线粒体钙超载

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1、Calcium Homeostasis and Calcium Overload in Cell(细胞内钙稳态与钙超载细胞内钙稳态与钙超载)Pathophysio. Dep. Of SDU袁中瑞袁中瑞 1In all eukaryotic cells, the cytosolic concentration of Ca2+ ions (Ca2+ C) is tightly controlled by interactions among transporters, pumps, channels and binding proteins. Finely tuned changes in Ca2

2、+ C modulate a variety of intracellular functions ranging from muscular contraction to secretion, and disruption of Ca2+ handling leads to cell death. 2 细胞内钙稳态调节细胞内钙稳态调节 ( (Calcium Homeostasis in Cell 细胞内钙超载细胞内钙超载 (calcium overload in cell ) 线粒体与钙线粒体与钙 (mitochondria and calcium)3一、 Calcium Homeostas

3、is in Cell4Fig. 1. Ca2+ distribution in the cell. High and low Ca2+ domains are marked with orange and blue, respectively. (From: Calcium signaling and apoptosis, Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 9;304(3):445-54 )56( (一一) )钙平衡钙平衡1 1、钙瞬变值、钙瞬变值 Ca2+EC: 110 mM Ca2+C :0.110M细胞内钙细胞内钙: 44%存于胞内钙库（肌浆网存于

4、胞内钙库（肌浆网/内质网）内质网）； 细胞内游离钙仅细胞内游离钙仅0.005%生理性钙瞬变值生理性钙瞬变值：即细胞内钙浓度的增加，平均介于即细胞内钙浓度的增加，平均介于0.110M之间。之间。 钙荧光探光探针（indo-1indo-1、fura-2fura-2、fluo-3 AM fluo-3 AM 等等等）以及等）以及Aequorin （水母发光蛋白）、（水母发光蛋白）、 GFP-based fluorescent Ca2+ probes （such as cameleons and pericams ）等。）等。7892 2. .钙移动的决定因素钙移动的决定因素钙的平衡和的平衡和钙的瞬的瞬

5、变值依依赖于两于两组蛋白蛋白质 一一组负责钙的的输入和激活入和激活钙释放放 另一另一组负责钙的的输出和出和摄取回收取回收 (1(1）CaCa2+2+进入胞液的途径进入胞液的途径 (2(2）CaCa2+2+离开胞液的途径离开胞液的途径10(1(1）CaCa2+2+进入胞液的途径进入胞液的途径 Ca Ca2+2+进入胞液是顺浓度梯度的被动过程进入胞液是顺浓度梯度的被动过程 细胞外细胞外CaCa2+2+跨膜入胞跨膜入胞细胞内细胞内CaCa2+2+释放释放 细胞内细胞内CaCa2+2+增加主要取决于内增加主要取决于内CaCa2+2+释放释放 另外另外CaCa2+2+还可通过还可通过NaNa+ +- -

6、CaCa2+2+交换蛋白进入胞液交换蛋白进入胞液11 1）细胞膜细胞膜CaCa2+2+通道通道电压依赖性电压依赖性CaCa2+2+通道（通道（voltage-dependent voltage-dependent calcium channelcalcium channel，VDCVDC）：）：其活其活动受膜受膜电压变化的影响化的影响 L- L-型型( (Lasting-,Lasting-,持持续型型) )：特点是开启后特点是开启后产生持生持续CaCa2+ 2+ 内流；内流； （* *可被可被钙通道阻滞通道阻滞剂所阻断所阻断） T- T-型型( (Transitory,Transitory,短

7、暂短暂型型) )：开放开放时间短短暂，很，很快失活；快失活； N- N-型型( (Neuronal,Neuronal,神神经型型) )：开放开放时间介于介于L L、 T T 型，只存在于某些神型，只存在于某些神经元上。元上。 12受体操纵性钙通道受体操纵性钙通道( (receptor-operated receptor-operated calcium channelcalcium channel，ROC)ROC)： a a 配体与受体配体与受体结合后合后直接直接调节钙通道开放通道开放； b b 配体与受体配体与受体结合后合后G G蛋白偶蛋白偶联调节钙通通道开放道开放； c c 受体与配体受体

8、与配体结合后合后G G蛋白偶蛋白偶联产生第二生第二信使信使修修饰VDC(VDC(可能是可能是L-L-型型VDC)VDC)，调节VDCVDC对CaCa2+ 2+ 的通透性的通透性。 13egeg: : 1 1受体激动剂受体激动剂G G蛋白蛋白 AC AC cAMPcAMP PKA PKA 磷酸化钙通道，胞外磷酸化钙通道，胞外CaCa2+ 2+ 内流。内流。142 2）细胞内贮存钙释放的机制）细胞内贮存钙释放的机制 细细胞胞内内游游离离CaCa2+2+主主要要贮贮存存于于内内质质网网( (ER)ER)肌肌浆浆网网( (SR)SR)中，经中，经CaCa2+2+释放通道释放。释放通道释放。 1,4,5

