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1、第二十章第二十章 细胞生长调节因子与组细胞生长调节因子与组织制剂织制剂第一节 细胞生长调节因子的概述一、细胞生长调节因子的概念一、细胞生长调节因子的概念 细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。 细胞生长因子常称为生长因子，实际上应包细胞生长因子常称为生长因子，实际上应包括负性细胞生长因子，即细胞生长抑制因子，因括负性细胞生长因子，即细胞生长抑制因子，因此以细胞生长调节因子来表达广义的细胞生长因此以细胞生长调节因子来表达广义的细胞生长因子。子。 二、细胞因子的共同特性共同的特
2、征 ：1、绝大多数细胞因子是低分子量（1530kD）的蛋白或糖蛋白。 2、细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。 3、一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子三 细胞因子的分类和生物学活性 细胞因子的种类 细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子六类。 白细胞介素（IL）最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子，后来发现白细胞介素可由其他细胞产生，也可作用于其他细胞。 干扰素（干扰素（干扰素（干扰素（IFNIFN）是是最先发现的细胞因子最先发现的细胞因子最先发现的细胞因子最先发现的细胞因子，
3、因其具有干扰病，因其具有干扰病毒毒感染和复制感染和复制感染和复制感染和复制的能力的能力故称干扰素故称干扰素故称干扰素故称干扰素。根据来源和理化性质，。根据来源和理化性质，可将干扰素分为可将干扰素分为 、 和和和和 三种类型三种类型三种类型三种类型。IFN-IFN- 主要由主要由白细白细白细白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，也称为，也称为 型型型型干扰素干扰素干扰素干扰素。IFN-IFN-主要由活化主要由活化主要由活化主要由活化T T细胞和细胞和细胞和细胞和NKNK细胞产生
4、细胞产生细胞产生细胞产生，也称为，也称为型干扰素型干扰素型干扰素型干扰素。 肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TNFTNF）一种能使肿瘤发生出血坏死的）一种能使肿瘤发生出血坏死的）一种能使肿瘤发生出血坏死的）一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。物质。物质。物质。肿瘤坏死因子分为肿瘤坏死因子分为TNF-TNF-和和和和TNF-TNF-两种两种两种两种，前者主要，前者主要由由活化的单核活化的单核活化的单核活化的单核- -巨噬细胞巨噬细胞巨噬细胞巨噬细胞产生，抗原刺激的产生，抗原刺激的T T细胞、活化的细胞、活化的NKNK细胞和肥大细胞也分泌细胞和肥大细胞也分泌TNF-TNF-。T
5、NF- TNF- 主要由活化的主要由活化的主要由活化的主要由活化的T T细胞细胞细胞细胞产生，又称产生，又称淋巴毒素淋巴毒素淋巴毒素淋巴毒素。 集落刺激因子（集落刺激因子（CSFCSF）是指能够刺激多能造血干细胞和不同）是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。养基中形成相应细胞集落的细胞因子。 生长因子（生长因子（GFGF）是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。）是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。多种未以生长因子命名的细胞因子也具有刺激细胞生长的多种未以生长因子命名的细胞因
6、子也具有刺激细胞生长的作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子，如作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子，如IL-2IL-2是是T T细胞的生长因子，细胞的生长因子，TNFTNF是成纤维细胞的生长因子。有些生是成纤维细胞的生长因子。有些生长因子在一定条件下也可表现对免疫应答的抑制活性，如长因子在一定条件下也可表现对免疫应答的抑制活性，如TGFTGF可抑制细胞毒性可抑制细胞毒性T T淋巴细胞（淋巴细胞（CTLCTL）的成熟及巨噬细）的成熟及巨噬细胞的激活。胞的激活。 趋化性细胞因子是一个蛋白质家族，由十余种结构趋化性细胞因子是一个蛋白质家族，由十余种结构有较大同源性、分子量多为有较大同源性、分子量
7、多为8 810kD10kD的蛋白组成。的蛋白组成。 趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。 淋巴细胞趋化蛋白，对淋巴细胞有趋化作用淋巴细胞趋化蛋白，对淋巴细胞有趋化作用 。 二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定二、细胞
