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1、丁肖华丁肖华 主要内容主要内容uABO血型鉴定血型鉴定uRhD血型鉴定血型鉴定u交叉配血试验交叉配血试验u红细胞抗体筛查及鉴定红细胞抗体筛查及鉴定u血型鉴定和交叉配血自动分析血型鉴定和交叉配血自动分析u吸收放散试验吸收放散试验教学目教学目标v掌握掌握ABO和和Rh血型鉴定、交叉配血试验原理、血型鉴定、交叉配血试验原理、方法和质量控制方法和质量控制v熟悉红细胞不规则抗体筛查及鉴定方法熟悉红细胞不规则抗体筛查及鉴定方法v了解吸收放散试验了解吸收放散试验一、一、ABO血型血型鉴定定v（一）盐水介质试管法（一）盐水介质试管法v（二）盐水介质玻片法（二）盐水介质玻片法v（三）微柱凝胶血型定型检测卡法（三
2、）微柱凝胶血型定型检测卡法v（四）质量保证：试管法、玻片法、卡式（四）质量保证：试管法、玻片法、卡式v（五）方法学评价（五）方法学评价v（六）临床应用（六）临床应用v（七）不一致原因及解决方法（七）不一致原因及解决方法ABO血型血型鉴定原理定原理正向定型：已知的特异性抗体（标准血清）检查红细胞的未知抗原正向定型：已知的特异性抗体（标准血清）检查红细胞的未知抗原反向定型：已知的血型的标准红细胞检查血清中的未知抗体反向定型：已知的血型的标准红细胞检查血清中的未知抗体A抗原抗原B抗原抗原A和和B抗原抗原无无A和和B抗原抗原抗抗A抗体抗体抗抗B抗体抗体抗抗A、抗、抗B抗体抗体无抗无抗A、抗、抗B抗体抗
3、体ABO血型血型鉴定定结果判断果判断正向定型（标准血清+被检者红细胞）反向定型（标准红细胞+被检者血清）结果判断抗A抗BA型红细胞B型红细胞O型红细胞+-+-A-+-B+-AB-+-OLOGO试管法试管法试管法结果判定试管法结果判定红细胞凝集强度判断标准红细胞凝集强度判断标准LOGO瓷板法瓷板法结果判定结果判定 凝胶技术的原理凝胶技术的原理反反 应应室室外管壁外管壁反反 应应室室 底底孔孔内内 套套管壁管壁凝胶或凝胶或玻璃珠玻璃珠亲亲和和凝凝胶胶试剂或试剂或盐水盐水特殊粘液特殊粘液凝胶技术的原理：凝胶技术的原理：A、反应室：下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微柱中。B、试剂或盐水层：红
4、细胞在离心力作用下穿越该层，红细胞与反应室中的血清分离并与该层液体中的试剂反应。C、粘液：亲和柱中有一层粘液，作用与“试剂或盐水层”相同。原理：凝胶分子筛和亲和效应微柱凝胶柱中填充凝胶（葡聚糖），及相应试微柱凝胶柱中填充凝胶（葡聚糖），及相应试剂（抗体或抗原）。凝胶分子间的间隙只允许游剂（抗体或抗原）。凝胶分子间的间隙只允许游离红细胞通过，分子排阻层析原则将发生凝集反离红细胞通过，分子排阻层析原则将发生凝集反应的红细胞阻滞于凝胶之内，而未凝集的游离红应的红细胞阻滞于凝胶之内，而未凝集的游离红细胞则穿过微孔运动到管底，从而判定有无凝集细胞则穿过微孔运动到管底，从而判定有无凝集反应。反应。 结果判
5、定结果判定新乡医学院第三临床检验教研室微孔板法微孔板法（四）（四）质量保量保证v试管法管法标记加加样量、加量、加样顺序序溶血是一种阳性反溶血是一种阳性反应玻片法玻片法标记正定型正定型显微微镜阴性确阴性确认v微柱凝胶血型定型微柱凝胶血型定型检测卡卡血清血清标本本应完全取出完全取出纤维蛋白，血蛋白，血浆标本建本建议EDTA-K2或枸或枸橼酸酸盐康宁康宁先加先加红细胞胞悬液，再加血液，再加血浆或抗体或抗体试剂红细胞胞悬液和血液和血浆各加各加50ul按照按照说明明书操作操作（四）质量保证（四）质量保证（五）方法学（五）方法学评价价试管法试管法：常用，广泛，较玻片法灵敏，结果准确，反应时间短，：常用，广
