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1、实验五 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.1.目的要求目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。 2.2.基本原理基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg 60年代初期，Averameas & Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血清白蛋白及酸性磷
2、酸酯酶-抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)免疫标记技术免疫标记技术应
3、用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术酶标技术戊二醛法， 过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物（黄色，
4、OD450)+H2O图一直接型图一直接型Elisa 图二间接型图二间接型Elisa图三图三 双抗体夹心型双抗体夹心型ELISA图四图四 固相抗体竞争型固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反应后都要反复洗涤？1.保证反应的定量反应2.防止重叠反应，引起非特异现象。Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA plate部分纯化，灭活病毒抗原抗原涂到酶标板Patient serum which contains antibodies. If the patient
5、is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+，那么这个血清含有艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结
6、合人类抗体 substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体 HIV (human immunodeficiency virus) detectionpositivenegativeProtein protein interaction-ELISA1. Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab ant
7、i bait protein -直接酶联免疫吸附试验不同表位外套与猎物蛋白孵化与诱饵蛋白原发性抗体抗诱饵蛋白2.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein(竞争同一表位。外套与诱饵蛋白培养初级抗体抗诱饵蛋白及不同浓度的猎物蛋白)4. 4. 操作方法操作方法4.1 4.1 包包被被特特异异性性抗抗原原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Og/ml，每凹孔加100L，加盖置4过夜(
8、37 2h)，次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加34滴，静置3min后倾去，重复3次，将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2 4.2 封封闭闭: 每孔中加入200400L封闭液，加盖或用封口膜封板，置37恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。4.3 4.3 加待加待测测血清血清( (内含抗体内含抗体) )、阴性血清、阴性血清( (无抗体无抗体) )及稀及稀释释液液( (PBS/PBS/TweenTween) ):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOL加至
9、相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。12345678PBS/Tween1:100阴性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:20,0001:50,0001:100,000阳性血清4.4 4.4 加加酶酶标标抗抗体体:按说明书要求用稀释液稀释HRP-抗体(抗抗体)，每孔加l00L，封板后置37温育lh，按上法至少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。4.5 4.5 显显色色: 每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处530min。当显示橙色时应及时终止反应。4.6 4.6 终终止止反反应应:每孔加入5OL 2
10、mol/L H2SO4。稳定35min即可比色测定。4.7 4.7 检测检测: 用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为49Onm时各孔光吸收（A）。1.计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，当P/N2.1时为阳性，P/N2.1而1.5为可疑，P/N1.5为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。2.用“”“”表示，超过规定吸收值（0.20.4）的标本均属阳性。 注意事项注意事项 (1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1100g之间，在偏碱条件下易吸附于反应板的凹
11、孔中，4放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02% NaN3，4贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3个月以上不影响测定效果。 (2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。 (3)为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反应35min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。 (4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。自动酶标仪（自动酶标仪（Elx800UVElx800UV）使用程序使用程序1 开机，进行System self-test2 按“D
12、EFINE”键，进入“SELECT ASSAY NUMBER”， 用“NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay 01 为quick read，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”键选择阅读方式(Auto或Manual) 、阅读方向（Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起始位置（输入编号）、空白Map（Air、Ful
13、l、Const、Column、P-Down、P-Across）。 3 按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打印机输出数据。 4 按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。 酶标板的清洗：酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗 了解了解转转膜膜电电泳原理的泳原理的应应用及操作用及操作Western Blotting or immunoblotting a specific primary antibody1979, Towbin1975, Southern, Southern blotting1977, Alwine,
14、Northern blotting1979, Towbin, Western Blotting 1982, Reihart, Eastern blotting ,双向蛋白质印记Western blotting: Antibodies can be used to detect specific proteinsAlternate detection method Secondary antibodies Memebrane: 吸附生命大分子的固体材料NC, nitrocellulose 硝酸纤维素膜 0.45um 结合率：80 ug Pr/cm2 便宜，可简单快速封闭非特异性抗体的结合NDM,
15、 nylon-densed membrane 尼龙膜 结合率：480 ug Pr/cm2DBM, diazobenzyloxymethyl 重氮苄氧甲基膜湿法转移蛋白质：将gel 和membrane 夹在blotter paper 中，浸在转移装置的buffer中，通电45min 或over night 可完成。Transfer Buffer (500 ml, pH 8.3)Transfer Buffer (500 ml, pH 8.3) glycine 1.450 g (39 mM) Tris base 2.900 g (48 mM) SDS 0.185 g (0.037%)Using th
16、e Semi-Dry Transfer Unit 1.Remove the stacking gel from the gel. 去除堆积凝胶的凝胶。2.Cut pieces of blotter paper to the size of the gel. note: the blotter paper (and the membrane) not be larger than the gel. Larger pieces may make contact around the gel, and allow the current an alternate route, thereby mak
17、ing transfer inefficient. 裁片的记事簿纸张的大小的凝胶。 注：本记事簿纸（和膜）不大于凝胶。大块的可能使接触周围的凝胶，并允许目前的替 代路线，从而使传输效率。3. Wearing gloves rinsed of powder, cut a piece of membrane to the size of the gel. Mark the lower right-hand corner to allow for orientation. Pre-wet the membrane in transfer buffer for 2 to 5 minutes. 戴手套清
18、洗粉，剪下一块膜大小的凝胶。标记右下角以便方向。湿膜转移缓冲液为2到5 分钟。4. sandwich blotter paper membrane- gel- blotter paper make sure no air bubbles are trapped The membrane must therefore be positioned correctly the first time. Do not try to adjust.三明治吸墨纸纸膜凝胶-记事簿纸确保没有气泡被困膜因此必须正确定位第一时间。不要试图调整。5. Hold the cover level and slide it
19、 gently down onto the stack. 持有的封面和滑动它轻轻地放到堆栈6. weigh down the lid in order to ensure even contact with the stack.权衡下来的盖子，以确保即使接触堆栈。7. Connect the unit to a suitable power supply. Turn the power supply to zero before turning on. Turn on the power supply and set to approximately 0.8 mA/cm2 of gel. La
20、rger gels must be limited to 0.8 mA/cm2 to avoid excessive heat build up. 。 连接到一个合适的电源供应装置。 打开电源供应零之前打开。打开电源并设定约0.8毫安/ 厘米 2凝胶。 较大的凝胶必须被限制在0.8毫安/厘米 2避免过度生热。8 mm x 7 mm mini-gels at 100 mA. Molecular WeightMolecular WeightTransfer PeriodTransfer Period80,00045 minutesProblem：蛋白质转移效率低？（转移后对凝胶或膜染色进行观察）1.transfer buffer中加入20甲醇或加入终浓度为0.1%SDS, 可增加膜结合蛋白质的能力；2.使用小孔径的硝酸纤维素膜3.转移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45min。丽春红S， 染色后可继续进行免疫检测 灵敏度低氨基黑印度墨水生物素增强胶体金膜总蛋白质染色12泳道进行膜总蛋白质染色检测转移效率免疫检测 灵敏度 辣根过氧化物酶：1020pg 碱性磷酸酶：1050pg 免疫金：125pg 125I: 50100pg放射自显影术：将含放射性同位素置X感光胶片上感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带