8、生长调节因子的一般制备方法与活性测定 （）一般制备方法（）一般制备方法（）一般制备方法（）一般制备方法 细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低，主细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低，主要是通过要是通过组织培养组织培养组织培养组织培养获得。获得。 动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养 1 1、基本概念、基本概念、基本概念、基本概念 体外培养体外培养体外培养体外培养就是将活的就是将活的生物体结构成分生物体结构成分生物体结构成分生物体结构成分或者活的或者活的微微微微小个体小个体小个体小个体放到体外环境中让共放到体外环境中让共生存和生长生存和生长生存和生长生存和生长的技术。的技术。 部
9、分培养部分培养部分培养部分培养所培养的生物成分无外乎有两种结构形所培养的生物成分无外乎有两种结构形式，其一是小块组织或称为式，其一是小块组织或称为组织块组织块组织块组织块，其二是将生物组，其二是将生物组织分散后制成的织分散后制成的单个细胞单个细胞单个细胞单个细胞。体外培养分为体外培养分为原代培养原代培养原代培养原代培养和和继代培养继代培养继代培养继代培养两大类。两大类。体外培养可分为植块培养法和分离（散）细胞培养法两大类方法。前者就是将植块直接进行培养，使之在体外条件下存活和生长；而后者就是将细胞悬液用于培养，使分散的细胞在体外条件下存活和生长。体外培养的结果无外乎有两种，一是维持生存，一是发
10、生显著增长。 动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，而且已不是靠一个细胞包办一切生理活动，各种细胞都有明确的分工。为了适应其功能的需要，细胞的形态也有了相应的变化，我们称这种变化为分化（或称特化）。我们通常将离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型和贴壁非依赖型，前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。2）生理特点）生理特点 细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象象 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 动动物细胞对周围环境十分敏感物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对培养动物细胞对培养基的要求高基的要求高
11、动物细胞培养基大致可以分成动物细胞培养基大致可以分成3 3类：类： 天然培养基天然培养基 在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。羊水、腹水等。 合成培养基合成培养基 成分明确的化学试剂配制而成成分明确的化学试剂配制而成 。单纯采用这种。单纯采用这种合成培养基，细胞常常仍不能很好地增殖，甚至细合成培养基，细胞常常仍不能很好地增殖，甚至细胞都不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量胞都不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量的动物血清，最常用的是添加的
12、动物血清，最常用的是添加5 510%10%的小牛血清。的小牛血清。在杂交瘤细胞的培养中，血清的要求更高，常需用在杂交瘤细胞的培养中，血清的要求更高，常需用10%10%2020的胎牛血清。的胎牛血清。 无血清培养基无血清培养基 动物细胞蛋白修饰功能与细菌不同动物细胞蛋白修饰功能与细菌不同 动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行。在游离核糖体上合成的蛋白糙面内质网上结合的核糖体上进行。在游离核糖体上合成的蛋白质都用于细胞质基质内，而在与膜结合的核糖体上合成的蛋白质质都用于细胞质基质内，而在与膜结合的
13、核糖体上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，它们多数为糖蛋白。这些寡糖链，是分泌性的和膜中的整合蛋白，它们多数为糖蛋白。这些寡糖链，有的在内质网中加接，有的在高尔基体内加接。在内质网中加接有的在内质网中加接，有的在高尔基体内加接。在内质网中加接的是的是N-N-链寡糖，在高尔基体内加接的是链寡糖，在高尔基体内加接的是O-O-链寡糖，蛋白质的糖基链寡糖，蛋白质的糖基化与细胞的许多生理功能密切相关，如细胞识别、表面受体、胞化与细胞的许多生理功能密切相关，如细胞识别、表面受体、胞内消化和外排分泌物等。原核生物由于缺少糙面内质网结构，因内消化和外排分泌物等。原核生物由于缺少糙面内质网结构，因此无法对
14、蛋白质迸行糖基化和其他一系列翻译后修饰。此无法对蛋白质迸行糖基化和其他一系列翻译后修饰。 综观动物细胞的上述综观动物细胞的上述6 6点生理特点，不难想象，与采用原核细胞点生理特点，不难想象，与采用原核细胞相比，采用动物细胞作为宿主细胞生产药品，有它不足的一面，相比，采用动物细胞作为宿主细胞生产药品，有它不足的一面，如培养条件要求高、成本贵，产量低等；但也有它优越的一面，如培养条件要求高、成本贵，产量低等；但也有它优越的一面，即它们多半是分泌在胞外的，收集纯化方便；得到了较完善的翻即它们多半是分泌在胞外的，收集纯化方便；得到了较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此更与天然的产品一致，更适于临译后
