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1、免疫组免疫组化技术简介及相关化技术简介及相关临临床应用床应用朱胜章黔南州人民医院病理科提提 纲纲 1、背景知识简介背景知识简介2、定义定义及基本原理及基本原理3、所用抗体及标本类型所用抗体及标本类型4、常用染色方法常用染色方法5、操作操作步骤及结果判断步骤及结果判断6、临床应用、临床应用7、相关图片、相关图片 7、开展该项目注意事项开展该项目注意事项背景知识简介l l 免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上,以免疫学的抗原抗体反应为理论基础发展起来的一门方法学。l l 20世纪80年代该项技术在国外开始应用于诊断疾病，国内比国外约晚10年，即90年代开始运用于
2、疾病的病理诊断。l l 最近最近2020多年来，该项技术得到飞速发展，特多年来，该项技术得到飞速发展，特别是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的石别是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的石蜡切片上，因而大大促进了它在临床病理学上的蜡切片上，因而大大促进了它在临床病理学上的应用。应用。l l 从开始发展至今，该项技术一直在基础医学从开始发展至今，该项技术一直在基础医学和临床研究中发挥重要作用和临床研究中发挥重要作用, ,为疾病尤其是肿瘤性为疾病尤其是肿瘤性疾病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了疾病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。强有力的手段。l l 目前绝大多数大中型医院
3、都开展了该项技术目前绝大多数大中型医院都开展了该项技术检查，我院有待开展此项技术。检查，我院有待开展此项技术。定义及基本原理定义及基本原理 定义：定义： 免疫组化，也称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。 基本原理基本原理： 抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗
4、体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。然后再通过化学显色方法将抗原抗体结合所在的部位显示出 来，从而达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。 有如下基本特点： 1、特异性强 2、敏感性高 3、定位准确 4、形态与功能相结合 所用抗体及标本类型所用抗体及标本类型l l所用抗体类型 常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。l所用标本类型：所用标本类型： 主要为组织标本和细胞标本两大类，主要为组织标本和
5、细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾染色对照观察；还能长期存档，供回顾 性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化
6、中首选的组织标本制作复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。方法。常用染色方法常用染色方法l l 免疫组织化学技术按照标记物的种类不同可分为： 1，免疫荧光法，标记物为荧光素，通过荧光显微镜观察； 2，免疫酶法，以酶标记抗体，抗原抗体反应后显色，通过光镜或电镜观察，目前最常用； 3，其它如亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等。操作步骤l l流程简介如下： 常规石蜡切片脱蜡抗原修复（根据需要）缓冲液冲洗（3min/2次）室温下孵育5min缓冲液冲洗（5min/2次）室温下孵育5min 缓冲液冲洗（5min/2次）滴加一抗37孵育1-2小时缓冲液冲洗（5min/2次）室温
7、下孵育30分钟滴加二抗室温下孵育1小时缓冲液冲洗（5min/2次）滴加DAB液孵育3-5分钟自来水充分冲洗复染脱水透明封片出诊断。结果判断（表达部位、检测物质及常用标记物表达部位、检测物质及常用标记物）l l表达部位： 细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核、细胞多部位及组织等；l l检测物质： 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。常用于肿瘤病理鉴别诊断的免疫标记物常用于肿瘤病理鉴别诊断的免疫标记物（举（举 例）例）l l上皮组织：CK、EMA；l l特异性上皮标记：如TG、 PSA，TTF1等；l
8、l间叶组织：vinmentin；l l肌组织：desmin、SMA、MSA、myosin、myogenin、myoD1；l l血管内皮细胞：CD31、CD34、FVIIIRAg或FVIII；l l组织细胞：CD68、Mac387、溶菌酶等；l l神经内分泌： 1、激素标记物：儿茶酚胺、5HT、多肽和肽释放因子等； 2、非激素标记物：NSE、CGA、Syn等；l l神经组织： S100、MBP、Leu7、NSE、GFAP 、NFP等；l l淋巴造血组织：CD45（LCA）、CD20（L26）、 CD79a、CD3、 CD45RO、 CD15、CD30、Bcl2、Sig(IgM和IgD)等；l l
