l生境复杂二、微生物限度检查概述
4、及限度标准3、我国药典，根据药品使用的要求，将微生物限度标准分为两大类：l对于规定灭菌的药品，包括注射剂和输液剂，以及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。必须严格无菌，即在规定检验量的供检样品中不得检出活微生物。l对于非规定灭菌药品，包括常用的口服制剂与局部外用制剂。允许在规定量的样品中，检出一定限量的微生物，但不得检出某些控制菌。二、微生物限度检查概述及限度标准与药品质量密切相关的还有辅料、包装材料以及生产环境的检测和医用材料、器械等也都制定了相应的微生物学限度指标。三、染菌量检查计数方法供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测
5、充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。三、染菌量检查计数方法l平皿法、l薄膜过滤法、l最可能数法（MPN法）MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法所选方法的适用性须经确认。四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验l供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。l供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验l若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。四、计数培养基适用性
6、检查、供试品计数方法适用性试验1、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验菌液制备及使用菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验试验菌株试验菌液的制备金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基3035，1824小时铜绿假单胞菌CMCC（B)10104枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F)98001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，2025，23天黑曲霉CMCC(F)98
7、003沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ，2025，57天，或直接获得丰富孢子四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性计数培养基适用性检查需氧菌总数计数金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基3035不超过3天铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌胰酪大豆胨琼脂培养基3035不超过5天黑曲霉霉菌和酵母菌总数计数白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基2025不超过5天黑曲霉17四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性计数培养基适用性检查每一试验菌株平行制备2管或2个平皿；接种量不大于100cfu同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试结果判定：被检固体培养基上
8、的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性2、计数方法适用性试验供试液制备接种和稀释抗菌活性的去除与灭活供试品中微生物的回收平皿法薄膜过滤法最可能数法（MPN法）五、供试品检查：检验量、供试品检查检验量l检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm）。l除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜
9、剂还不得少于4片。l一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。五、供试品检查：检验量、供试品检查供试品检查l按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。l胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；l沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。l阴性对照试验：以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。五、供试品检查：检验量、供试品检查供试液制备l根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45。
10、供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。l制备方法：匀浆仪法利用匀浆仪高速旋转可将固体供试品快速研细，将油性基质的软膏或易吸水的胶囊剂制备成均匀的供试液。该法快捷、高效、均质、效果好，不易造成污染，为药典优选的方法。五、供试品检查：检验量、供试品检查l研磨法：利用研钵将固体供试品研细，将油性基质的软膏剂制备成均匀的供试液。本法劳动强度大，费时，开放式研磨，暴露时间长易造成污染l振荡法：将供试品及稀释剂置入灭菌锥形瓶内，置于振荡器上震荡，使固体供试品分散、均质。本法简便，但对水丸剂等坚硬的供试品效果欠佳，分散期长。五、供试品检查：检验量、供试品检查l供试液制备常用的供试液制备方法如下，如
11、果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。水溶性供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。五、供试品检查：检验量、供试品检查水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调
12、节供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。五、供试品检查：检验量、供试品检查油脂类供试品取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40（特殊情况下，最多不超过45），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成110供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。五、供试品检查：检验量、供试品检查供试品检查平皿法包括倾注法和涂布法。l每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。胰酪大豆胨琼脂培
13、养基平板在3035培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025培养5天，观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。五、供试品检查：检验量、供试品检查菌数报告规则l需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm供试品中所含的微生物数。五、供试品检查：检验量、供试品检查菌数报告规则l如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生
14、长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。五、供试品检查：检验量、供试品检查供试品检查薄膜过滤法l取相当于1g、1ml或10cm供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。l培养和计数培养条件和计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。五、供试品检查：检验量、供试品检查菌数报告规则l以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或1