15、修饰，特别是糖基化，因此更与天然的产品一致，更适于临床使用。床使用。3 3、生产用动物细胞的要求、生产用动物细胞的要求（1 1）、什么样的细胞允许用以生产人用的药品）、什么样的细胞允许用以生产人用的药品 。正常组织分离的原代细胞正常组织分离的原代细胞 只要是二倍体细胞，二倍体细胞的寿命一般都不会只要是二倍体细胞，二倍体细胞的寿命一般都不会超过超过5050代。代。取消了对传代细胞使用的限制取消了对传代细胞使用的限制 （2 2）、用于生产的动物细胞不外乎）、用于生产的动物细胞不外乎3 3类类 原代细胞原代细胞原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消
16、化而获得的细胞悬液。消化而获得的细胞悬液。 二倍体细胞系二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 转化细胞系转化细胞系 这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。得了无限增殖的能力。 这种转化过程可以是自发的，即正常细胞在传代培养过这种转化过程可以是自发的，即
17、正常细胞在传代培养过程中，大部分细胞随着传代次数的增加，寿命逐渐终结，程中，大部分细胞随着传代次数的增加，寿命逐渐终结，但其中有个别细胞可自发地转化而形成有无限生命力的细但其中有个别细胞可自发地转化而形成有无限生命力的细胞系。胞系。 此外，直接从动物的肿瘤组织中建立的细胞系也是转化的细胞。由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要4 4、基因工程细胞的构建和筛选、基因工程细胞的构建和筛选 尽管上述的原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者尽管上述的原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者都已被用于生产中，但在生产中采用更多的、
18、更有前景的都已被用于生产中，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。 （1 1）、真核细胞基因表达载体的构建）、真核细胞基因表达载体的构建 为了要将外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将为了要将外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在一个高效表达载体内。目前一般使用的载体有两其构建在一个高效表达载体内。目前一般使用的载体有两类：类：一类是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状一类是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状病毒等。病毒等。 另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌
19、和另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。哺乳动物细胞两者体内都能扩增。（2 2）、基因载体的导人和高效表达工程细胞株的筛选）、基因载体的导人和高效表达工程细胞株的筛选载体构建后，如何导人动物细胞呢？目前的方法大致可分为载体构建后，如何导人动物细胞呢？目前的方法大致可分为4 4类类 ： 融合法融合法 化学法化学法 物理法物理法 病毒法病毒法 细胞融合法细胞融合法 DNA-DNA-磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 电穿孔法电穿孔法 重组逆转重组逆转录病毒介导法录病毒介导法脂质体介导法脂质体介导法 DEAEDEAE一葡聚糖法一葡聚糖法 显微注射法显微注射法 重组洲
20、重组洲A A病病毒介导法毒介导法原生质融合法原生质融合法 染色体介导法染色体介导法 基因枪法基因枪法 多瘤病多瘤病毒样颗粒介导法毒样颗粒介导法微细胞介导法微细胞介导法鬼影红细胞介导法鬼影红细胞介导法 外源基因导入动物细胞的效率是很低的，依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统 ，从上百万个细胞中筛选出已整合并表达外源基因的工程细胞 。FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库和生产用细胞库。5 5、动物细胞的培养条件、动物细胞的培养条件 （1 1）所有的与细胞接触的设备、器材和溶液，都必）所有的与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。须保
21、持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。（2 2）必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物）必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入。质，避免即使是极微量的有害离子的掺入。（3 3）保证有适量的氧气供应。）保证有适量的氧气供应。（4 4）需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。）需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。（5 5）有良好的适于生存的外界环境，包括）有良好的适于生存的外界环境，包括pHpH、渗、渗透压和离子浓度等。透压和离子浓度等。（6 6）及时分种，保持合适的细胞密度。）及时分种，保持合适的细胞密度。6 6、动物细胞大规模培养的方法、动物细胞大规模培养的方
