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1、生物大分子的电子显微镜技术n关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类n研究生物大分子的意义：理化特性及空间构像与功能研究生物大分子的意义：理化特性及空间构像与功能n研究生物大分子的方法研究生物大分子的方法 物理化学方法探讨理化特性物理化学方法探讨理化特性 X X射线衍射技术分析结晶样品射线衍射技术分析结晶样品 电子显微镜的直接观察技术电子显微镜的直接观察技术核酸的电子显微镜研究技术核酸的电子显微镜研究技术n核酸的分类核酸的分类：n核小体核小体DNA 与蛋白质聚合一起构成的染色体的单位DNA 双链dsDNA、线性的， 超螺旋的，单链 ssDNARN
2、A 单链 ssRNA 、线性的，三叶草形的 双链dsRNA核酸分子电镜观察的要求核酸分子电镜观察的要求: :n核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展的长链核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展的长链; ;n核酸分子太细需要加粗；核酸分子太细需要加粗；n提高电子反差。提高电子反差。分子长度测量及计算分子长度测量及计算n对已知的标准分子进行观察和计算，完整的分子对已知的标准分子进行观察和计算，完整的分子的长度应相对一致。的长度应相对一致。n观察观察100100个以上的分子，拍像记录；个以上的分子，拍像记录；n矫正电镜放大倍数；矫正电镜放大倍数；n测量分子，测量分子，5020050200份单分子；份单分子；
3、n统计学方法计算平均值，作出长度分布图；统计学方法计算平均值，作出长度分布图；n用已知的标准分子进行对照测算用已知的标准分子进行对照测算n经验公式：经验公式：dsds 1um=2.07X10 1um=2.07X106 6DaDa s s 1um=1.20X10 s s 1um=1.20X106 6DaDa特点和应用n样品量少；操作简便；制备样品时间短。样品量少；操作简便；制备样品时间短。n适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量；的区分、根据长度计算核酸的分子量；n进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合进行异源双链分子分
4、析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；体、核酸蛋白质复合体等研究；n基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。的研究。蛋白质单分子展层操作n对核酸样品和试剂的要求：对核酸样品和试剂的要求：1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；2.核酸样品为新鲜制备核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性并尽量保持其长链的完整性;3.样品浓度在样品浓度在5ugml以上以上;4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其
5、他污染样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染;5.溶液的溶液的PH在在610之间之间;6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯电泳纯;7.所用试剂为分析纯所用试剂为分析纯,器具洁净器具洁净,无去污剂等残留无去污剂等残留;8.制备制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤样品的试剂与器具须高温烘烤,使使RNA酶失活酶失活.染色与投影n染色染色-增加核酸分子的电子密度增加核酸分子的电子密度 样品展层后样品展层后, ,粘取至铜网上粘取至铜网上, ,经过染色和金属投经过染色和金属投影以增强反差影以增强反差. . 染色液为染色液为12%12%的的PTA, (PTA, (用用90
6、%90%乙醇配制乙醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml的浓硫酸的浓硫酸) )或醋酸或醋酸双氧铀双氧铀, ,染色染色10301030秒后秒后. .自然晾干自然晾干. .n投影投影-使核酸细分子的直径加粗使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度染色后的样品以投影角度59,59,用铂用铂 钯合金进钯合金进行旋转投影行旋转投影, ,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜, ,以增加强度以增加强度. . 染色与投影n染色染色-增加核酸分子的电子密度增加核酸分子的电子密度 样品展层后样品展层后, ,粘取至铜网上粘取至铜网上, ,经过染色和金属投经过染色和金属投影以增强反差影以增强