6、泛，较玻片法灵敏，结果准确，反应时间短，结果不能保存，人为因素大结果不能保存，人为因素大玻片法玻片法：操作简单、无需特殊仪器，适用于血型普查；灵敏度差，：操作简单、无需特殊仪器，适用于血型普查；灵敏度差，反应时间长，不能用于反定型，结果不能保存，人为因素影响大，反应时间长，不能用于反定型，结果不能保存，人为因素影响大，易发生血液污染易发生血液污染微柱凝胶血型定型检测卡法微柱凝胶血型定型检测卡法：特异性强、灵敏度高，结果准确，：特异性强、灵敏度高，结果准确，保持时间长，标本和试剂用量少，操作可以标准化、自动化，减少保持时间长，标本和试剂用量少，操作可以标准化、自动化，减少了医源性污染，但需要专门
7、离心设备和试剂卡，成本较高了医源性污染，但需要专门离心设备和试剂卡，成本较高u输血治疗的首要步骤输血治疗的首要步骤u组织器官移植组织器官移植u新生儿溶血病新生儿溶血病ABO正反定型的正反定型的临床意床意义ABO正反定型不符分析基本程序正反定型不符分析基本程序u首先重复试验首先重复试验u重新采集献血者与受血者血液标本重新采集献血者与受血者血液标本u查询受血者既往病史及输血史和用药史等查询受血者既往病史及输血史和用药史等u多次洗涤标本红细胞多次洗涤标本红细胞u应用抗应用抗-AB-AB、抗、抗-A-A1 1、抗、抗-H-H检测红细胞检测红细胞错加试剂或标本错加试剂或标本技术和技术和操作操作受血者受血
8、者红细胞红细胞或血清或血清ABO正反定型不一致的原因正反定型不一致的原因试剂失效或污染试剂失效或污染细胞与血清间细胞与血清间比例不适当比例不适当溶血现象未能识溶血现象未能识别别漏加试剂漏加试剂结果记录或判断错结果记录或判断错误误血清异常血清异常红细胞致敏红细胞致敏近期输血近期输血疾病导致抗原疾病导致抗原减弱减弱抗体减弱抗体减弱不规则抗体不规则抗体年龄年龄近期进行大量近期进行大量血浆置换治疗血浆置换治疗RhD定型及其常定型及其常见问题1.Rh1.Rh定型定型RhDRhD定型，试管法最经典，多使用微柱凝胶卡定型，试管法最经典，多使用微柱凝胶卡2.2.RhD阴性确认阴性确认IgM抗抗-D阴性阴性三个
9、厂家三个厂家IgGIgG抗抗- -D进行进行确认确认抗人球蛋白法进行确认抗人球蛋白法进行确认三种三种IgG抗抗-D试剂均为阴性，报试剂均为阴性，报RhD阴性阴性一种或一种以上一种或一种以上IgG抗抗-D试剂为阳性，报弱试剂为阳性，报弱D概念：检测受血者和供血者血液中是否含有不概念：检测受血者和供血者血液中是否含有不相配合的成分，是输血前确保受血者输血安全相配合的成分，是输血前确保受血者输血安全必不可少的试验必不可少的试验包括：主侧配血和次侧配血包括：主侧配血和次侧配血主侧是受血者血清与供血者红细胞相配的一侧主侧是受血者血清与供血者红细胞相配的一侧次侧是受血者红细胞与供血者血清相配的一侧。次侧是