9、-1,4,5-三三磷磷酸酸肌肌醇醇( (IPIP3 3) )敏敏感感钙钙池池: :受受IPIP3 3受受体体系系统调控统调控 IP IP3 3不敏感钙池不敏感钙池: : 受受ryanodineryanodine受体系统调控受体系统调控15 IPIP3 3受体系统受体系统当当IPIP3 3与与IPIP3 3受体受体( (IPIP3 3R)R)结合结合开放钙通道，开放钙通道，ER/SRER/SR中的钙释放入胞浆中中的钙释放入胞浆中IPIP3 3R-typeR-type介介导导的的CaCa2+ 2+ 释释放放依依赖赖于于一一定定浓浓度度的的胞胞浆浆CaCa2+ 2+ （CaCa2+2+ii），呈呈钟

10、钟形形反反应应( (bell-shaped bell-shaped response); response); IPIP3 3R-type, R-type, 则则更更接接近近线线性性反反应。应。 IPIP3 3R R系系统释放放细胞内胞内钙受受许多因素影响：多因素影响： CaCa2+2+ii；碱性碱性环境中境中CaCa2+2+释放增加放增加 K K+ + 通通过K K+ + 通道通道进入入钙池，池，进而促而促进CaCa2+ 2+ 释放放 肝素是肝素是IPIP3 3R R的持异性拮抗的持异性拮抗剂16 ryanodineryanodine受体系统受体系统在在多多种种细细胞胞内内普普遍遍存存在在r

11、yanodineryanodine受受体体（以以下下简简称称RyRRyR）调节调节IPIP3 3不敏感钙池内钙的释放。不敏感钙池内钙的释放。现知现知RyRRyR至少有至少有3 3种亚型种亚型: :RyRRyR1 1存存在在于于骨骨路路肌肌SRSR上上，有有5032503250375037个个氨氨基基酸酸残基；残基；RyRRyR2 2存在于心肌上，有存在于心肌上，有49674967个氨基酸残基，个氨基酸残基，RyRRyR3 3存存在在于于非非肌肌性性细细胞胞上上，比比前前两两者者小小得得多多，只只有有641641个氨基酸残基。个氨基酸残基。17CaCa2+ 2+ 与与RyRRyR上上的的CaCa

12、2+ 2+ 结结合合位位点点结结合合，而而触触发发SRSRERER释释放放CaCa2+ 2+ 。这这种种CaCa2+ 2+ 诱诱发发CaCa2+ 2+ 释释放放( (calcium calcium induced induced calcium calcium releaserelease， CICR) CICR) 的的正正反反馈馈机机制制是是RyRRyR系系统统触触发发CaCa2+ 2+ 释放的特征。释放的特征。普鲁卡因、钌红为普鲁卡因、钌红为RyRRyR的拮抗剂，咖啡因、的拮抗剂，咖啡因、ryanodineryanodine为其激动剂。为其激动剂。183 3） NaNa+ +- -CaCa

13、2+2+交换蛋白交换蛋白NaNa+ +- -CaCa2+2+交交换换蛋蛋白白: :为为双双向向性性离离子子转转运运器器，催催化化NaNa+ +从从膜膜的的一一侧侧转转运运到到另另一一侧侧，以以交交换换CaCa2+2+的的相相反方向的运动。反方向的运动。 3 NaNa+ +: CaCa2+2+，是产电的。，是产电的。3Na+Ca2+胞外胞外胞内胞内19NaNa+ +- -CaCa2+2+交交换换是是利利用用业业已已建建立立起起来来的的离离子子的的电电化化学学位位能能，即即由由NaNa+ +-K-K+ + ATPaseATPase 建建立立的的胞胞内内外外NaNa+ +梯梯度度，而而不不直直接接利

14、利用用ATP。CaCa2+2+流流动动的的方方向向取取决决于于NaNa+ +梯梯度度的的方方向向，只只是是后后者者的的方方向向相相反。反。NaNa+ +- -CaCa2+2+交交换换的的可可逆逆电电位位约约在在15mV到到 30mV之之间间。膜膜电电位位负负于于可可逆逆电电位位时时， NaNa+ +内内向向和和CaCa2+2+外外向向运运动动。反反之之，膜膜电电位位正正于于可可逆逆电电位位，也即膜去极化，则也即膜去极化，则NaNa+ +外向而外向而CaCa2+2+内向运动。内向运动。20(2(2） CaCa2+2+离开胞液的途径离开胞液的途径CaCa2+2+离开胞液是逆浓度梯度、耗能的主动过程

15、离开胞液是逆浓度梯度、耗能的主动过程: : 1) Ca 1) Ca2+2+ - -ATPATP酶酶 2) Na 2) Na+ +- -CaCa2+2+交换蛋白交换蛋白211) Ca1) Ca2+2+ - -ATPATP酶酶心心肌肌细细胞胞主主要要依依靠靠CaCa2+2+ - -ATPATP酶酶转转运运CaCa2+2+回回到到细细胞胞内内贮贮存存系系统统或或移移出出细细胞胞外外恢恢复复细细胞胞内内的的CaCa2+2+稳态。稳态。CaCa2+2+ - -ATPATP酶酶有有1010个个螺螺旋旋疏疏水水节节段段，称称为为M1M1M10M10。在在M4M4，M5M5，M6M6，M8M8形形成成的的一一

