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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离分离与与计数计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用：、尿素的利用： 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成 之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因：、细菌利用尿素的原因：土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成 。CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+ H+ H2 2O O氨氨脲酶脲酶3 3、反应式：、反应式
2、：加入酚红指示剂？加入酚红指示剂？一一. .研究思路研究思路筛选菌株筛选菌株统计菌落数目统计菌落数目设置对照设置对照1 1、实例：、实例：TaqTaq酶是什么？如何筛选出来的？对筛选菌株有什么启示酶是什么？如何筛选出来的？对筛选菌株有什么启示？筛选菌株筛选菌株2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于 生长的条件生长的条件( (包括营养、包括营养、温度、温度、pHpH等等) )，同时，同时 其他微生物生长。其他微生物生长。什么是选择培养基？什么是选择培养基？目的菌株目的菌株抑制或阻止抑制或阻止15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素1
3、0.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素氮源：尿素此培养基选择分解尿素的微生物的原理此培养基选择分解尿素的微生物的原理怎样证明此培养基具有选择性呢？怎样证明此培养基具有选择
4、性呢？1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。个体小的细菌在显微镜下难以观察。缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单
5、细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的的平板上进行计数。平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三为使结果
6、接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的培养皿中，经涂布培养，计算出菌落个以上的培养皿中，经涂布培养，计算出菌落 。统计的菌落数往往比活菌的实际数统计的菌落数往往比活菌的实际数 。30300平均数平均数低低 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约
7、150150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。（1 1）土样不同土样不同（2 2）培养基被杂菌污染）培养基被杂菌污染（3 3）混入了其他的含氮物质）混入了其他的含氮物质如何确定原因到底是什么？如何确定原因到底是什么？二二. .实验的具体操作实验的具体操作 土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前
8、取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要都要 。制备培养基制备培养基制备制备 的选择培养基。的选择培养基。灭菌灭菌以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行（三）样品的稀释（三）样品的稀释（四）取样涂布（四）取样涂布（五）微生物的培养与观察（五）微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培
9、养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。五五. .课外延伸课外延伸测定饮水中大肠杆菌数量：测定饮水中大肠杆菌数量： 将一定体积的饮水用细菌过滤器过滤后，将滤将一定体积的饮水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到膜放到 培养基上培养，大肠杆菌菌落培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现呈现 色，可以根据此颜色的菌落数，计算出水色，可以根据此颜色的菌落数，计算出水样中的样中的 数量。数量。伊红美蓝伊红美蓝黑黑大肠杆菌大肠杆菌四、操作提示四、操作提示 三三. .结果分析与评价结果分析与评价