10、受血者红细胞与供血者血清相配的一侧。三、交叉配血三、交叉配血试验交叉配血的主次侧交叉配血的主次侧（一）（一）盐水介水介质交叉配血交叉配血试验v本质凝集反应，直接凝集试验本质凝集反应，直接凝集试验v检测检测IgMIgM类抗体类抗体v方法：试管法方法：试管法vABOABO同型配血，主侧和次侧均无凝集及溶血，同型配血，主侧和次侧均无凝集及溶血，表示无输血禁忌，可以输血表示无输血禁忌，可以输血 盐水介水介质配血方法配血方法患患者者献献血血者者主主侧侧次次侧侧离心离心看结果看结果阳阳性性阴阴性性（二）（二） 抗球蛋白介抗球蛋白介质交叉配血交叉配血试验抗人球蛋白试验：又称抗人球蛋白试验：又称CoombsC
11、oombs试验，是一种检试验，是一种检查不完全抗体的敏感方法查不完全抗体的敏感方法分类：直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验分类：直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验抗球蛋白试验原理抗球蛋白试验原理vCoombsCoombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。v直接试验：是检查被检红细胞上有无不完全抗体直接试验：是检查被检红细胞上有无不完全抗体v间接试验：是检查血清中游离的不完全抗体间接试验：是检查血清中游离的不完全抗体 直接直接Coombs试试验验抗人免疫球蛋白自身抗体间接
12、间接Coombs试验试验抗人免疫球蛋白同种异型抗体2不完全抗体可以不完全抗体可以结合在合在红细胞胞表面表面,但是不能和两个但是不能和两个红细胞胞同同时结合（致敏）。合（致敏）。3加入抗人球蛋白1红细胞彼此之间有一定的间距4抗人球蛋白可以同时和两个不完全抗体的FC段结合，从而把红细胞连接在一起抗人球蛋白交叉配血法示意图抗人球蛋白交叉配血法示意图 抗球蛋白配血方法抗球蛋白配血方法患患者者献献血血者者主主侧侧次次侧侧37 37水浴水浴30分钟分钟三洗三洗 抗球蛋白方法配血方法抗球蛋白方法配血方法加加抗抗球球蛋蛋白白离心离心看结果看结果阳阳性性阴阴性性结果判果判读v直接抗球蛋白直接抗球蛋白试验v阳性阳
13、性对照管照管凝集凝集，阴性阴性对照管照管不凝集不凝集，被被检管凝集，管凝集，判定判定为阳性阳性v阳性阳性对照照管凝集，阴性管凝集，阴性对照管不凝集，照管不凝集，被被检管不凝集，管不凝集，需要做阴性确需要做阴性确认后判定后判定结果果（无凝集的被（无凝集的被检管中加入管中加入IgG抗抗-D致敏致敏红细胞后离心，出胞后离心，出现凝集判阴性，否凝集判阴性，否则重新重新试验v阳性阳性对照管不凝集和（或）阴性照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，照管凝集，结果不果不可信不可信不发报告，分析原因重做告，分析原因重做v间接抗球蛋白接抗球蛋白试验v阳性阳性对照管呈照管呈现凝集凝集反反应，阴性阴性对照管照管未呈未呈现
14、凝集凝集反反应，被被检管呈管呈现凝集反凝集反应为阳性阳性结果，被果，被检者血清内者血清内含有抗体，如果自身含有抗体，如果自身对照无凝集，同种抗体；如果照无凝集，同种抗体；如果被被检者者结果阴性果阴性，被，被检者血清中未被者血清中未被查出意外抗体。出意外抗体。v阳性阳性对照管不凝集和（或）阴性照管不凝集和（或）阴性对照管出照管出现凝集，凝集，实验失失败。结果判果判读抗球蛋白试剂不纯抗球蛋白试剂不纯假阳性假阳性假阴性假阴性红细胞洗涤已凝集红细胞洗涤已凝集红细胞质量红细胞质量不抗凝标本不抗凝标本漏加试剂漏加试剂红细胞、血清红细胞、血清及试剂质量及试剂质量洗涤不充分洗涤不充分操作过程不连操作过程不连续