16、个个通通道道中中有有2 2个个对对CaCa2+2+具具有有很很高高亲亲和和力力的的结结合合位位点点。这这1010个个螺螺旋旋疏疏水水节节段段与与3 3个个细细胞胞质质亲亲水水环环相相连连接接。亲亲水环包含水环包含ATPATP结合位点和磷酸化位点。结合位点和磷酸化位点。22 细胞膜细胞膜CaCa2+2+ - -ATPATP酶酶: :利利用用ATPATP提提供供的的能能量量逆逆细细胞胞膜膜两两侧侧高高的的电电化化学学梯梯度度泵泵出出CaCa2+2+ ，其其活活性性受受钙钙调调蛋蛋白白、PKAPKA、PKCPKC等因子的调控。等因子的调控。 细胞器（内质网及肌浆网）钙细胞器（内质网及肌浆网）钙ATP

17、ATP酶：酶：位位于于细细胞胞内内钙钙贮贮存存系系统统（细细胞胞器器）膜膜上上，蓄蓄积积CaCa2+2+到细胞器腔中。到细胞器腔中。心心脏脏和和血血管管的的肌肌浆浆网网CaCa2+2+ - -ATPATP酶酶构构型型具具有有特特殊殊性性，其其功功能能调调节节依依赖赖于于一一种种辅辅助助性性跨跨膜膜蛋蛋白白-受磷蛋白。受磷蛋白。23受磷蛋白（受磷蛋白（phospholamban,PLNphospholamban,PLN) )受受磷磷蛋蛋白白由由五五个个亚亚基基( (分分子子量量6 6 KD)KD)组组成成，每每个个亚亚基基均均可可磷磷酸酸化化，有有两两个个不不同同的的磷磷酸酸化化位位点点，分分别

18、别对对cAMPcAMP依依赖赖的的蛋蛋白白激激酶酶A(PKA)A(PKA)和和另另一一种种钙钙调蛋白依赖的蛋白激酶起反应。调蛋白依赖的蛋白激酶起反应。受受磷磷蛋蛋白白的的磷磷酸酸化化肌肌浆浆网网CaCa2+2+ - -ATPATP的的跨跨膜膜结结构改变，构改变， CaCa2+2+ - -ATPATP的泵能力随后被激活。的泵能力随后被激活。（HF）NE，- R PKAPKA : Pi化化PLN , 非非Pi 化化PLN 心肌舒张功能障碍心肌舒张功能障碍242) Na2) Na+ +- -CaCa2+2+交换蛋白交换蛋白在细胞内高钙时作为钙输出系统工作在细胞内高钙时作为钙输出系统工作NaNa+ +

19、- -CaCa2+2+交换其转运交换其转运CaCa2+2+的速率高，约为钙泵的几的速率高，约为钙泵的几十倍。十倍。Ca2+3Na+胞外胞外胞内胞内2526举例：举例：给予给予-激动剂激动剂心肌收缩力心肌收缩力，舒张速率，舒张速率 L-VDCPLNCa2+-ATPaseCa2+-ATPase27二、细胞内钙超载二、细胞内钙超载28Temporally and spatially organized increases in Ca2+c, Ca2+ m, and Ca2+ n represent one of the most commonly used intracellular signals

20、. However, prolonged changes in Ca2+ distribution including an elevation in Ca2+c, Ca2+ m, and Ca2+ n and a Ca2+ decrease in ER trigger a variety of cascades that lead to cell death. 29 1972 年年Shen 和和Jennings发发现现犬犬心心脏脏冠冠状状动动脉脉短短暂暂闭闭塞塞后后复复灌灌可可加加速速细细胞胞内内Ca2+的的积积聚聚, 并并首首次次提提出出钙钙超超载载之之说说, 此此后后, Ca2+在在再再

21、灌灌注注损损伤伤中的作用一直成为人们研究的重点。中的作用一直成为人们研究的重点。各各种种原原因因引引起起的的细细胞胞内内钙钙含含量量异异常常增增多多并并导导致致细细胞胞结结构构损损伤伤和和功功能能代代谢谢障障碍碍的的现现象象称称为为钙钙超超载载( (calcium overload)calcium overload)。30Possible Correlation of Calcium Overload with CytotoxicityIncreasing of Ca2+ C, calcium overload, is the primary cause of cytotoxiceffects

22、, including necrosis and apoptosis, of toxicants and stress induced responses.eg. Cardiotoxicity: oxidative stress, ischemia-reperfusion ; Hepatotoxicity: CCl4Immunotoxicity: glucocorticoidsKidney toxicity: oxidative stress, heavy metalsNeurotoxicity: lead, ischemia, excitatory amino acid31Role of C

23、alcium Overload in Cellular InjuryRelation of Ca2+ C to early reversible injury -bleb and cytoskeletalalteration -cell volume changes () -nuclear changes () -condensation of mitochondriaRelation of Ca2+ C to irreversible injury -swollen mitochondria -DNA strand break32(一）一）Ca2+超载的的形态学资料超载的的形态学资料 电电镜

