第八章微生物的遗传和变异

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1、第七章微生物的遗传与变异第七章微生物的遗传与变异v理想的工业用微生物菌种须具备：理想的工业用微生物菌种须具备：v遗传性状稳定；遗传性状稳定；v生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；v目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；v目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；离；v尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；利于分离；v培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉

2、；v对温度、对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；v对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。微生物的独特生物学特性微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简单；个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；菌落形态特征的可见性和多样性；（7）易于形成营养缺陷型

3、；易于形成营养缺陷型；v微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象研究对象。v对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学现代分子生物学和和生物工程学生物工程学的发展，而且的发展，而且为为育种工作育种工作提供了丰富的理论基础，促使育提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。发展。研究微生物遗传学的意义研究微生物

4、遗传学的意义第一节遗传变异的物质基础第一节遗传变异的物质基础遗传遗传(heredity)： 亲代生物的性状在子代亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。特点：具稳定性。变异变异(variation):生生物物体体在在外外因因或或内内因因的的作作用用下下，遗遗传传物物质质的的结结构构或或数数量量发发生生改变。改变。变变异异的的特特点点：a.在在群群体体中中以以极极低低的的几几率率出出现现，（一一般般为为10-610-10）；b.形形状状变变化化的的幅幅度度大大； c. 变变化化后后

5、形形成成的的新新性性状状是是稳稳定定的的，可可遗遗传的。传的。遗传遗传和变异是生物体的遗传和变异是生物体的最本质的属性之一最本质的属性之一1928年，年，Griffith进行了以下几组实验：进行了以下几组实验：（1）动物实验）动物实验对小鼠注射活对小鼠注射活RII菌或死菌或死SIII菌菌 小鼠存活小鼠存活对小鼠注射活对小鼠注射活SIII菌菌小鼠死亡小鼠死亡对小鼠注射活对小鼠注射活RII菌和热死菌和热死SIII菌菌 小鼠死亡小鼠死亡抽取心血抽取心血 分离分离活的活的SIII菌菌一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验v（一）经典转化实验（一）经典转化实验（

6、transformation）：）：v研究对象：研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）肺炎双球菌）vSIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性vRII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性Griffith转化试验转化试验示意示意混合培养混合培养RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌SIII型热死菌型热死菌RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死病死病死病死（2）细细菌菌培培养养实验实验（3）S型菌的无细胞抽提液试验型

7、菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型型细胞并使细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型型细胞。细胞。热死热死SIII菌菌不生长不生长活活 RII 菌菌长出长出RII菌菌热死热死SIII菌菌长出大量长出大量RII菌和菌和10-6SIII菌菌活活R菌菌+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R菌和菌和少量少量S菌菌+活活RII菌菌平皿培养平皿培养（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验vA

8、. D. Hershey和和M. Chase， 1952年年（1）含）含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性以以32S标标记记蛋蛋白白质质外外壳壳做做噬噬菌菌体体感感染染实实验验v（2）含）含35S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在上在上清液中清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空

9、壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验v为了证明核酸是遗传物质为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含用含RNA的烟草花叶病毒的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。进行了著名的植物病毒重建实验。v将将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后核心相分离。分离后的的RNA在没有蛋白质包裹的

10、情况下，也能感在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。能分离出正常病毒粒子。第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种vv一、基因突变一、基因突变vv突变（突变（ mutation ）：）：指生物体的表型突然指生物体的表型突然发生的可遗传的变化发生的可遗传的变化。v突变体突变体（mutant）：）：发生了突变的微生物细发生了突变的微生物细胞或菌株胞或菌株v野生型（野生型（wild type）：）：从自然界分离到的任从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株何微生物在其发生突变前的原始菌株诱

11、诱变变育育种种：是是用用物物理理或或化化学学的的诱诱变变剂剂使使诱诱变变对对象象内内的的遗遗传传物物质质（DNA）的的分分子子结结构构发发生生改改变变，引引起起性性状状变变异异并并通通过过筛筛选选获获得得符符合合要要求求的的变变异异菌菌株的一种育种方法。株的一种育种方法。 l诱诱变变育育种种具具有有极极其其重重要要的的实实践践意意义义。当当前前发发酵酵工工业业和和其其他他微微生生物物生生产产部部门门所所使使用用的的高高产产菌菌株株，几几乎乎毫毫无无例例外外地地都都是是通通过过诱诱变变育育种种而而明明显显提提高高其其生生产性能的。产性能的。二、二、诱变育种育种 诱变育种的步骤育种的步骤：原始菌种