15、续离心过度离心过度红细胞过多或红细胞过多或过少过少血清浓度过大血清浓度过大孵育时间和温孵育时间和温度不当度不当前带现象前带现象间接抗球蛋白试验间接抗球蛋白试验盐水保存不当盐水保存不当红细胞直抗阳性红细胞直抗阳性（三）（三） 低离子聚凝胺介质交叉配血低离子聚凝胺介质交叉配血试验试验 是一种快速、简便、红细胞不完全抗体的方法是一种快速、简便、红细胞不完全抗体的方法多数多数IgGIgG抗体能够被检出，但抗体能够被检出，但IgGIgG抗抗-K-K抗体除外抗体除外汉族至今未发现汉族至今未发现K K抗原阳性，也未检出抗抗原阳性，也未检出抗-K-K抗体抗体聚凝胺介聚凝胺介质试验技技术v红细胞表面胞表面带有大
16、量的有大量的负电荷，荷，悬浮在浮在电解解质溶液中，会吸引大量阳离子，溶液中，会吸引大量阳离子，红细胞胞则被被扩散散的双的双层离子云所离子云所围绕，形成，形成zeta电位。位。红细胞表面胞表面电荷及其相互之荷及其相互之间的距离的距离原理原理v聚凝胺技聚凝胺技术首先首先利用低离子溶液（利用低离子溶液（LIM）降低介）降低介质的离子的离子强度，减少度，减少红细胞周胞周围的的电子云子云v再加入再加入聚凝胺溶液聚凝胺溶液，溶解后，溶解后产生很多正生很多正电荷，中荷，中和和红细胞表面胞表面带有的有的负电荷，荷，红细胞胞zeta电位降位降低，低，缩短短红细胞距离，胞距离，产生非特异性聚集生非特异性聚集v最后
17、加入最后加入悬浮液浮液，具有中和聚凝胺阳离子的作用，具有中和聚凝胺阳离子的作用，使正常使正常红细胞的非特异性凝集散开，特异性凝集胞的非特异性凝集散开，特异性凝集仍然存在仍然存在1 红细胞胞间有一定有一定间距距2 2 加入聚凝胺后，可以加入聚凝胺后，可以缩短红细胞之间的距离，缩短红细胞之间的距离，使其非特异性凝集使其非特异性凝集3 3 加入枸橼酸钠，可加入枸橼酸钠，可以中和聚凝胺以中和聚凝胺4 4 红细胞的非特异性红细胞的非特异性凝集消失凝集消失聚凝胺交叉配血技术示意图聚凝胺交叉配血技术示意图1聚凝胺聚凝胺枸橼酸钠枸橼酸钠1 红细胞上已有不完全胞上已有不完全抗体致敏抗体致敏2 2 加入聚凝胺后，
18、缩短红加入聚凝胺后，缩短红细胞之间的距离，让不完细胞之间的距离，让不完全抗体可以同时与两个红全抗体可以同时与两个红细胞结合使其特异性凝集细胞结合使其特异性凝集3 3 加入枸橼酸钠中和聚凝胺加入枸橼酸钠中和聚凝胺4由于不完全抗体的由于不完全抗体的结合，红细胞的特异结合，红细胞的特异性凝集不消失性凝集不消失聚凝胺交叉配血技术示意图2聚凝胺聚凝胺枸橼酸钠枸橼酸钠不完全抗体不完全抗体 聚凝胺聚凝胺(Polybrene)配血方法配血方法患患者者献献血血者者主主侧侧次次侧侧室温放置室温放置1 分钟分钟主次侧均主次侧均加聚凝胺加聚凝胺 聚凝胺聚凝胺(Polybrene)配血方法配血方法离离心心聚凝胺引起聚凝
19、胺引起红细胞非特红细胞非特异性凝集异性凝集阳阳性性阴阴性性主次侧均主次侧均加重悬液加重悬液看结果看结果注意事注意事项v不能使用含枸橼酸钠和肝素抗凝标本不能使用含枸橼酸钠和肝素抗凝标本v按比例加样，非特异凝集按比例加样，非特异凝集6060秒内观察结果秒内观察结果v出现不配合试验时，抗球蛋白重复，结果不一致时出现不配合试验时，抗球蛋白重复，结果不一致时以抗球蛋白试验结果为准以抗球蛋白试验结果为准v一般使用血清一般使用血清v对对KellKell系统检测不理想系统检测不理想v按照说明书按照说明书方法学方法学评价价v盐水介质法：适用于ABO血型交叉配血，操作简单、快速，不能检出不相配合的IgG类抗体v抗