24、镜：大大多多内内流流的的CaCa2+2+都都局局限限于于mitomito基基质质内内的的致致密密体体内内（细细胞胞CaCa2+2+超超载载的的显显示示器器）, , mitomito内内CaCa2+2+的大量内流是再灌注收缩早期的特征现象。的大量内流是再灌注收缩早期的特征现象。形形态态学学变变化化：缺缺血血40 40 minmin时时（ 肌肌纤纤维维水水肿肿、mitomito肿肿胀胀, , 无无CaCa2+2+流流入入mitomito的的迹迹象象）；再再灌灌注注时时: : 心心肌肌细细胞胞超超微微结结构构的的损损伤伤（收收缩缩带带的的形形成成、心心肌肌纤纤维维的的断断裂裂和和肌肌纤纤维维膜膜的的

25、破破坏坏, , 细细胞胞急急剧剧肿肿胀胀, , 并出现并出现mitomito内致密体）内致密体）用用CaCa2+2+荧荧光光探探针针表表明明：心心肌肌缺缺血血90 90 秒秒（已已发发生生细细胞胞内内CaCa2+2+）；短短暂暂缺缺血血后后再再灌灌注注早早期期（细细胞胞内内CaCa2+2+暂暂时时）； 缺缺血血30 30 分分钟钟后后复复灌灌（渐渐进进的的稳稳定的定的CaCa2+2+）。）。33（二）二）Ca2+超载的机制超载的机制 1、N a+- Ca2+ 交换异常交换异常 2、内源性儿茶酚胺释放增多、内源性儿茶酚胺释放增多 3、生物膜损伤、生物膜损伤 341. N a+- Ca2+ 交换异

26、常交换异常 在在心心肌肌缺缺血血和和再再灌灌注注时时，NaNa+ +-Ca-Ca2+2+交交换换蛋蛋白白以以反反向转运增强，成为向转运增强，成为CaCa2+ 2+ 进入细胞的主要途径。进入细胞的主要途径。胞外胞外胞内胞内Ca2+3Na+35（1）细胞内高细胞内高Na+对对Na+-Ca2+交换蛋白的交换蛋白的直接激活直接激活 缺血：缺氧缺血：缺氧 ATP Na+ -ATPase失灵失灵 细细胞内胞内Na+浓度升高浓度升高 再灌注：氧，再灌注：氧，ATP 激活激活Na+ - Ca2+交换蛋白交换蛋白 细胞内高钠细胞内高钠 Na+ - Ca2+交交换换蛋蛋白白以以反反向向转转运运的的方方式式加加速速

27、Na+向细胞外转运，同时将大量向细胞外转运，同时将大量Ca2+运入胞浆。运入胞浆。36（2）细胞内高）细胞内高H+ 对对Na+-Ca2+交换蛋白的交换蛋白的间接激活间接激活 Na+-H+交换蛋白交换蛋白细胞膜细胞膜Na+-H+交换蛋白是离子逆向转运蛋白交换蛋白是离子逆向转运蛋白 Na+-H+交换蛋白主要感受细胞内交换蛋白主要感受细胞内H+浓度的变化，浓度的变化，利用利用H+ 电电-化学梯度作为动力来源，以化学梯度作为动力来源，以1：1的的比例将细胞内比例将细胞内H+排出细胞，而将排出细胞，而将Na+摄入细胞，摄入细胞，这是维持细胞内这是维持细胞内pH稳定的重要机制。稳定的重要机制。Na+H+胞

28、外胞外胞内胞内37缺血缺血 无氧代谢无氧代谢 细胞内、外细胞内、外H + 浓度浓度 再灌注再灌注 胞外胞外H + ，胞内，胞内H + 仍高仍高跨膜跨膜H+ 浓度梯度形成浓度梯度形成激活激活Na+-H+交换蛋白交换蛋白促进细促进细胞内胞内H+排出，而细胞外排出，而细胞外Na+内流内流 ；如果内流的不能被如果内流的不能被Na+ -ATPase充分排出，细胞充分排出，细胞内高钠就可继发性激活内高钠就可继发性激活Na+-Ca2+交换蛋白，促进交换蛋白，促进Ca2+内流，加重细胞内内流，加重细胞内Ca2+超载。超载。 动物实验中应用动物实验中应用Na+-H+交换抑制剂可减轻心肌交换抑制剂可减轻心肌缺血再

29、灌注损伤，但在近年临床患者的实验中，缺血再灌注损伤，但在近年临床患者的实验中， Na+-H+交换抑制剂并未对高危患者显示出明显交换抑制剂并未对高危患者显示出明显的保护作用，提示还有其他机制介导再灌注性心的保护作用，提示还有其他机制介导再灌注性心肌损伤。肌损伤。 382. 内源性儿茶酚胺释放增多内源性儿茶酚胺释放增多 生生理理条条件件下下，心心功功能能主主要要受受肾肾上上素素能能受受体体调调节节，1肾肾上上素素能能受受体体的的调调节节作作用用很很小小。但但缺缺血血-再再灌灌注注损损伤伤时时，内内源源性性儿儿茶茶酚酚胺胺释释放放增增多多，1肾上素能受体的调节也相对起重要作用。肾上素能受体的调节也相