12、原始菌种纯化化斜面斜面/肉肉汤培养培养单孢子子/单细胞胞悬液液诱变剂处理理平板分离平板分离移至斜面移至斜面小小试中中试初初筛复复筛计算存活率算存活率观察形察形态变异，异，挑挑单菌落菌落良种保藏良种保藏原菌种特性原菌种特性鉴定定诱变育种的基本过程：诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株选择选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液诱变处理诱变处理筛选筛选保藏和扩大试验保藏和扩大试验1.出出发菌株的菌株的选择：出出发菌株菌株用来用来育种处理的育种处理的起始菌株起始菌株出出发菌株菌株应具具备： 对诱变剂的敏感性高；的敏感性高； 具有特定生具有特定生产性状的能力或潜力；性状的能力或潜力

13、； 出出发菌株的来源；菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株：自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生生产考考验的菌株：的菌株： 已已经历多次育种多次育种处理的菌株：理的菌株：2.制备细胞悬液要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）;方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。 制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml3.诱变处理：诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异

14、的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）诱变处理方式：理方式： 单一因子一因子处理：理： 复合因子复合因子处理：理： 两种以上因素两种以上因素先后使用先后使用 同同时使用使用 单一因子重复使用一因子重复使用4. 菌种菌种筛选4.1 筛选方案：方案：实际工作中，工作中，为了提高了提高筛选效率，往往将效率，往往将筛选工作分工作分为初初筛和复

15、和复筛两步两步进行。行。初初筛的目的：的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状性状类似的菌株尽量保留下来，使似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不良性状的菌株不至于漏网；至于漏网；因此，初因此，初筛工作以量工作以量为主，主，测定的精确定的精确性性还在其次；初在其次；初筛手段手段应尽可能快速、尽可能快速、简单。复复筛的目的：确的目的：确认符合要求的菌株；符合要求的菌株；复复筛以以质为主，主，应精确精确测定每个菌株的生定每个菌株的生产指指标。筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.可可见，设计和采用效率高的和采用效率高的筛选方案和方法方案和方法极其重要。极

16、其重要。以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选出50株株选出选出5株株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株 选出选出50株株 选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株） 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出生的一些合成能力出现缺陷，而必缺陷，而必须在培养基内加入相在培养基内加入相应有机养分才能正常生有机养分才能正常生长的的变异菌异菌株。株

17、。如：如：lys -， bio- 野生型野生型：自然界分离到的任何微生物，在其自然界分离到的任何微生物，在其发生生营养缺陷养缺陷突突变前的原始菌株，前的原始菌株，为该微生物的野生型。微生物的野生型。 如：如：lys + ; bio + ;原养型原养型 ：指指营养缺陷型突养缺陷型突变菌株回复突菌株回复突变或重或重组后后产生的生的菌株，与野生型的表型相同。菌株，与野生型的表型相同。 4.2营养缺陷型营养缺陷型(auxotroph)的筛选的筛选与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基基本培养基基本培养基（MM）：）：凡是能凡是能满足野生型菌株足野生型菌株营养要求养

18、要求的的最低成分的最低成分的合成培养基合成培养基。 完全培养基完全培养基（CM）：）：满足一切足一切营养缺陷营养缺陷型型菌株菌株生生长的天然或半的天然或半合成合成培养基。培养基。 补充培养基充培养基（SM）：）：在在MM中有中有针对性地加入一性地加入一或几种或几种营养成分以养成分以满足相足相应营养缺陷营养缺陷型型菌株菌株生生长的的合成合成培养基。培养基。 缺陷缺陷型型的浓缩：的浓缩：抗生素法抗生素法原原理理：青青霉霉素素、制制霉霉菌菌素素等等抗抗生生素素作作用用于于生生长着着的的微微生生物物细胞胞，对休休止止态细胞无作用。胞无作用。 方方法法：将将菌菌培培养养在在含含抗抗生素的生素的MM基中基

