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1、第四章第四章 电泳技术电泳技术n1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。n2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好n3 电泳方法分类 按电场分：常压（500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式n4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）一 电泳的基本原理n电泳分离：n移动方向：带电性质决定n泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vtn影响的因素：n1颗粒本身：带电、大小、形状n2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。
2、二 纸电泳n以滤纸为支持体的电泳技术n操作要点：n1 选择缓冲液n对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响nA 分离蛋白质，pI 5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)nB 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸醋酸，pH5.9nC 分离核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，柠檬酸pH23nD 分离糖类：HAC-NaAC, pH35n2 滤纸的选择与处理n层析用滤纸，纸宽23cm/样品组分，长短影响电场强度。n3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品） 干法、湿法n4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间n5 显色及分析
3、蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察n一般洗脱定量三 薄膜电泳n支持体：薄膜n优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存n广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析n操作n1 薄膜的处理与放置n2 点样 平衡n3 电泳：E 1025V/cm，0.52hn4 显色四 薄层电泳n将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。n常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等n操作：n1 缓冲液选择n离子强度较高的缓冲液n2 支持物处理n精制品n3 薄层板制作n4加样：挖沟、混合样品、填埋n5 电泳n6分析：印染法五 凝胶电泳n支持物：多孔凝胶n聚丙烯酰胺
4、凝胶、琼脂糖凝胶等n具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高n最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：n机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。n分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；n连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳n1 聚丙烯酰胺凝胶的制备n丙稀酰胺（单体）N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）（催化剂） 聚合n催化剂：n（1）过硫酸铵四甲基乙二胺（TEMED）n（2）核黄素（VitB2）光n改变单体浓度可改变凝胶孔径n交联剂对孔径有影响：5最小n根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。n2 不连续电泳中样品压缩成层的原理n不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同
5、pH值的缓冲液：n样品胶：大孔径，pH6.76.8Tris-HCl缓冲液n浓缩胶：与样品胶相同n分离胶：小孔径，pH8.88.9 Tris-HCl缓冲液n样品压缩成层原理：n电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸nHCl (解离） Cl ， Cl 泳动速度最快（快离子）nCH2(NH2)COOH (样品胶、浓缩胶pH6.76.8） CH2(NH2)COO（0.11.0）泳动速度最慢（慢离子）n蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间n电泳时， Cl 超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区较高电位梯度P和慢离子加速移动P压缩成层n样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测）， CH2
6、(NH2)COO增加，泳动速度增大，很快超过P， P在均一的电位梯度和pH条件下分离SDS-凝胶电泳原理n聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。n加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。n分离测定：n测分子量（与标准蛋白比较）n鉴定样品纯度（条带数目）n测定样品P含量：扫描定量（比色）凝胶电泳的操作要点n1 凝胶制备n2 电极缓冲液n3 样品处理及加样n4 电泳n5 染色与固定n6 脱色n7 分析烟曲霉菌中抗真菌
7、活性肽类物质的分离与纯化六 等电点聚焦电泳n电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。n优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。n缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。n1 稳定的稳定的pH梯度的形成梯度的形成n2 两性电解质载体 要求： 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体）n3 支持pH梯度的介质 密度梯度溶液（用于自由电泳） 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）n4 操作要点 pH梯度支持介质的制备 聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去电泳技术思考题n1名词解释 电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳n2 影响泳动度的主要因素有哪些？n3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？n4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？n5 不连续电泳样品压缩成层原理。n6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。n7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何测定蛋白质等电点？