30、对起重要作用。391)1肾上素能受体肾上素能受体1肾肾上上素素能能受受体体激激活活G蛋蛋白白-磷磷脂脂酶酶C（PLC）介介导导的的细细胞胞信信号号转转导导通通路路，促促进进磷磷脂脂酰酰酯酯醇醇（PI）分分解解，生生成成三三磷磷酸酸肌肌醇醇（IP3）和和甘油二酯（甘油二酯（DG）。）。 IP3与与肌肌浆浆网网上上的的IP3受受体体结结合合促促进进钙钙池池内内钙钙释放；释放； DG进进一一步步激激活活PKC，而而PKC可可促促进进Na+-H+交交换换，进进而而增增加加Na+-Ca2+交交 换换 ， 使使 胞胞 浆浆Ca2+浓度升高浓度升高402)肾上素能受体兴奋肾上素能受体兴奋 肾上素能受体兴奋可

31、通过增加肾上素能受体兴奋可通过增加L型型Ca2+通道的通道的开放促进开放促进Ca2+内流内流 : 1 1受体激动剂受体激动剂心肌细胞后，通过心肌细胞后，通过G G蛋白偶联蛋白偶联激活激活ACcAMPACcAMP，激活激活PKA PKA 磷酸化磷酸化L型型钙通钙通道，使其对道，使其对CaCa2+ 2+ 通透性增高，胞外通透性增高，胞外CaCa2+ 2+ 内流内流41 在缺血前或再灌注前应用在缺血前或再灌注前应用Ca2+通道通道阻阻滞滞剂阻断阻断Ca2+内流，可见细胞坏死程度减内流，可见细胞坏死程度减轻，提示轻，提示Ca2+通道是细胞外通道是细胞外Ca2+进入胞浆进入胞浆造成造成Ca2+超载的途径

32、之一。但在再灌注后超载的途径之一。但在再灌注后应用应用Ca2+通道通道阻滞阻滞剂往往不能有效的防止往往不能有效的防止细胞内细胞内Ca2+浓度升高。浓度升高。 423. 生物膜损伤 细胞膜和细胞内膜性结构是维持细细胞膜和细胞内膜性结构是维持细胞内、外以及细胞内各间区离子平衡的胞内、外以及细胞内各间区离子平衡的重要结构。生物膜损伤可使其通透性增重要结构。生物膜损伤可使其通透性增加，细胞外加，细胞外Ca2+ 顺浓度差进入细胞，或顺浓度差进入细胞，或使细胞内使细胞内Ca2+分布异常，加重细胞功能分布异常，加重细胞功能紊乱与结构破坏。紊乱与结构破坏。 43Cellular membraneCellula

33、r membrane PLA2lipid break upCa2+normal无无Ca2+再灌注再灌注glycocalyxglycocalyx(1) Ca2+反常反常44(2) 自由基损伤膜，膜结构破坏自由基损伤膜，膜结构破坏(3) 肌浆网膜损伤：肌浆网膜损伤： CaCa2+2+ - -ATPATP酶酶功能抑制，使肌功能抑制，使肌浆网摄浆网摄Ca2+减少减少 (4) 线粒体膜损伤：抑制氧化磷酸化，使线粒体膜损伤：抑制氧化磷酸化，使ATP生成生成减少，细胞膜和肌浆网膜减少，细胞膜和肌浆网膜CaCa2+2+ - -ATPATP酶酶能量供应能量供应不足，促进不足，促进Ca2+超载的发生；超载的发生；

34、细胞膜细胞膜NaNa+ + - -ATPATP酶酶能量供应不足，能量供应不足，细胞内细胞内NaNa+ +含量明显增高，激含量明显增高，激活活NaNa+ +-Ca-Ca2+2+交换蛋白，交换蛋白，CaCa2+2+内流增多。内流增多。 45（三）钙超载引起再灌注损伤的机制（三）钙超载引起再灌注损伤的机制 1 1. . 激活多种酶：激活多种酶：CaCa2+2+i i 磷脂酶磷脂酶 细胞膜及细胞器膜的损伤细胞膜及细胞器膜的损伤 花生四烯酸（花生四烯酸（arachidonic acid, AA) 环氧合酶：环氧合酶： PGI2，PGD2，PGE2，TXA2 脂氧合酶：白三烯（脂氧合酶：白三烯（LT）：）

35、：LTB4、LTC4 LT：趋化性趋化性（WBC），激活激活M 细胞色素细胞色素P-450加单氧酶：加单氧酶：抑制钠泵的代谢产物抑制钠泵的代谢产物CaCa2+2+i i 蛋白酶蛋白酶 细胞膜和结构蛋白的分解细胞膜和结构蛋白的分解AA46CaCa2+2+iiATPaseATPase ATP ATP 的消耗的消耗CaCa2+2+ii核酶（核酶（ribozymeribozyme） 染色体的损伤染色体的损伤 2. 2. 促进氧自由基生成：促进氧自由基生成：次黄嘌呤次黄嘌呤 CaCa2+2+i XO i XO 黄嘌呤黄嘌呤 自由基自由基 尿酸尿酸3 3. . 再灌注性心律失常再灌注性心律失常 CaCa2

36、+2+i i NaNa+ +-Ca-Ca2+2+交交换换 一一过过性性内内向向电电流流 在在APAP后形成延迟后除极后形成延迟后除极 心律失常心律失常474 4. .肌原纤维过度收缩（收缩带）肌原纤维过度收缩（收缩带） CaCa2+2+i i 肌肌原原纤纤维维过过度度收收缩缩（收收缩缩带带）肌肌纤维断裂纤维断裂 Mechanism:Mechanism: 缺血期堆积的缺血期堆积的H H+ +迅速移走，抑制作用迅速移走，抑制作用 再灌注，重新获得再灌注，重新获得ATP + ATP + CaCa2+2+ii 肌原纤维过度收缩肌原纤维过度收缩/ /甚至是不可逆性缩短甚至是不可逆性缩短 损伤细胞骨架结构