15、0cm2供试品）,或1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。五、供试品检查：检验量、供试品检查MPN法（三步五管法）0.10.010.001每组5管五、供试品检查：检验量、供试品检查结果判断各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：l101cfu：可接受的最大菌数为20；l102cfu：可接受的最大菌数为200l103cfu：可接受的最大菌数为2000：依此类推。若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。六、控制菌检查法控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查，检查项目包括l促生
16、长能力l抑制能力l指示能力六、控制菌检查法控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰氏阴性菌【 15版 ： 新增】肠道菌增菌液体培养基促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力+指示特性大肠埃希菌大肠埃希菌麦康凯液体培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示特性大肠埃希菌六、控制菌检查法液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管
17、试验菌应生长良好。六、控制菌检查法培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。六、控制菌检查法培养基指示特性检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。六、控制菌检查法1、控制菌检查方法适用性试验试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃
18、希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。六、控制菌检查法结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。六、控制菌检查法供试品检查供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。六、控制菌检查法控制菌检查过程：l使用无选择性增菌培养基（胰酪大豆胨液体培养基）培养，使受损的细菌得到修复，提高检出率。l增菌培养-选择性增菌-选择性琼脂六、控制菌检查法大肠埃希菌：粪便污染指示菌供试液制备和增菌培养取供试品，制成1：10供试液。取相当于1g或1mL供试
19、品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。六、控制菌检查法选择和分离培养l取上述预培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养1872小时。结果判断：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验,确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。六、控制菌检查法沙门菌:肠菌科重要致病菌含药材原粉化学药和中药制剂及脏器提取物的口服制剂【10版：含
20、动物组织及动物类原药材粉的口服制剂】每10g或10ml不得检出沙门菌六、控制菌检查法供试液制备和增菌培养取10g或10mL供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，3035培养1824小时。选择和分离培养l取上述预培养物0.1mL接种至10mLRV沙门增菌液体培养基中，3035培养1824小时。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035培养1848小时。六、控制菌检查法沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂
21、培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。六、控制菌检查法结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验,确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色黑色，判供试品未检出沙门菌。补充知识点温育的时候,培养基的水分要蒸发,形成水珠,如果正放的话水珠集聚在培养基平面上会影响菌落的生长,所以要保证培养基的干燥,就得倒置培养.还有就是便于拿取,
22、大下小上,也防止外物掉在培养基上.灭菌后的pH会比灭菌前的pH降低,一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右,灭菌后基本合适.为什么要倒置培养？校正酸碱度（调节pH）补充知识点常用玻璃仪器及用具清洁方法1.新购玻璃仪器：流水冲洗，浸泡于1%2%盐酸中约2小时，除去游离碱。2.未被病原微生物污染的器皿：随时用清水冲洗。3.被微生物污染的器皿：必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定的地方，便于取用。4.培养基使用后正确的做法是倒置在统一的容器中，还需要在灭菌锅中灭菌后，确保培养基中的菌落死后，再倒入
23、废弃桶中。补充知识点灭菌方法：湿热灭菌法、干热灭菌法辐射灭菌法干热灭菌法：是将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。验证用的生物指示剂枯草芽孢杆菌孢子。补充知识点干热灭菌柜效价检查技术目录1.概述2.基本原理3.菌液制备4.基本操作及注意事项5.操作要点6.检定的影响因素1、概述抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素效价的测定已被化学方法所替代，但由于以下原因，抗生素微生物检定法，目前在各国药典中仍占有重要地位。1.微生物检定法可直观、特异的反应出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的
24、特点。2.多组分抗生素由于不同组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分、组成、含量和活性的关系。3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。4.同时微生物法所需的仪器设备简单，成本低。在中国药典2010年版二部附录抗生素微生物检定法及2015版药典中，详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素效价的方法，根据公司生产及检测情况，主要是四环素片，采用抗生素管碟法测效价来计算含量，因此，此章主要介绍管碟法。抗菌活性抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性通常用效价来表示。在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地反应抗生素的医疗价值。如：红霉素798单位
25、/毫克四环素2.基本原理2010版药典二部附录及2015版药典，在适宜条件下，根据量反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，测定供试品的效价。3.抑菌圈的形成两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和
26、标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典生物检定统计法）根据中国药典2015年版要求，四环素片测效价，选取藤黄微球菌作为试验菌。取藤黄微球菌CCMCC(B)28001的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在3537培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65加热30分钟，备用。流程图冻干菌粉营养肉汤半固体琼脂斜面制菌悬液穿刺管（保藏及传代用）备注：每经过一次培养箱培养，菌的代数就增加一代。参考：药品微生物学检验技术主编：苏德模马绪荣2007年出版（复活）1.复活从菌种保藏机构购回的标准菌株，是冷冻干
27、燥粉，需经过复活。（冻干菌种为第0代）无菌操作，将冷冻干燥菌种安瓿用75%乙醇消毒后，用砂轮在安瓿颈部刻线，用无菌纱布掰开，或灼热安瓿顶部，立即作灭菌湿纱布盖住顶部，安瓿顶部便骤然裂开，小心移去玻璃碎片，用一无菌毛细管吸取0.5-1ml适宜的液体培养基，直插安瓿底部，挤出营养肉汤培养基，在底部振摇使菌粉溶解，再将安瓿内菌液吸出，接种至营养肉汤培养基。35-37度培养18-24小时。（此为第一代）制保藏菌株将营养肉汤培养物，用接种针沾取菌苔（菌液），沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中，同样温度35-37度，培养18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作为保藏及传代用的菌株。3.