19、中菌菌丝过滤法法u适用于：适用于：丝状（放状（放线菌、霉菌、霉菌）菌） u原理：原理：基本培养基上只有基本培养基上只有发育成菌育成菌丝；auxo孢子可通子可通过滤膜，野生型菌膜，野生型菌丝不能通不能通过。逐个检出法：逐个检出法：缺陷缺陷型型的检出：的检出： 影印平板培养法影印平板培养法夹层培养法培养法生生长谱法法方法方法简便；便； 回回变和和污染不影响染不影响 结果果 测定物定物质可可为粉末粉末 或或纸片片 缺陷型缺陷型的鉴定的鉴定：测定一般应分两阶段：测定一般应分两阶段：第第一一阶阶段段：测测定定是是哪哪类类物物质质的的缺缺陷陷型；型；第第二二节段段：根根据据第第一一阶段段确确定定的的范范围

20、，进一一步步确确定定是是哪哪种种具具体体化化合合物物的的缺陷缺陷型；型；缺陷型缺陷型的应用的应用作作为菌株的菌株的遗传标记：进行基因工程、行基因工程、诱变育种、育种、研究代研究代谢过程程时用作用作亲本本标记；作作为生生产菌种：菌种：aa、核苷酸等生核苷酸等生产菌种；菌种； 作作为aa、维生素、碱基的生素、碱基的测定菌株。定菌株。第三节第三节 细菌的基因重组细菌的基因重组v定义：定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（

21、gene recombination）或遗传重组。或遗传重组。v作用：作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。的个体。v重组与杂交的关系：重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交上的杂交而一般所说的杂交而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、

22、准性杂交真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。甲甲生生长快、快、产量低量低乙乙生生长慢、慢、产量高量高基因重基因重组如：如：生生长快、快、产量高量高细菌的基因重组v基因重组的方式基因重组的方式转化转化转导转导接合接合原生质体融合原生质体融合 R型型活菌活菌+S型死菌型死菌 S型活菌型活菌定义：定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的

23、游离的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为体菌称为转化子（转化子（transformant）。）。有关名词：有关名词：受体菌：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者转化基因的接受者供体菌：供体菌：donor，转化基因的提供者转化基因的提供者转化因子：转化因子：来自供体菌的来自供体菌的DNA片段片段转化子转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色将转化基因重组进入自身染色体组的重组子体组

24、的重组子（一）转化（一）转化（transformation）1、转化及其发现：、转化及其发现： 受体细胞要处于感受态受体细胞要处于感受态.感受态感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外受体细胞能从环境吸取外源源DNA片段并实现其转化的一种生理状态片段并实现其转化的一种生理状态供体供体DNA片段（片段（转化因子转化因子）大小适宜，分子量一大小适宜，分子量一般为般为1 107 D 左右左右 菌株间的亲缘关系密切菌株间的亲缘关系密切2、转化发生的条件：、转化发生的条件： 3、转化的类型：、转化的类型：根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化自然遗传转化natural genetic

25、transformation人工转化人工转化artificial transformation转化因子转化因子：v转化因子：本质是供体转化因子：本质是供体DNA片段片段一般的转化因子都是线状双链一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认也有少数报道认为线状单链为线状单链DNA也有转化作用。也有转化作用。大小：经过多次提纯操作后，每一转化大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分片段的分子量都小于子量都小于1107，即约占细菌核染色体组的，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含其上平均约含15个基因。而粗制的个基因。而粗制的DNA则分子量较大。则分子量较大。. 转化的过程转化的

26、过程v以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，分为六阶段：以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，分为六阶段：v吸附吸附：双链：双链DNA片段与细胞表面的特定位点（主要片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合。在吸附过程的前在新形成细胞壁的赤道区）结合。在吸附过程的前阶段，如外界加入阶段，如外界加入DNA酶，就会减少转化子的产生。酶，就会减少转化子的产生。稍后，稍后，DNA酶即无影响，说明此时该转化因子已进酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞；入细胞；v切割切割：在吸附位点上的：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形被核酸内切酶分解，形成平均分子量为成平均分子量为45106的的DNA片段；

27、片段；v入胞入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞。这时如用低浓酶切除，另一条单链逐步进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；提高转化频率；v重组重组：来自供体菌的单链：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，发生交换、体细胞核染色体组上的同源区配对，发生交换、整合和取代，形成杂合整合和取代，形成杂合DNA区段区段（heterozygous region）。）。v复制复制：受体菌的染色体组进行复