37、损伤细胞骨架结构心肌纤维断裂心肌纤维断裂 48实验证据：实验证据：单个心肌细胞内注射单个心肌细胞内注射CaCa2+2+细胞的过度收缩细胞的过度收缩结扎猪冠状动脉前降支结扎猪冠状动脉前降支4545minmin，恢复血流，经恢复血流，经冠脉给与直接抑制肌原纤维收缩的药物冠脉给与直接抑制肌原纤维收缩的药物BDM BDM 再灌注后心肌梗死的面积比对照组减少再灌注后心肌梗死的面积比对照组减少50%50%5 5. . 线粒体功能障碍线粒体功能障碍 ATPATP生成不足；启动细胞的死亡生成不足；启动细胞的死亡是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤着缺

38、血再灌注损伤49三、三、线粒体与钙线粒体与钙线粒体被认为是细胞内最大的钙池之一，生理线粒体被认为是细胞内最大的钙池之一，生理状态下，可以有效地缓冲细胞内状态下，可以有效地缓冲细胞内CaCa2+2+浓度变化。浓度变化。心肌缺血后，其损伤的发生、发展与线粒体内心肌缺血后，其损伤的发生、发展与线粒体内CaCa2+2+稳态失调关系密切。稳态失调关系密切。目前研究证实，在多数条件下，线粒体内目前研究证实，在多数条件下，线粒体内CaCa2+2+的过度聚集使的过度聚集使膜通透性转运孔膜通透性转运孔（mitochondrial mitochondrial permeability transition por

39、e , MPTPpermeability transition pore , MPTP） 开放，引开放，引起线粒体功能障碍和与启动细胞死亡事件相关起线粒体功能障碍和与启动细胞死亡事件相关蛋白的释放，启动细胞死亡。蛋白的释放，启动细胞死亡。 50线粒体的结构：由内外两层膜封闭，包括外膜、线粒体的结构：由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。在肝细胞内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基质质67%，内膜，内膜21%，外膜，外膜8% ，膜间隙，膜间隙4%。 线粒体结构模型线粒体结构模型51（一）线粒

40、体内（一）线粒体内CaCa2+2+的转运的转运 1. 线粒体内线粒体内CaCa2+2+与钙微区与钙微区 钙微区（钙微区（calcium microdomain）是指当单个钙是指当单个钙释放通道或小群通道开放时，形成通道口附近释放通道或小群通道开放时，形成通道口附近的局部的局部CaCa2+2+浓度升高。浓度升高。少量激活内质网上的少量激活内质网上的IP3型钙释放通道型钙释放通道胞浆内胞浆内钙微区钙微区周围的线粒体可感受到钙微区周围的线粒体可感受到钙微区线粒线粒体内体内CaCa2+2+浓度快速上升。浓度快速上升。 mito- mito-内质网内质网 8080nmnm线粒体内线粒体内CaCa2+2+

41、聚积影响内质网对聚积影响内质网对CaCa2+2+的摄取与释的摄取与释放，两者之间可进行放，两者之间可进行CaCa2+2+循环。而且，线粒体循环。而且，线粒体对内质网对内质网CaCa2+2+释放有调节作用。释放有调节作用。522. 线粒体内钙离子的转运方式及调节线粒体内钙离子的转运方式及调节 产电的顺向转产电的顺向转运运UniporterUniporter. . 两种交换：两种交换： 3 NaNa+ +/ CaCa2+2+逆逆向转运向转运 ， 2H H+ +/ CaCa2+2+逆向逆向转运转运. . 53(1) the mitochondrial Ca2+ uniporter, MCUis on

42、 the inner membrane, the Pathway of mito taking up Ca2+.Act like a channel, opening with increased probability once the local Ca2+ c rises.Low-affinity : its activity would be extremely low at rest.Taking up Ca2+ at the expenses of m ( -150200 mV ).可被钌红可被钌红( (ruthinium red)和和La3+特异性抑制特异性抑制. .54MCU s

43、tarts to be activated at 25M of local Ca2+ c .At the average, Ca2+ c is near 10M during activation，but higher Ca2+ concentrations (10100M) can be reached at local cells spots, at high Ca2+ microdomains.The activity of the MCU is very small or absent at cytosolic Ca2+ below 0.5M , whereas its activit

44、y increases dramatically along the micromolar range, reaching saturation above 100M.Global Ca2+ c increasing able to activate MCU can also be reached during Ca2+ overload under pathological circumstances and do usually drive to mitochondria-triggered cell death.MCU55（2) Pathway of calcium effluxing

45、from mitochondria Mito 3Na+/Ca2+ exchanger, is predominant in heart and brain mitochondria and is electrogenic Ca2+ /2H+ exchanger：is nonelectrogenic and is present in liver and kidney mitochondria MPTP a regulated pore, which has two different open states and can open transiently. During physiologi