9、胚胎性抗原：CEA、AFP等；l l细胞增殖抗原：PCNA、Ki-67等；l l激素：ER、PR、AR等；l l病毒：HBV、EBV、HPV等；l l癌基因和抑癌基因：c-erBb-2、nm23、P53、P16和Bcl-2等临床应用临床应用l l免疫组化的临床应用主要包括以下几方面： 恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； 确定转移性恶性肿瘤的原发部位； 对某类肿瘤进行进一步的病理分型； 软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的 组 织学分类，因其种类多、组织形态相像， 有时难以区分其组织来源，应用多种标志物进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；l l发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范
10、围的确定。l l为临床提供治疗方案的选择。小圆细小圆细胞肿胞肿瘤的免瘤的免疫组疫组化鉴别诊断化鉴别诊断VimVimLCALCANSENSEDesDesS-100S-100CgACgA小细胞未分化癌小细胞未分化癌 神经内分泌癌神经内分泌癌 神经母细胞瘤神经母细胞瘤 / / EWS/PNETEWS/PNET / / 胚胎性横纹肌肉瘤胚胎性横纹肌肉瘤 恶性黑色素瘤恶性黑色素瘤 / / 恶性淋巴瘤恶性淋巴瘤 梭形细梭形细胞肿胞肿瘤的免瘤的免疫组疫组化鉴别诊断化鉴别诊断VimVimDesDes actinactin S-100 S-100FVIIIRAgFVIIIRAgCD34CD34al-ACTal-
11、ACT平滑肌肉瘤平滑肌肉瘤MPNSTMPNST/ / 单相性滑膜肉瘤单相性滑膜肉瘤/ / 纤维肉瘤纤维肉瘤恶性纤维组织细胞瘤恶性纤维组织细胞瘤/ / / / 梭形细胞血管肉瘤梭形细胞血管肉瘤胃肠道间质瘤胃肠道间质瘤/ / / / 梭形细胞恶性黑色素瘤梭形细胞恶性黑色素瘤梭形细胞癌梭形细胞癌 生殖细胞肿瘤免疫组化特点生殖细胞肿瘤免疫组化特点KeratinKeratinVimVimCEACEAAFPAFPHCGHCGPLAPPLAP精原细胞瘤精原细胞瘤 精母细胞性精原细胞瘤精母细胞性精原细胞瘤 胚胎癌胚胎癌 卵黄囊瘤卵黄囊瘤绒毛膜上皮癌绒毛膜上皮癌 畸胎瘤畸胎瘤 淋巴造血组织肿瘤免淋巴造血组织肿瘤
12、免疫组疫组化鉴别诊断化鉴别诊断LCALCACD20CD20CD45ROCD45ROCD56CD56MPOMPOVsc387Vsc387CD15CD15CD30CD30KP-1KP-1lysolysoB B细胞性淋巴瘤细胞性淋巴瘤+ + + T T细胞性淋巴瘤细胞性淋巴瘤+ + + NKNK细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤 + + 间变性大细胞性淋巴瘤间变性大细胞性淋巴瘤+ + + + + 浆细胞性恶性淋巴瘤浆细胞性恶性淋巴瘤-/+-/+ + + 粒细胞肉瘤粒细胞肉瘤 + + + + 真性组织细胞性淋巴瘤真性组织细胞性淋巴瘤 _ _ + + +霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤 -/+-/+ + + + 小小B B细
13、胞淋巴瘤免细胞淋巴瘤免疫组化特点疫组化特点 CD5 CD5 CD10 CD10 CD23 CD23 cyclinD1 cyclinD1B BCLLCLLSLLSLL淋巴浆细胞性淋巴瘤淋巴浆细胞性淋巴瘤滤泡性淋巴瘤滤泡性淋巴瘤套细胞性淋巴瘤套细胞性淋巴瘤淋巴结边缘区细胞淋巴瘤淋巴结边缘区细胞淋巴瘤结外边缘区细胞淋巴瘤结外边缘区细胞淋巴瘤（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤）（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤）垂体腺瘤的免垂体腺瘤的免疫组疫组化鉴别诊断化鉴别诊断LTHLTHGHGHACTHACTHPSH/LHPSH/LHFSHFSHCgACgANSENSEKERKER泌乳素细胞腺瘤泌乳素细胞腺瘤 生长激素细胞腺瘤生长激
14、素细胞腺瘤 促皮质激素细胞腺瘤促皮质激素细胞腺瘤 促性腺激素细胞腺瘤促性腺激素细胞腺瘤 / / 促甲状腺素细胞腺瘤促甲状腺素细胞腺瘤 / / 乳腺浸润性导管癌免疫组化分子分型乳腺浸润性导管癌免疫组化分子分型与治疗预后关系与治疗预后关系 ER ER PR PR HER-2 HER-2预后预后 治疗有效药物治疗有效药物Luminal ALuminal A 最好最好最好最好他莫昔芬他莫昔芬他莫昔芬他莫昔芬Luminal BLuminal B 较好较好较好较好他莫昔芬他莫昔芬他莫昔芬他莫昔芬+ +阿那曲唑阿那曲唑阿那曲唑阿那曲唑Triple NegativeTriple Negative 一般一般一般
15、一般含铂药物含铂药物含铂药物含铂药物+EGFR+EGFR抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂HER-2+ HER-2+ 最差最差最差最差曲妥珠单抗曲妥珠单抗曲妥珠单抗曲妥珠单抗部分相关相关图片免疫组化检测免疫组化检测P53在结直肠癌组织中的表达 SP400P53在结直肠癌组织中肿瘤细胞胞核表达l l CEA COX2l l Ki-67 Bcl-2cerBb-2CD20ERCK开展该项目注意事项开展该项目注意事项l l标本的固定方面 组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，其可有效防止组织自溶坏死，抗原丢失。离体组织应尽快在20分钟内固定，固定时间在6-24小时之间，固定液以选择10%的中性福尔马林为宜。 l l蜡块的选择方面 l l修复方法的选择和对比方面 l l设置阳性与阴性对照方面l l结果判读方面 谢谢！