22、法 动物细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种动物细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种类分为原代细胞培养和传代细胞培养。类分为原代细胞培养和传代细胞培养。又可根据培养基的不同分为液体培养和固体培养。又可根据培养基的不同分为液体培养和固体培养。 还可根据培养容器和方式的不同分为静止培养、还可根据培养容器和方式的不同分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养等。固定床或流化床培养等。 但从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可但从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁分为悬浮培养、贴壁培
23、养和贴壁- -悬浮培养。悬浮培养。 1 1、悬浮培养、悬浮培养 所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。生长增殖。 2 2、贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培、贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贝占壁细胞），养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贝占壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点与悬浮培养正也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用好相反，优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采
24、用灌流培养的的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度方式使细胞达到高密度 。3 3、贴壁一悬浮培养，或称假悬浮培养、贴壁一悬浮培养，或称假悬浮培养 （1 1）微载体培养）微载体培养 （2 2）包埋和微囊培养）包埋和微囊培养 动物细胞生物反应器1、搅拌罐式生物反应器2、气升式生物反应器3、中空纤维式生物反应器4、透析袋或膜式生物反应器5、固定床或流化床生物反应器植植物物组组织织和和细细胞胞培培养养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。植植物物细细胞胞培培养养一、基本概念一、基本概念1、植物
25、组织和细胞培养、植物组织和细胞培养幼苗及较大植株的培养，即为“植物培养植物培养”；从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做“愈伤组织培养愈伤组织培养”；植物无菌培养技术分如下几类：植物无菌培养技术分如下几类：能够保持较好分散性的离体细胞离体细胞或较小细胞团较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养悬浮培养”；离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基原基或未成熟的花器官未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为“器官培养器官培养”未成熟或成熟的胚胎未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则为“胚胎培养胚胎培养”。悬悬浮浮培培养养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞
26、聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。2 2、悬浮培养悬浮培养3、细胞培养、细胞培养分生组织培养分生组织培养又称生长锥培养生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区圆锥区，其长度不超过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括12个叶原基。4、分生组织培养、分生组织培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增增殖殖及及分分化化。其目的是为了得到单单细细胞胞无无性性繁繁殖殖系系。5、外植体、外植体外外植植体体是指用于植物组织（细胞）培养的器官
27、或组织（的切切段段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。6、器官形成、器官形成器官形成器官形成一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成分化与形成。或者在先形成的小根基小根基部迅速形成愈伤组织部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽形成芽；或者在不同部位分别形成芽和根芽和根之后，再形成维管组织维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株小植株。如果在培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极极为为近近似似时，通常称为“胚胚胎胎形形成成”。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的单单倍倍体体细细胞胞，其所形成的胚胎结构叫做