46、cal Ca2+ signals, an increase in Ca2+ m is followed by a transient release of Ca2+ m 56Activation of MCU occurs when the Ca2+ c in the neighbourhood of the mitochondrial membrane increases to the micromolar range. Under these conditions, the rate of Ca2+ entry through the uniporter exceeds that of C

47、a2+ extrusion through the exchanger, leading to a fast increase in Ca2+ m .Summarize57 是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤载伴随着缺血再灌注损伤（二）线粒体钙超载与细胞损伤（二）线粒体钙超载与细胞损伤58591.1.线粒体钙超载使线粒体钙超载使ATP合成障碍合成障碍生理状态下，生理状态下， Ca2+ m 调节调节mito产能产能细细胞胞受受到到生生理理剌剌激激时时, CaCa2+2+由由钙钙库库释释放放线线粒粒体体产产生生短短暂暂而而局局部部的的CaCa

48、2+2+上上升升线线粒粒体体脱脱氢氢酶酶活性增加。活性增加。细细胞胞缺缺血血 Ca2+ m增增加加，线线粒粒体体脱脱氢氢酶酶活活性性增加，产生更多的增加，产生更多的ATP以满足细胞需要。以满足细胞需要。Ca2+ m过过度度持持续续增增加加,可可引引起起线线粒粒体体膜膜通通透透性性转转运运孔孔 (MPTP)不不可可逆逆过过度度开开放放， 小小于于1 500道道尔尔顿顿的的分分子子或或离离子子可可以以通通过过线线粒粒体体内内膜膜， H+由此进入线粒体基质由此进入线粒体基质引起引起ATP合成障碍。合成障碍。 60 化学渗透学说：化学渗透学说：认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是认为在氧化与磷酸化

49、之间起偶联作用的因素是H+H+的跨膜梯度的跨膜梯度. .这一学说得到公认并获得了这一学说得到公认并获得了19781978年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。( (呼呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜逆浓度梯度泵出线粒体内膜; H+; H+不能自由透过线粒体内膜不能自由透过线粒体内膜在在线粒体内膜两侧形成质子跨膜梯度线粒体内膜两侧形成质子跨膜梯度pHpH及跨膜电位及跨膜电位线粒体线粒体外的外的H+H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+H+浓度梯度进入线浓度梯度

50、进入线粒体基质中，粒体基质中，H+H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATPATP的合的合成成) )612.2.线粒体钙超载导致线粒体钙超载导致MPTP不可逆过度开放不可逆过度开放MPTP是由电位依赖性离子通道，是孔蛋白、腺苷是由电位依赖性离子通道，是孔蛋白、腺苷酸移位酶及亲环素酸移位酶及亲环素D复合物在内外膜交接处构成的复合物在内外膜交接处构成的一种复合结构。一种复合结构。MPTP在生理状态下呈间断性开放，且具有可逆性，在生理状态下呈间断性开放，且具有可逆性，能造成能造成m的降低，线粒体内的降低，线粒体内Ca2+减少和内部产减少和内部产生自由基减少，使

51、细胞维持正常的生理功能。若生自由基减少，使细胞维持正常的生理功能。若MPTP不可逆过度开放可导致不可逆过度开放可导致m崩溃，呼吸链崩溃，呼吸链解偶联，解偶联，ATP合成停止，线粒体基质外流，还原性合成停止，线粒体基质外流，还原性谷胱甘肽耗竭，超氧阴离子大量产生，最终导致谷胱甘肽耗竭，超氧阴离子大量产生，最终导致基质渗透压增高，线粒体内腔肿胀。基质渗透压增高，线粒体内腔肿胀。 62 线线粒粒体体钙钙超超载载产产生生缺缺血血再再灌灌注注损损伤伤的的重重要要机机制制之之一一就就是是线线粒粒体体基基质质CaCa2+2+浓浓度度持持续续升升高高致致使使线线粒体内膜粒体内膜MPTP不可逆过度开放不可逆过度

52、开放 63 1） MPTP开开放放引引起起细细胞胞色色素素C释释放放细细胞胞死亡：死亡： 在在细细胞胞色色素素C含含量量丰丰富富的的细细胞胞，通通过过快快速速凋凋亡亡机机制制包包括括由由ApaF1(凋凋亡亡促促进进因因子子-l)介介导导的的凋凋亡亡过过程程。释释放放的的细细胞胞色色素素C参参与与激激活活凋凋亡亡的的酶酶通通路路，未未释释放放的的细细胞胞色色素素C用用于于维维持持电电子子传传递递和和氧氧呼呼吸，为凋亡进程提供吸，为凋亡进程提供ATP。 由由于于线线粒粒体体MPTP开开放放，细细胞胞色色素素C大大量量释释放放，ATP产生骤减，无法维持供能，细胞走向坏死。产生骤减，无法维持供能，细胞

53、走向坏死。64Fig. 2. Temporal and spatial organization of mitochondrial depolarization and cyto c release induced by C2-ceramide+Ca2t and tBid. Fluorescence imaging of DWm was carried out simultaneously with cyto c distribution in cyto c-GFP-expressing and TMRE-loaded HepG2 cells. Sequentialfluorescence i