7、反差. . 染色液为染色液为12%12%的的PTA, (PTA, (用用90%90%乙醇配制乙醇配制,100ml,100ml染液中含染液中含1ml1ml的浓硫酸的浓硫酸) )或醋酸或醋酸双氧铀双氧铀, ,染色染色10301030秒后秒后. .自然晾干自然晾干. .n投影投影-使核酸细分子的直径加粗使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度染色后的样品以投影角度59,59,用铂用铂 钯合金进钯合金进行旋转投影行旋转投影, ,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜, ,以增加强度以增加强度. . 电镜观察要求n染色，投影后，核酸分子的直径从染色，投影后，核酸分子的直径从20A增至增至80100A
8、，故在故在10万倍以下可以观察到；万倍以下可以观察到；蛋白质单分子膜展层技术的原理蛋白质单分子膜展层技术的原理n某些碱性蛋白质在低盐溶液或水的表面形成不溶性变某些碱性蛋白质在低盐溶液或水的表面形成不溶性变性薄膜，单浓度和加到溶液表面的量合适，该膜就展性薄膜，单浓度和加到溶液表面的量合适，该膜就展开成为单分子层，也就是一个多肽链构成的分子网。开成为单分子层，也就是一个多肽链构成的分子网。如果将核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上的氨基酸如果将核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上的氨基酸碱性基团便与核酸分子链上的酸性基团以水合键结合，碱性基团便与核酸分子链上的酸性基团以水合键结合，核酸分子相对稳定地固着在
9、蛋白质分子上。展层时，核酸分子相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时，核酸分子随着蛋白质在溶液表面的展开而被拉开伸展核酸分子随着蛋白质在溶液表面的展开而被拉开伸展为弯曲的二维结构。由于蛋白质单分子膜作基础，使为弯曲的二维结构。由于蛋白质单分子膜作基础，使核酸分子保持完整性，经捞网，染色，金属投影，电核酸分子保持完整性，经捞网，染色，金属投影，电镜观察。镜观察。特点和应用n样品量少；操作简便；制备样品时间短。样品量少；操作简便；制备样品时间短。n适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链的区分、根据长度计算核酸的分子量；的区分、根据长度计算核酸的分子量；n进行
10、异源双链分子分析、分子杂交、转录复合进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合体、核酸蛋白质复合体等研究；体、核酸蛋白质复合体等研究；n基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面的研究。的研究。蛋白质单分子展层操作n对核酸样品和试剂的要求：对核酸样品和试剂的要求：1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份；2.核酸样品为新鲜制备核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性并尽量保持其长链的完整性;3.样品浓度在样品浓度在5u
11、gml以上以上;4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染;5.溶液的溶液的PH在在610之间之间;6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯电泳纯;7.所用试剂为分析纯所用试剂为分析纯,器具洁净器具洁净,无去污剂等残留无去污剂等残留;8.制备制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤样品的试剂与器具须高温烘烤,使使RNA酶失活酶失活.样品配制样品配制n醋酸铵法醋酸铵法:上相液组成上相液组成:醋酸铵醋酸铵 (终浓度终浓度)0.52Mol(PH7.5) 核酸样品核酸样品 0.51ugml 总体积总体积50ul 细胞色素细胞色素C 0