28、“胚胚状状体体”（或“不定胚”）。7、无性繁殖系无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克克隆隆，是指使用母体培养物反复进行继继代代培培养养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根根无无性性系系、组组织织无无性性系系、悬悬浮浮培培养养物物无无性性系系等。在上述无无性性系系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选选择择培培养养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体无性系的变异体”8、突变体突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突突变变体体。由单细胞形成的无性系称为
29、“单单细细胞胞无无性性系系”；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单单细胞变异体细胞变异体”。9、继代培养、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继继代代培培养养”，又称“连连续续培培养养”。但习惯上“连续培养”一词多用于不断加人新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。二、植物细胞的结构特征植物细胞由细细胞胞壁壁和和原原生生质质体体两部分组成。原生质体包括细胞质、细胞核和液泡。细胞质和细胞核组成原生质。后含物常存在于细胞质和液泡中。与动物细胞与微生物细胞相比，植物细胞有3个特点，即具有
30、细细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）胞壁、液泡和质体（如叶绿体）通常要采用化学或机械的方法加以控制。植物细胞培养的基本技术植物细胞培养的基本技术、植物材料的准备、植物材料的准备用于植物组织培养的外外植植体体，必须是无杂菌材料。如果不是取自种种子子库库，而是来自温室或生长在大田植物的种子、幼苗、器官、组织等，因此培养前必须对外植体进行严格的灭菌处理灭菌处理。原原则则上上应尽可能选择那些灭灭菌菌后后易易于于除除去去或或容容易易分分解解的的试试剂剂。灭菌剂的选选择择和和处处理理时时间间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。二、培养基及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤”，其特点是营
31、养成分的可调控性。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。1、无机盐2、碳源植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此，人们经常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所谓光自养培养物光自养培养物。3、植物生长调节剂、植物生长调节剂植物激素植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度时即能调节植物的生育过程，并能从合成能从合成部位转运到作用部位而发挥作用部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前为止，已发现植物组织中可以
32、形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。脱落酸和乙烯。4、有机氮源、有机氮源5、维生素、维生素三、培养方法三、培养方法植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质原生质体培养和单倍体细胞培养体培养和单倍体细胞培养；按培养基类型可分为固固体培养和液体培养体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培悬浮细胞培养和固定化细胞培养养和固定化细胞培养。所谓固体培养固体培养系统实际上包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养。固体培养的特点是简便易行简便易行、所占空间小空间小。但也有一些缺点缺点：外植体或其愈伤组织仅有一部分与培养基相接触，该部位的营养物质可被
33、迅速吸收，从而形成培养基中营养物质的浓度差，并进而导致愈伤组织生长的不平衡；由于外植体的基部插人固体培养基中，因此该处呈现气体交换不畅气体交换不畅的状态，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的有害物质有害物质；在静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部或一侧射人，因而在愈伤组织细胞间出现了极化现象极化现象，结果导致细胞群体的不均匀状态。固体培养物有时需要测定一些生理生化指标。常用的固化剂固化剂有琼脂、藻酸盐琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖角叉藻聚糖、明胶明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。外植体在培养3周左右周左右必须移换至新鲜培养基上