54、mages are shown as green (Fcyto c-GFP), red (FTMRE) overlays. Depolarization appears as a loss of the red fluorescence, whereas cyto c release appears as a loss of the green fluorescence. Cyto c-GFP was expressed only in three cells that are shown in the upper right quadrant. Permeabilized cells wer

55、e pretreated with C2-ceramide (40 lM for 5 min) before addition of Ca2t (50 lM CaCl2) and, subsequently, tBid (25 nM). In the absence of C2-ceramide, a relatively small Ca2t-induced depolarization and no cyto c-GFP release were observed (not shown). The Ca2t- induced mitochondrial depolarization ini

56、tiated in discrete subcellular regions and propagated as waves through cells (direction of the wave is marked by the white arrow in the upper left image). Time courses of the fluorescence changes are plotted in the graph. 65662） MPTP-dependent intermitochondrial calcium signaling Ca2+ m the opening

57、of the MPTP release of the accumulated Ca2+ subsequently taken up by adjacent mitochondriaThis mechanism may result in a regenerative response that spreads throughout the entire mitochondrial population of the cell .Notably, MPTP-dependent intermitochondrial calcium signaling has been reported to re

58、cruit mitochondria to the apoptotic process .673. 线粒体钙与活性氧线粒体钙与活性氧活活性性氧氧分分子子ROS: 包包括括超超氧氧阴阴离离子子、过过氧氧化化氢氢和和羟羟自自由由基。基。线线粒粒体体是是细细胞胞产产生生ROS的的主主要要场场所所：complex ，Superoxide； Mn-SOD H2O2 or Superoxide + NO ONOO-ROS的的 产产 生生 与与 线线 粒粒 体体 内内 CaCa2+2+的的 聚聚 积积 有有 关关 : mito Ca2+MPTP开开 放放 mthem-dependent complex II

59、I-mediated ROS formation. mito Ca2+mNOSNO ONOO-ROS 细细胞胞损损伤伤：脂脂质质过过氧氧化化细细胞胞膜膜的的通通透透性性 细胞内细胞内Ca2+超载。超载。由由此此可可见见，线线粒粒体体内内Ca2+超超载载导导致致ROS产产生生，ROS又又促使细胞内促使细胞内Ca2+超载的发生。超载的发生。 6869References:1. Cell Calcium, 34 (2003) 399405:Ca2+ signalling in mitochondria: mechanism and role in physiology and pathology.2

60、. Cell Calcium, 40 (2006) 513525: Calcium microdomains in mitochondria and nucleus3. Journal of Physiology (2000), 529.1, pp. 5768: Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death70细胞内钙稳态与钙超载细胞内钙稳态与钙超载基本要求：基本要求：1.熟悉细胞内钙超载的发生与引起心肌缺血再灌熟悉细胞内钙超载的发生与引起心肌缺血再灌注损伤的机制。注损伤的机制。2.掌握线粒体内钙超载引起心肌缺血再灌注

61、损伤掌握线粒体内钙超载引起心肌缺血再灌注损伤的机制。的机制。3.了解细胞内钙稳态调节机制。了解细胞内钙稳态调节机制。71氧化磷酸化的偶联机制氧化磷酸化的偶联机制- 目前多数人支持化学渗透学说目前多数人支持化学渗透学说(chemiosmotic hypothesis)(chemiosmotic hypothesis)，其基本观点是：，其基本观点是： 1.1.线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放H+H+是偶联的，即呼是偶联的，即呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的内的H+H+逆浓度梯度泵出线粒

62、体内膜，这一过程的分子机理还逆浓度梯度泵出线粒体内膜，这一过程的分子机理还不十分清楚。不十分清楚。 2.H+2.H+不能自由透过线粒体内膜，在线粒体内膜两侧形成一个不能自由透过线粒体内膜，在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度质子跨膜梯度pHpH，内膜外侧，内膜外侧+ +，内膜内侧，内膜内侧- -，这就是跨膜电，这就是跨膜电位位。底物氧化过程中释放的自由能就储存于。底物氧化过程中释放的自由能就储存于和和pHpH中，若以中，若以P P表示总的质子移动力，那么表示总的质子移动力，那么P=-59pHP=-59pH 3.3.线粒体外的线粒体外的H+H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着可以通过线粒体内膜

63、上的三分子体顺着H+H+浓浓度梯度进入线粒体基质中，这相当于一个特异的质子通道，度梯度进入线粒体基质中，这相当于一个特异的质子通道，H+H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATPATP的合成，寡霉的合成，寡霉素能与素能与OSCPOSCP结合，特异阻断这个结合，特异阻断这个H+H+通道，从而抑制通道，从而抑制ATPATP合成。合成。有关有关ATPATP合成的分子机制目前还不十分清楚。合成的分子机制目前还不十分清楚。 4.4.解偶联剂的作用是促进解偶联剂的作用是促进H+H+被动扩散通过线粒体内膜，即增被动扩散通过线粒体内膜，即增强线粒体内膜对强线粒体内膜对H+H+的通透性，解偶联剂能消除线粒体内膜两的通透性，解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度，所以不能再合成侧的质子梯度，所以不能再合成ATPATP。 总之，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的总之，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是因素是H+H+的跨膜梯度。的跨膜梯度。 72活化的caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素c释放，使凋亡信号放大。 73