12、.050.1mgml下相下相液液:0.050.25M醋酸铵水溶液或双蒸水醋酸铵水溶液或双蒸水甲酰铵法甲酰铵法:上相液组成上相液组成:Tris-Na3EDTA(PH8.5) 0.10.01M 核酸样品核酸样品 0.51ugml 细胞色素细胞色素C 0.050.1mgml 甲酰铵甲酰铵 4050%下相液下相液:0.1MTris0.01MNa3EDTA(PH8.5),20%甲酰铵甲酰铵.展层方法及步骤展层展层1.样品溶液样品溶液(上相溶上相溶液液)2.展层液展层液(下相溶液下相溶液) 3.滑石粉滑石粉 4.载玻片载玻片 5.加样器加样器12345.沾沾网网:将铜网的膜面朝下将铜网的膜面朝下,沾取液面
13、上的样品沾取液面上的样品脱水与染色脱水与染色铜网以铜网以45角插入角插入无水乙醇片刻无水乙醇片刻,进进行脱水行脱水,以同样方以同样方法在法在2%PTA中染色中染色金属投影金属投影:在真空喷镀仪中在真空喷镀仪中对样品进行重金对样品进行重金属旋转投影属旋转投影.微滴扩散法及单滴展开法适合微量样品的操作适合微量样品的操作,单滴展单滴展开法的展层样品液只需开法的展层样品液只需510ul,操作方法与展层方法相同操作方法与展层方法相同,可可用用16孔酶标板代用展层容器孔酶标板代用展层容器一步释放法一步释放法 病毒，噬菌体等含核酸的细胞器，不进行提取核酸，病毒，噬菌体等含核酸的细胞器，不进行提取核酸，利用展
14、层上相利用展层上相液液（2M2M醋酸铵），下醋酸铵），下相相液液（0.2M醋酸铵醋酸铵或水溶液）或水溶液）盐浓度的巨大差异，高盐中的病毒遇到低渗盐浓度的巨大差异，高盐中的病毒遇到低渗溶液而破裂，核酸分子溶液而破裂，核酸分子释放，并与细胞色素释放，并与细胞色素CC结合，随结合，随着单分子层展开，因此，释放与展层在一步完成着单分子层展开，因此，释放与展层在一步完成染色与投影n染色染色-增加核酸分子的电子密度增加核酸分子的电子密度 样品展层后样品展层后, ,粘取至铜网上粘取至铜网上, ,经过染色和金属投经过染色和金属投影以增强反差影以增强反差. . 染色液为染色液为12%12%的的PTA, PTA,
15、 ( (用用90%90%乙醇配制乙醇配制,100,100mlml染液中含染液中含1 1mlml的浓硫酸的浓硫酸) )或醋酸或醋酸双氧铀双氧铀, ,染色染色10301030秒后秒后. .自然晾干自然晾干. .n投影投影-使核酸细分子的直径加粗使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度染色后的样品以投影角度59,59,用铂用铂 钯合金进钯合金进行旋转投影行旋转投影, ,或再加喷一薄层碳膜或再加喷一薄层碳膜, ,以增加强度以增加强度. . 电镜观察要求n染色，投影后，核酸分子的直径从染色，投影后，核酸分子的直径从20A增至增至80100A，故在，故在10万倍以下可以观察到；万倍以下可以观察到；n
16、样品不进行投影，只染色，分子的直径大小样品不进行投影，只染色，分子的直径大小改变不大，在视野中很难寻找。改变不大，在视野中很难寻找。无蛋白展层法n用蛋白质单分子展层技术，核酸分子被细胞用蛋白质单分子展层技术，核酸分子被细胞色素色素CC覆盖，再经染色和投影，分子的直径从覆盖，再经染色和投影，分子的直径从100A100A，不适合观察酶或蛋白质与核酸的复，不适合观察酶或蛋白质与核酸的复合体，与核酸结合的蛋白质组分被细胞色素合体，与核酸结合的蛋白质组分被细胞色素CC覆盖，故建议用无蛋白展层技术。覆盖，故建议用无蛋白展层技术。1.1.BACBAC法法 : :用铵盐类低分子化合物氯化烃基二甲基苄基用铵盐类
17、低分子化合物氯化烃基二甲基苄基铵代替细胞色素铵代替细胞色素C,C,能在下相液表面形成一层膜吸附核能在下相液表面形成一层膜吸附核酸酸, ,投影后投影后. .核酸分子直径为核酸分子直径为4060A.4060A.2.2.加染料法加染料法: :如溴乙啶、二碘丙啶加到如溴乙啶、二碘丙啶加到DNADNA的溶液中的溶液中,DNA,DNA分子吸附到云母片上分子吸附到云母片上, ,进行复型、投影进行复型、投影. .RNA的展层技术从一种非洲蛙的卵母细胞核中提取的DNA的8个基因片段。5SDNA5SDNA的部分变性的部分变性杂交重复分子X174的DNA,长度约1.8 m的环状DNA(双链DNA)病毒病毒DNADNA在细菌中复制时，蛋白质结在细菌中复制时，蛋白质结合在病毒合在病毒DNADNA的特别部分，也就是的特别部分，也就是DNADNA复制的开始点。复制的开始点。能够看到大肠杆菌染色体能够看到大肠杆菌染色体的二个片段，下边一个是的二个片段，下边一个是活动中的。可以看到活动中的。可以看到mRNAmRNA的转录和蛋白质的翻译过的转录和蛋白质的翻译过程。程。基因上的RNA聚合酶杂交的杂交的DNADNA分子分子 二条二条DNADNA分子分子 经过变性、退火处理形成缺失环和经过变性、退火处理形成缺失环和 置换泡置换泡昆虫病毒的核酸分子展层图