28、制工作用菌悬液试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml普通琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。将已接种的三角瓶置3537的培养箱中培养710天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml洗下芽孢，制成悬液，在65水浴中加热30分钟，即得。置5冰箱中保存。4.基本操作及注意事项管碟法的操作步骤预试验试验准备双碟的制备供试品、标准品溶液的制备菌层的制备放置小钢管滴加抗生素溶液双碟的培养抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定预试验确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素浓度、培养基等，使抑菌
29、圈的大小符合规定，即二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在1822mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在1518mm.高低剂量之比为2:1.实验准备：双碟、钢管、滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml,待培养基凝固后,将双碟放入3537培养箱
30、中,待用.试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注6080的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤,平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液.依公司产品，四环素片，采用的是二剂量法，试验中，制成高、低浓度的溶液。菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量,注意制备菌层的速度和平整度.放
31、置小钢管放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,保证滴加速度和加量的均匀一致.滴加抗生素要按照SHTHSLTL（二剂量法）的顺序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液体
32、冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由于滴管内抗生素溶液往往会有气泡或者滴管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦滴管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，滴管管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。SL标品的低浓度TL样品的低浓度SH标品的高浓度TH样品的高浓度采用抑菌圈自动测量分析仪ZY-300IV型，自动扫描出抑菌圈，测出直径并计算出产品效价。结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果.如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。除另有规定外，本法的可信限率不得大于
33、5%。5.操作要点1）.试验菌需新鲜培养，传代最好不超过5次,以防止菌种老化变异.芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后,应在65加热30分钟,使菌体的菌龄一致,用革兰氏染色,应有芽孢85%以上.2）.加入菌悬液的体积,一般不少于0.3ml,并且不大于上层培养基体积的2%.3）.放置孵箱培养时排放应不得超过三层,避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一.4）在制备菌层培养基时,将菌液加入菌层培养基后,立即充分摇匀,但应避免产生气泡.5）标准品与供试品溶液浓度的比值应控制在2%以内，以保证两者的浓度偏差在一定的范围内。6）培养基的PH值对试验结果影响很大，使用时培养基的PH值应调节到适合该品种试验
34、的最佳范围如抑菌圈清晰，当圈偏小时，可考虑把培养基的PH值调高至8.0.6.检定因素影响：1）试验仪器的影响：电子分析天平至少达到万分之一，标准品的称量应不少于20mg，样品的称量一般应不少于50mg。培养皿应底部水平、内部直径一致；钢管应内外径一致，两端光滑平整。如培养皿内径不一样、底部不平，培养基菌就会厚薄不一致，直接影响了抑菌圈的直径；钢管内外径不一致、两端不平整，抗生素的扩散系数受到影响，最终影响试验结果的可信程度。2）试验菌的影响：保藏的第2代菌种进行转种使用，传代至第4代为止，这样能保证试验菌种的质量，使抑菌圈更清晰。新配制的菌悬液，正式试验前应先进行预试验，在上层培养基中分别加入
35、不同浓度的菌悬液，以能使溶液高浓度所致的抑菌圈直径在1822mm，如果所生成的抑菌圈大小不符合要求，应调整上层培养基菌悬液的加入量。3）培养基的影响培养基成分与试验菌的生长关系非常密切，能影响抑菌圈的直径大小及边缘的清晰。作为一种赋形剂，凝固的快慢影响菌层的摊布。缓冲液pH值与培养基pH值愈接近愈好。用磷酸盐缓冲液稀释链霉素，pH值愈低，抑菌圈愈小4）抗生素标准品和供试品同质的要求效价测定设计是假定二者剂量反应直线是相互平行的。如不平行即斜率不等，那么计算结果就必然发生较大的误差。如果标准品或供试品中含有其他抗菌活性物质，均可使二者剂量反应不平行。5）应注意的问题：测定试验室内防止抗生素的污染。即使有微量的抗生素污染，往往使结果混乱。微量的抗生素还可以附着在尘埃上，随空气的散落在培养基平板、钢管、钢管放置器上，使抑菌圈破裂。在配置培养基时或缓冲液时，也应严防被抗生素污染。6）点样顺序的要求:二剂量法中标准品和供试品高低浓度交替呈“Z”字型顺序滴加。这样可以减小各组间抗生素扩散时间及试验菌生长时间的差异。枯草杆菌在室温较高时影响更为明显。谢谢