34、，以保持培养物的继续正常生长。移换一次培养基称一次继代培养继代培养。一种外植体经过一定次数一定次数的继代培养，其培养物就可用于悬浮培养悬浮培养。由于外植体诱导形成的愈伤组织开始比较紧密坚实，所以需要经过较长时间的多次继代培养后，愈伤组织变得较为疏松愈伤组织变得较为疏松时才能进行悬浮培养。液体培养系统包括小规模的悬浮培养悬浮培养和大规模的成成批培养批培养、半连续和连续培养连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和静止和振荡振荡两类。静止液体培养具有简便易行的特点，而且培养基还不会出现营养物质浓度差的现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振（转）动下进行培养。1、成批培养法、成批培养法将
35、培养基一次性加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期稳定期，人们基于此原理设计了植物细胞的两步培养法两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产生产。2、半连续培养法、半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培半连续培养法。养法。3、连续培养法、连续培养法连续培养法是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生
36、长环境长期维持恒定的方法维持恒定的方法。4、固定化培养法、固定化培养法植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，表明细胞成成块块而而趋趋于于分分化化时，细胞块中各个细胞处于一定理理化化梯梯度度之下，此现象与完整植株类似，由此人们提出了植物细胞固定化培养技术。细胞位置固定，易于获得高高密密度度细细胞胞群群体体及维持细胞间的物物理理化化学学梯梯度度，利利于于细细胞胞组组织织化化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物次级代谢产物。细胞生长过程可归纳为细胞生长过程可归纳为：生长细胞体积倍增，可制备同步化的细胞。生长细胞复制DNA，也有蛋白质的含量变化。制备中应特别注意以下几点制备中应特别注意以下几点
37、：（1）生产中必须保证生产条件的一致性，以免影响质量。（2）使用转化细胞系（特别是肿瘤原性细胞系）作为制备细胞因子的基质，应使用严格的纯化手段，以去除可能引起安全性问题的污染物。（3）在外来宿主中表达的天然的基因编码的细胞因子，其结构、生物学或免疫学性质可能与天然的细胞因子不同。（4）生长程序中可能带来有害的中间产物，如内毒素、表达产物中潜在的致癌性DNA。（5）制定生产规程应详尽介绍细胞系、添加物（如诱生剂）、增强对或其他物质（如抗生素）等的特性。二、测定方法二、测定方法分离纯化后的细胞生长调节因子，常用放射免疫法直接测定，但其活活性性和细细胞胞生生物物学学作作用用机机制制方面的研究仍采用细
38、胞培养测定活性细胞培养测定活性。测定中注意以下几点：（1）必须根据因子的作用特性，掌握其生长需求条件，排除细细胞胞代代谢谢产产物物的影响，若出现生生长长抑抑制制的现象，可增加或更换新鲜培养液更换新鲜培养液。（2）选择适宜的细胞培养系统和敏感的靶细胞。（3）作用效应指标的选择。（4）必须采取特异性生物学试验来评价其活性。（5）应测定比活性比活性，并有高纯度的参照品。三、重要的细胞生长因三、重要的细胞生长因子子1、结构和性质、结构和性质人促红细胞生成素（hEPO）是由166个或基酸残基组成的糖蛋白激素。其分子量为21.3KD，水解并除去27个疏水氨基酸肽段后得到分子量18.4KD的激素。基因工程生
39、产的hEPO分子量为23KD，比天然产物大，说明有少量低聚糖化。4、作用与用途、作用与用途促红细胞生成素主要由肾脏分泌，也可由巨噬细胞或其他细胞产生，具有刺激活体内增生红细胞的功能。（二）表皮细胞生长因子二）表皮细胞生长因子1962年从中提取出一种多肽能直接刺激表皮的生长和角化，故命名为表皮生长因子。hEGF分子量为6.2KD,等电点pH4.5。表表皮皮生生长长因因子子4、作用与用途、作用与用途EGF能促进细胞的增殖;实验证明EGF对体外培养的细胞的增殖刺激作用增殖刺激作用不限于上皮细胞，其作用是广谱广谱的。的。（三）抑素（三）抑素专指组织特异性的抗分裂素物质抗分裂素物质。定义为一种由机体内某
40、种组织产生并通过抑制有丝分裂作用抑制有丝分裂作用来控制该组织生长的物质。抑素抑素是一组与核酸或多糖有关的生物活性蛋白质或生物活性蛋白质或多肽多肽，其抑裂活性具组织特异性组织特异性而无种属特异性无种属特异性，也无细胞毒作用无细胞毒作用。可望在治疗肿瘤或免疫排斥等方面发挥作用。第二节第二节组织制剂组织制剂一、组织制剂组织制剂系指采用动物的组织、器官、腺体等提取得到的具有生理作用的混合制剂。该制剂所含成分未经纯化成单一组分，常常含有多肽、激素、核梭类物质、多糖及少量蛋白质等多种成分，组成较为复杂。二、组织制剂的一般制备方法二、组织制剂的一般制备方法该类制剂的一般制备程序是：（1）将组织、器官、腺体等原料粉碎。（2）采用亲水性溶剂将其有生物作用的物质提取出来。（3）依据蛋白质的特点，采用适当的分离手段如等等电电点点沉沉淀淀、盐盐析析、有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀、吸吸咐咐、离离子子交交换换、超滤等超滤等除去非有效成分，特别是异种蛋白。（4）提取物经浓缩或冷冻干燥成半成品（5）将半成品再配制成适宜的剂型。三、组织制剂的生理活性和临床应用三、组织制剂的生理活性和临床应用传统的中医中药结合现代提取、分离手段，则形成为当今的动物组织提取制剂，井在临床应用中占有一席之地。