20、球蛋白试验：结果准确，检测不完全抗体最可靠的方法，操作繁琐费事，试剂较贵v低离子聚凝胺介质法：应用广泛、快速、准确，可检测IgM、IgG类抗体，需特殊试剂，操作复杂。临床床应用用v可以发现ABO血型鉴定的错误，如A亚型v发现亚型配血不合的情况v发现其他血型抗体或不规则抗体四、四、红细胞抗体胞抗体筛查与与鉴定定临床输血技术规范 第四章第17条：“凡遇以下情况必须按全国临床检验操作规程有关规定做抗体筛选试验：1.交叉配血不合的； 2.对有输血史、妊娠史或短期内需接受多次输血者为什么要开展输血前的为什么要开展输血前的“抗体筛选抗体筛选”检检查查 1.目前已知红细胞有目前已知红细胞有3030个血型系统
21、个血型系统（近300个抗原）。红细胞抗原的多样性决定了抗体的多样性，检测抗A、抗B、抗D（ABO血型、Rh血型）可确保绝大多数病人的输血安全，但仍不能避免因血型不合（ABO、Rh血型以外）而引发的溶血。2.2.临床有的病人出现慢性（迟缓性）溶血反应，易忽视或引不起临床有的病人出现慢性（迟缓性）溶血反应，易忽视或引不起临床医师视。临床医师视。 （理论上讲，成年人每输（理论上讲，成年人每输1U1U的浓缩红细胞，在不丢失、不被破的浓缩红细胞，在不丢失、不被破坏（溶血）的前提下，应能提升坏（溶血）的前提下，应能提升Hb5-10g/L (0.5-1g/dl),Hb5-10g/L (0.5-1g/dl),
22、保持保持15-3015-30天。如果输天。如果输3-4U RBC3-4U RBC，病人，病人HbHb上升不到上升不到10g/L10g/L，或几天后，或几天后（1 1周内）周内）HbHb仍旧下降到原来水平，甚至更低。这种情况，就要仍旧下降到原来水平，甚至更低。这种情况，就要考虑是否有慢性溶血反应存在。）考虑是否有慢性溶血反应存在。）3.3.利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，充足的时间来选择利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，充足的时间来选择相配合的血，避免患者病情的延误。相配合的血，避免患者病情的延误。什么叫什么叫“不规则抗体筛查不规则抗体筛查”检查？检查？ 1.1.不规则抗体的含义：除不
23、规则抗体的含义：除ABOABO系统外，其它系统产生的系统外，其它系统产生的抗不符合抗不符合LandsteinerLandsteiner规则规则，称为不规则抗体或意外抗体，称为不规则抗体或意外抗体称为不规则抗体。如抗称为不规则抗体。如抗D D、抗、抗N N、抗、抗M M、jk-jk-抗体。抗体。 2.“ 2.“不规则抗体筛查不规则抗体筛查”的含义：用具备有临床意义的血的含义：用具备有临床意义的血型抗原的型抗原的O O型红细胞，检测病人血清（含多种抗体）；型红细胞，检测病人血清（含多种抗体）；如果出现聚集现象，则提示病人有不规则抗体存在，如果出现聚集现象，则提示病人有不规则抗体存在，可判为可判为“