28、制，杂合区段分：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；另一个未获供体基因；转化子形成转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。始受体菌一样。. 转化的过程转化的过程降解降解吸附吸附切割成切割成45106单链入胞单链入胞同源部同源部分配对、分配对、整合整合复制分裂，只复制分裂，只有一个子代有一个子代DNA分子获得分子获得供体基因供体基因非转化子非转化子转化子转化子转化的过程转

29、化的过程strrstrr人工转化人工转化人工转化人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将的能力，或人工地将DNA导入细胞内。导入细胞内。方法：方法：CaCl2处理处理细胞，使其成为能摄取外源细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状的感受态状态态.电穿孔法电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括或击成小孔，使各种大分子（包括DNA ）能通过这些能通过这些小孔进入细胞。小孔进入细胞。-Try-his+Try+his-Try+his+混合培养AB二、转导二

30、、转导（transduction）J.Lederberg等（等（1952）在）在Salmonella typhimurium（鼠鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。伤寒沙门氏菌）中发现的。 1.转导及其发现转导及其发现AB-Try+his+Try-his+Try+his-定义：定义：以温和以温和噬菌体噬菌体为媒介，将供体媒介，将供体细胞的胞的DNA片段携片段携带到受体到受体细胞中，通胞中，通过交交换与整合，从而与整合，从而使后者使后者获得前者部分得前者部分遗传性状的性状的现象，称象，称为转导。获得新得新遗传性状的受体性状的受体细胞，称胞，称转导子。子。2.转导的种类转导的种类 完全普遍转导完全普遍转导

31、普遍转导普遍转导 流产普遍转导流产普遍转导 转导转导 低频转导低频转导 局限转导局限转导 高频转导高频转导过程：过程：供体菌供体菌 正常噬菌体正常噬菌体 + + 完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体 少量裂解物少量裂解物 + + 大量受体菌大量受体菌 遗传稳定的转导子遗传稳定的转导子（1） 普遍性转导（普遍性转导（generalized transduction）v定定义义：通通过过完完全全缺缺陷陷噬噬菌菌体体对对供供体体菌菌任任何何DNADNA小小片片段段的的“误误包包”而而实实现现其其遗遗传传性性状状传传递递至至受受体体菌菌的的转转导导现现象象，称称为为普遍性转导普遍性转导。v1.11.1完完全全

32、( (普普遍遍性性) )转转导导：complete complete transductiontransduction。19521952年年发发现现，在在Salmonella Salmonella typhimuriumtyphimurium中中存存在在转转导导现现象象。在在它它的完全普遍性转导实验中：的完全普遍性转导实验中：v以其野生型菌株作为供体菌以其野生型菌株作为供体菌v营养缺陷型菌株作为受体菌营养缺陷型菌株作为受体菌vP22P22噬噬菌菌体体作作为为转转导导媒媒介介，对对供供体体菌菌是是烈烈性性噬噬菌菌体体，对对受体菌是温和噬菌体受体菌是温和噬菌体完全普遍转导完全普遍转导噬菌体裂解第一

33、个宿主时可能有三种情况：噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1 1）包入的完全是噬菌体的）包入的完全是噬菌体的DNADNA（正常噬菌体正常噬菌体）2 2）包入的完全是细菌）包入的完全是细菌DNADNA（完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体）3 3）部分带有噬菌体基因的）部分带有噬菌体基因的DNADNA（部分缺陷噬菌部分缺陷噬菌体体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。噬菌体裂解第一个宿主噬菌体裂解第一个宿主一个稳定的转导子的形成一个稳定的转导子的形成1.第一次交换2.第二次交换3.交换完成，外源DNA掺入染色体组中1.2流产普遍性转导（流产普遍性转导（aborti

34、ve transduction）v概念：概念：受体菌经转导获得的供体受体菌经转导获得的供体DNA片段在片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达）速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为，这种现象就称为流产转导流产转导。v现象：现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，酶，在表型上表现出轻微的供

35、体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释每经过一次分裂，就受到一次稀释。流产转导示意图流产转导示意图所以，能在选所以，能在选择性培养基平择性培养基平板上形成微小板上形成微小菌落就是流产菌落就是流产转导的特点。转导的特点。2. 局限性转导局限性转导v定义定义：通过：通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。现象。v特点特点：v噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体v只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬

36、菌体整合位点两侧的基因）位点两侧的基因）v该特定基因由该特定基因由部分缺陷的噬菌体部分缺陷的噬菌体携带携带v缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约（约10 5）“误切误切”，或由于，或由于双重溶源菌双重溶源菌的裂解而形的裂解而形成（约形成成（约形成50%缺陷噬菌体）缺陷噬菌体）比较项目比较项目普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导转导的基因转导的基因供体染色体或染色供体染色体或染色体外的任何基因体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生噬菌体寄生的位置的位置不结

