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1、菠萝蛋白酶粗提液的菠萝蛋白酶粗提液的凝胶过滤凝胶过滤层析层析一、实验目的一、实验目的l理解和掌握凝胶过滤层析技术原理和实验操作步骤。二、实验原理二、实验原理层析层析以基质为固定相，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。种类：柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析常用术语固定相流动相床体积，Vt洗脱体积，Ve外水体积，Vo内水体积，Vi基质体积，Vg凝胶过滤凝胶过滤利用具有一定孔径的多孔凝胶作为固定相，把分子大小不同的物质分离开的层析技术，又称为分子筛。凝胶的类型有葡聚糖凝胶（商品名为SephadexSephadex）、聚丙烯酰
2、胺凝胶、琼脂糖凝胶等。 葡聚糖凝胶用得最多，它是-1，6葡聚糖与1-氯-2，3-环氧丙烷反应交联而成的 ，有不同型号的凝胶。 凝胶的吸水能力与凝胶的交联度关系密切。G表示交联度，G后面的数字是凝胶吸水量（ml/g干胶）乘以10所得的值。交联度越大，G值小，网状结构致密，颗粒内孔径越小，吸水值小，分辨率高，分级范围窄，机械性能好。交联度越小，G值大，网状结构疏松，颗粒内孔径越大，吸水值大，分辨率低，分级范围宽，机械性能不好。三实验设备三实验设备: :层析柱(2x20cm)、恒流泵、自动部分收集器、水浴锅、751-紫外分光光度计四实验试剂四实验试剂1、Sephadex G75（葡聚糖G75）2、柱
3、层析试剂0.1M PBS 3000 ml pH7.83、测酶活试剂： （1）1%酪蛋白300 ml ：（2）激活剂 300 ml ：（3）5%TCA（三氯乙酸）400 ml4、酶液浓缩 （1）用实验一的透析袋。 （2）PEG（聚乙二醇）6000 五实验步骤五实验步骤1.1.凝胶的预处理凝胶的预处理凝胶（干粉）必须使用前在过量的溶剂中充分吸胀，一般多为dH2O、盐溶液或buffer，放置室温较长时间，使之充分吸胀。用倾斜法出去混杂的小颗粒，重复3到4次，以防止粉末等物质塞住胶孔。加热100溶胀，不同交联度，时间不同，G50需2小时，可杀死细菌和霉菌，且可排除凝胶内包藏的气泡。2.2.柱的选择柱的
4、选择 柱的直径与长度之比，一般为1:251:1003.装柱装柱1、垂直安装好层析柱，筛板不能留有气泡。2、先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将糊状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降；3、待其自然沉降至柱高的1/4时，打开出水口，使上端液面缓慢下降至需要的高度；4、将层析柱与洗脱液连接，让2-3倍柱体积的洗脱液流过固定相，使其平衡。5、调节流速，每管4ml，每6min收集1管。4.加样加样吸出床上方多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下
5、口夹子。按加样操作，用1 ml洗脱液冲洗管壁2次。最后加入34 ml洗脱液于凝胶上，盖上盖子，柱进水口连通恒流泵，柱出水口与部分收集器相连。6.洗脱洗脱以4ml/管，每6min收集1管的速度收集，同时检测280nm吸收值，直至数值由0达到最大值再到0，结束收集，约2025管。7.7.蛋白检测和酶活测定蛋白检测和酶活测定用紫外分光光度计测各管的A280A280数值高的管进行酶活测定A275把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液浓缩到12ml，用吸管把酶取出，-10保存，留到下次电泳实验用。8.8.实验完毕，玻棒搅动实验完毕，玻棒搅动G75，加少量缓，
6、加少量缓冲液，倒回烧杯冲液，倒回烧杯总的实验流程总的实验流程装柱（装柱时,柱内留10 ml 的水,倒入Sephadex G75，要求Sephadex G75均匀，大约1.5h） 调节流速4mL/管/6分（注意：恒流泵的转速不能太高）加样:约58ml收集管（收集2025管）用紫外分光光度计测各管的A280A280数值高的管进行酶活测定：按下表进行，其中，以一管作为对照。把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液浓缩到23mL，用吸管把酶取出，留到下次电泳实验用。 把Sephadex G75倒到烧杯中 清洗干净层析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管试剂对照(调
7、零)试管1TCA(ml)1%酪蛋白 (ml)酶液(ml)激活剂(ml)310.10.910.10.937 水浴 10minTCA(ml) 3静置5min ，滤纸过滤A275 酶活单位(U) 酶活单位：酶活单位：在上述条件下(37,酶促反应10min)，每10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。实验结果试 管12345678910A280 A275 酶活(U) 11121314151617181920A280 A275 酶活(U) 21222324252627282930A280 A275 酶活(U) 六实验结果分析六实验结果分析1、做好实验数据原始记录；2、绘出洗脱峰；3、学生对该实验提出些可行性的意见。