24、抗体筛选抗体筛选”阳性。阳性。不不规则抗体的抗体的筛查和和鉴定定患者血清患者血清+试剂筛选红细胞胞S 盐水介水介质S 聚凝胺介聚凝胺介质S 抗人球蛋白介抗人球蛋白介质S 酶介介质法法筛选细胞要求筛选细胞要求v抗体筛选用红细胞悬液（抗体筛选用红细胞悬液（1#1#、2#2#、3#3#）v试剂红细胞必须含有下列抗原：试剂红细胞必须含有下列抗原：D,C,E,c,e,M,N,S,s,P1,Lea,Leb,K,k,Fya,FybD,C,E,c,e,M,N,S,s,P1,Lea,Leb,K,k,Fya,Fyb,Jka,Jka,和和JkbJkb，所选用的，所选用的2-32-3个个O O型红细胞的抗原型红细胞的
25、抗原还应是互补的，纯合子基因所表达的抗原更有还应是互补的，纯合子基因所表达的抗原更有利于相应抗体的检出利于相应抗体的检出不不规则抗体抗体鉴定定v不规则抗体筛查阳性后，进行抗体鉴定，明确抗体的类别v谱细胞与待检者血清反应，反应格局，抗体的特异性v谱细胞由广泛挑选并已详细检测血型抗原的8-16人份O型红细胞组成v一套谱细胞不可能对所有不规则抗体都进行鉴定的，鉴定困难时，更换厂商提供的谱细胞 六、吸收放散六、吸收放散试验 乙醚放散法乙醚放散法试试 验验 原原 理理操操 作作 步步 骤骤注注 意意 事事 项项临临 床床 应应 用用吸收试验吸收试验放散试验放散试验试试 验验 原原 理理试试 剂剂操操 作
26、作 步步 骤骤注注 意意 事事 项项临临 床床 应应 用用 加热放散法加热放散法试试 验验 原原 理理操操 作作 步步 骤骤注注 意意 事事 项项临临 床床 应应 用用吸收吸收试验原理原理待待检检红红细细胞胞已知已知效价效价的抗的抗A或或抗抗B血清血清吸收液吸收液已知抗原已知抗原的红细胞的红细胞滴定滴定比较吸收比较吸收前后血清中前后血清中抗体效价抗体效价红细胞上红细胞上有无相应有无相应抗原及其抗原及其强度强度间接判定待检间接判定待检红细胞血型红细胞血型及其亚型种类及其亚型种类热放散放散试验原理原理 待检待检红细胞红细胞分分型血型血清清物理条件物理条件的改变的改变（加热）（加热）抗体抗体待检待检
27、红细胞红细胞试试 剂剂红细胞红细胞确定抗体的确定抗体的种类和强度种类和强度判定待检判定待检红细胞上抗红细胞上抗原的型别原的型别放散放散凝集或凝集或致敏致敏乙乙醚放散放散试验实验原理原理受检者受检者血血 清清已知已知抗原抗原的红的红细胞细胞致敏致敏已致敏已致敏红细胞红细胞乙乙醚醚放散液放散液除去乙醚除去乙醚后鉴定后鉴定抗体抗体小小结l输血前免疫血液学检查 ABO、Rh血型定型、抗体筛查与鉴定、交叉配血l输血前免疫血液学检查检测技术 盐水法、抗球蛋白法、聚凝胺介质法、微柱凝胶介质l吸收放散小小测试1.检测不完全抗体的最好方法：A.酶介质法 B.低离子强度溶液试验 C.凝聚胺试验 D.人源盐水介质试
28、验 E.抗人球蛋白试验2.聚凝胺法对大多数血型系统敏感度高且操作简便快速，但应除外:A.Kell系统 B.Rh系统 C.Kidd系统 D.ABO系统 E.Lewis系统3.直抗试验中使用的阳性对照细胞可以是：A.IgG抗体致敏红细胞 B.Rh阳性红细胞 C.酶处理红细胞 D.IgM抗体致敏红细胞 E.Rh阴性红细胞 4.交叉配血的主要目的是:A.验证血型鉴定是否正确 B.可防止张冠李戴 C.验证标准血清是否有误 D.防止输血后产生溶血反E.发现其他血型抗体思考思考题vABO血型鉴定的方法有哪些？正反定型结果不一致的原因有哪些？如何解决？v交叉配血试验的方法有哪些，各方法的原理是什么？如何选择和评价？下次下次课内容内容v第三节 白细胞抗原系统v第四节 血小板血型系统v第五节 采供血机构及成分血制备Bye!Bye!