37、合在寄主染色不结合在寄主染色体特定位置上体特定位置上结合在寄主染色体特定位置结合在寄主染色体特定位置上上获得转导噬获得转导噬菌体的方法菌体的方法通过敏感菌的裂解通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌紫外线诱导容源菌转导子的区转导子的区别别一般稳定，非溶原一般稳定，非溶原性（不表现出任何性（不表现出任何噬菌体的性状，包噬菌体的性状，包括免疫性）括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性但不表现出其它噬菌体的性状）状）普遍性转导和局限性转导的比较普遍性转导和局限性转导的比较三、接合（三

38、、接合（conjugation）v定义：供体菌（定义：供体菌（“雄雄”）通过其性菌毛与受体菌）通过其性菌毛与受体菌（“雌雌”）相接触，前者传递不同长度的）相接触，前者传递不同长度的DNA给后给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。性状的现象，称为接合。v通过接合而获得新性状的受体细胞就是通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子接合子（conjugant）v研究方法：研究方法：1946年年J.Lederberg等采用等采用E.coli的

39、两株的两株营养缺陷型进行实验，奠定了营养缺陷型进行实验，奠定了方法学基础方法学基础；也为以；也为以后的微生物遗传学提供了必要的条件。后的微生物遗传学提供了必要的条件。接合接合两个亲本细胞通过直接接触来转移遗传物质的基两个亲本细胞通过直接接触来转移遗传物质的基因重组方式。因重组方式。通过接合而获得新性状的受体细胞就是通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合接合子（子（conjugant）1946年用年用E.coli的两个营养缺陷型所作的实验：的两个营养缺陷型所作的实验：Met+bio+thr+leu+Met-bio-thr+leu+Met+bio+thr-leu-Met.bio.thr.leu-混

40、合培养离心洗涤后1、接合及其发现、接合及其发现ABAB-过滤器U型管实验：型管实验：接合：接合： 供体与受体供体与受体细胞直胞直接接触，借性菌毛接接触，借性菌毛传递DNA，在受体在受体细胞中胞中发生交生交换、整合，使之、整合，使之获得供体菌的得供体菌的遗传性状的性状的现象，称象，称为接合。通接合。通过接合而接合而获得新性状的受得新性状的受体体细胞就称接合子。胞就称接合子。F因子的存在方式因子的存在方式根据根据F因子在因子在E. coli中的有无，及与染色体的关系，中的有无，及与染色体的关系，可将可将E. coli分为四种类型：分为四种类型： F （“雌性雌性”）菌株：）菌株：细胞中不含有细胞中

41、不含有F因子，因子，细胞表面不具有有性纤毛。细胞表面不具有有性纤毛。可可以以通通过过与与F+、F或或Hfr菌菌株株接接合合而而接接受受供供体体菌菌的的F因因子子、 F因因子子或或Hfr菌菌株株的的部部分分或或全全部部遗遗传传信信息息，相相应应地可以转变成地可以转变成F+菌株、菌株、 F菌株或重组子。菌株或重组子。据据估估计计，从从自自然然界界分分离离到到的的2000株株E. coli中中约约有有30%是是F菌株。菌株。 F+（“雄性雄性”）菌株：）菌株：细胞内含有（细胞内含有（14个）游离的个）游离的F因子，因子，细胞表面存在与细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。因子数目相当的性菌毛。与与F

42、 相相接接触触时时，可可通通过过性性菌菌毛毛将将F因因子子转转移移到到F 细细胞胞中中，使使之之也也变变成成F+菌菌株株。 F因因子子以以很很高高的的频频率率传传递递，但但含含F因因子子的的宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体DNA一一般般并并不被转移。不被转移。F+ F F+ F Hfr（高频重组，高频重组，high frequency recombination）菌株：菌株：含有与染色体特定位点整合的含有与染色体特定位点整合的F因子。因子。因因该该菌菌株株与与F 接接合合后后的的重重组组频频率率比比F+ 菌菌株株高高几几百百倍倍而而得名。得名。Hfr菌菌株株与与F菌菌株株接接合合时时，Hfr染

43、染色色体体双双链链中中的的一一条条单单链链在在F因因子子处处发发生生断断裂裂，F因因子子位位于于线线状状单单链链DNA的的两两端端，整整段段单单链链线线状状染染色色体体从从5端端开开始始等等速速进进入入F细细胞胞，在在没没有有外外界界干干扰扰的的情情况况下下，全全部部转转移移过过程程的的完完成成需需要要约约120分分钟钟。由由于于种种种种原原因因DNA转转移移过过程程常常会会发发生生中中断断，所所以以越越是是前前端端的的基基因因进进入入F 细细胞胞的的机机会会越越大大。F因因子子位位于于线线状状DNA的的末末端端，进进入入受受体体细细胞胞的的机机会会最最小小，故故这这种种接接合合引引起起转转性

44、性的的频频率率最最低低，但但可可以以出出现现各各种种重重组子。组子。Hfr F H fr + F （在大多数情况下）在大多数情况下） Hfr F H fr + Hfr （在极少数情况下）在极少数情况下）F菌株：菌株：细细胞胞中中含含有有游游离离的的、带带小小段段染染色色体体基基因因的的环环状状F因因子子，可可与与F 菌株接合，使其成为菌株接合，使其成为F菌株。菌株。F菌菌株株的的形形成成：由由Hfr菌菌株株中中的的F因因子子在在不不正正常常切切离离而而脱脱离离核核染染色色体体组组时时所所形形成成，并并因因此此造造成成细细胞胞染染色色体体发发生生缺缺失失， F因因子子也缺失一段也缺失一段DNA.

45、F因因子子转转导导F-mediated transduction: 利利用用F菌菌株株与与F接接合合可可将将供供体体染染色色体体DNA传传入入F 菌菌株株，从从而而使使F 既既获获得得供供体体菌菌的的若若干干遗遗传传特特性性，又又可可获获得得F因因子子。这这种种接接合合方方式式叫叫做做F因因子子转转导导,又又称称性性导导sexduction. 因因为为F因因子子可可在在细细菌菌的的染染色色体体多多位位点整合，所以点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。因子转导可实现不同基因的转移和重组。F F F + FF因子转导（因子转导（F-duction）：）：v通过通过F菌株与与菌株与与F菌

46、株间的接合，就可以使后者菌株间的接合，就可以使后者转变成转变成F菌株。它是一个菌株。它是一个部分双倍体部分双倍体，具有一个，具有一个不完整的不完整的F因子，缺少部分基因，仍可进行与因子，缺少部分基因，仍可进行与F菌株间的接合。菌株间的接合。v由由F因子来传递供体基因的方式，称为因子来传递供体基因的方式，称为F因子转导因子转导、性导性导或或F因子媒介的转导。因子媒介的转导。四、原生质体融合四、原生质体融合protoplast fusionv概念：概念：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性体发生融

47、合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（状的遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质的过程，称为原生质体融合。体融合。v适用范围：适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。胞。v意义：意义：70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还

48、能做到属间、科间甚合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。v发展点：发展点：有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中。目前还在探索中。l原生质体融合的优点：原生质体融合的优点： 可以提高重组率可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量通过原生质体融合提高产量 原生质体融合的主要步骤：原生质体融合的主

49、要步骤：v选择亲株选择亲株制备原生质体制备原生质体原生质体融合原生质体融合 原原生质体再生生质体再生筛选优良性状的融合重组子筛选优良性状的融合重组子一、菌种的衰退与复壮的概念一、菌种的衰退与复壮的概念1.1.衰退（衰退（degenerationdegeneration） ：菌种在培养或保藏过菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。菌种的衰退。衰退的原因：衰退的原因：基因突变，基因突变，分离现象。分离现象。常见的衰退现象：常见的衰退现象：菌

50、落和细胞形态的改变；菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少；生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；第四节第四节 菌种的衰退、复壮及保藏菌种的衰退、复壮及保藏2、 菌种的复壮菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种使衰退的菌种恢复原来优良性状。恢复原来优良性状。狭义的复壮狭义的复壮狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找下，通过纯种分离和生产性能测定等方

51、法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义广义广义广义的复壮的复壮的复壮的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种菌种的复壮措施：菌种的复壮措施：纯种分离：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。）。 通过寄主体内生长进行复壮通过寄

52、主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。3、防止菌种衰退的方法：、防止菌种衰退的方法： 控制传代次数控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件；选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； 采用有效的

53、菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。二、菌种保藏：二、菌种保藏：1.原理：原理：挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃的休眠状态以达保持纯种的目的。的休眠状态以达保持纯种的目的。2.目的目的：存活，不丢失，不污染存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种随时为生产、科研提供优良菌种不杂、不乱、不杂、不乱、不衰、不退不衰、不退3、方法：、方法：斜面低温保藏法斜面低温保藏法原理：低温原理：低温方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上

54、方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至生长完适温培养至生长完全全4冰箱保藏冰箱保藏每隔一段时间移接一次每隔一段时间移接一次说明：说明：适于生产和科研中经常采用的菌种；适于生产和科研中经常采用的菌种； 保藏时间：保藏时间： 霉霉 4个月个月 酵酵46个月个月 放放 3个月个月 细细 12个月个月 培养基应少含或不含糖分（尤以细菌）培养基应少含或不含糖分（尤以细菌） 试管密封以隔绝空气试管密封以隔绝空气优：方法简单，成活率高优：方法简单，成活率高缺：保存时间短，传代次数多，易变异。缺：保存时间短，传代次数多，易变异。v石蜡油封藏法石蜡油封藏法v原理：低温、缺氧原理：低温、缺氧v方法：将无菌石

55、蜡油注入生长良好的斜面种试管方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内（油量高出斜面内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱包扎后竖直放入冰箱保藏。保藏。v说明：说明：液体石蜡于液体石蜡于170干热灭菌干热灭菌1h。v 斜面培养基能干燥则保藏效果好。斜面培养基能干燥则保藏效果好。v 保藏时间保藏时间12年。年。v 适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆菌。菌。v 能同化烃类的微生物不宜用此法。能同化烃类的微生物不宜用此法。v砂土管保藏法砂土管保藏法v原理：干燥、缺氧原理：干燥、缺氧v方法：取河砂若干，方法：取河砂若干，24目过筛目过筛10%HCl浸泡浸泡24h

56、水洗至中性水洗至中性烘干后分装安瓿瓶或试管，烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞加棉塞1kg/cm、23分钟分钟无菌检查无菌检查每管加孢每管加孢子悬液，接种环拌匀子悬液，接种环拌匀干燥器中干燥干燥器中干燥火焰熔封火焰熔封或蜡封或蜡封干燥器中保藏干燥器中保藏v说明：说明：适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌v 时间时间210年年真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法v原理：低温、干燥、真空（缺氧）原理：低温、干燥、真空（缺氧）v方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接冷冻

57、，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。升华为水蒸汽，以达干燥的目的。v常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖v说明：说明：目前最有效的保藏方法。目前最有效的保藏方法。v 适于细、放、酵、霉、病毒的保存。适于细、放、酵、霉、病毒的保存。v 保存时间保存时间120年。年。v 存活率高、变异率低，但手续麻烦，且需一定设备条件。存活率高、变异率低，但手续麻烦，且需一定设备条件。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（温冰箱中（ -

58、196）。）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 v菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。便于研究、交换和使用的目的。v菌种保藏机构菌种保藏机构菌种保藏机构菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTC

59、） 法国里昂巴斯德研究所（法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：国内外菌种保藏机构：几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较方法名称方法名称主要措施主要措施适宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评评价价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法冰箱保藏法（半固体）（半固体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺氧干燥、无营养干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂各大各大类类细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类36月月612月月12年年110年年515年

60、年以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便有效有效简便简便有效有效思考题思考题v1、试比较转化、转导、结合现象。、试比较转化、转导、结合现象。v2、普遍性转导和局限性转导有何区别？、普遍性转导和局限性转导有何区别？v3、 F+、 F 、 F和和Hfr菌株有何区别？菌株有何区别？v4、什么叫诱变育种？其主要步骤有哪些？、什么叫诱变育种？其主要步骤有哪些？v5、什么是基因工程？其基本操作步骤是什么？、什么是基因工程？其基本操作步骤是什么？v6、何谓菌种退化、复壮？如何防止菌种退化？、何谓菌种退化、复壮？如何防止菌种退化？v7、简述常用菌种保藏方法和原理。、简述常用菌种保藏方法和原理。v8、解释名词、解释名词v 转化转化 转导转导 接合接合 野生型野生型 v 营养缺陷型营养缺陷型 基本培养基基本培养基 完全培养基完全培养基