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1、心肌纤维化相关生物标志物心肌纤维化：是指心肌组织中细胞外基质过量沉积，胶原浓度和胶原容积(CVF)显著增加，各型胶原比例失调以及排列紊乱。什么是心肌纤维化心肌纤维化心肌纤维化(myocardialfibrosis(myocardialfibrosis，MF)MF)胶原容积胶原容积(collagenvolumefraction(collagenvolumefraction，CVF)CVF)心肌纤维化在多种心血管疾病中存在，与高血压病、心肌梗死及心力衰竭、风湿性心脏病、心房颤动、糖尿病性心肌病变等疾病相关，是心源性猝死的潜在危险因素。心肌纤维化的危害生物标志物：一般指循环中反映生物体系与环境因子相
2、互作用引起的生理、生化、免疫和遗传等多方面分子水平改变的物质。什么是生物标志物一个好的生物标志物具备检测方法简易、提供更多临床信息、指导临床诊疗等特征。通过对血液中某些生物标志物的检测，可望实现对心肌纤维化的早期发现、早期干预。由此，研究和发现心肌纤维化的生物标志物已成为热点关注的科学问题生物标志物已成为热点关注的科学问题根据纤维化的机制，将相关的标志物大致分四类:(1)胶原合成相关标志物；(2)胶原降解相关标志物；(3)胶原代谢相关细胞因子；(4)胶原基因转录相关的MicroRNA心肌纤维化的生物标志物检测心肌组织中胶原浓度和胶原容积是界定心肌纤维化的金标准。一、胶原合成相关的胶原代谢产物心
3、脏的细胞外基质(ECM)主要由I、III型胶原纤维组成，还有少量IV型、V型、VI型胶原。I型约占心肌胶原总数80%，纤维粗，有较大僵硬度和很强的抗牵拉性；III型约占11%，纤维较细，伸展性和弹性大，保持室壁弹性；心肌胶原分5种细胞外基质细胞外基质(extracellular matrix(extracellular matrix，ECM)ECM)心肌纤维化过程中心脏成纤维细胞增殖并向肌成纤维细胞表型转化，合成过量胶原等ECM成分，同时ECM降解减少。成纤维细胞表型转化后，表达数种特异性平滑肌标记性分子，如-平滑肌肌动蛋白(-SMA)、平滑肌22(SM22)、平滑肌肌球蛋白重链胚胎型(SMe
4、mb)以及原肌凝蛋白，从血中检测以上指标可能发掘新的心肌纤维化标记物。胶原合成异常与心肌纤维化在生理情况下，只有小部分的前肽胶原被用来维持已有的胶原结构，大部分的前胶原肽被合成和分泌后，迅速降解，一些包含胶原蛋白前肽的氨基或羧基末端片断在此过程中被释放入血。胶原合成胶原代谢的循环标志物水平被认为是I、III型胶原合成的间接标志。目前循环中可测定的胶原肽段成分包括，I型前胶原氨基端肽(PINP)：反映I型胶原合成速率。I型前胶原羧基端肽(PICP)，I型胶原羧基端肽(ICTP)：反映I型胶原降解速率。III型前胶原氨基端肽(PIIINP)：综合反应III型胶原转换。循环中可测定的胶原肽段成分Qu
5、erejeta等(2000)提出ICTP为心肌纤维化的标志物。动物实验证明，循环中胶原代谢的循环标志物与心肌纤维化明显相关。活检发现，ICTP与心脏局部I、III型胶原的沉积显著相关，可作为体内心肌纤维化的非侵入性评估方法。Querejeta等(2004)通过对高血压性心脏病病人的研究发现，I型胶原合成和沉积增加促进高血压心衰患者的心肌纤维化，心脏分泌磷脂酰肌醇磷酸经冠状窦入外周血循环，从人群水平证明外周血指标可作为心肌纤维化的标志物。胶原代谢的循环标志物与心肌纤维化明显相关Martos等证实舒张性心力衰竭患者ICTP、PINP、PIIINP水平升高，血清学证据提示此类患者的细胞外基质胶原代谢
6、水平增加，且在舒张功能不全严重的患者中纤维化程度更显著。仅仅通过胶原代谢产物血清学相关指标还不足够诊断心肌纤维化血清胶原代谢相关产物在肝脏、肺脏、肾脏等脏器纤维化时同样表达升高，曾有研究把ICTP、PIIINP作为肝纤维化的标志物。胶原代谢的循环标志物与心肌纤维化明显相关基质金属蛋白酶(MMPs)是参与降解细胞外基质的最重要酶系，也包括降解基质胶原的作用，分为四大类20多个成员；组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)是MMPs的内源性特异性抑制物，分为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。二、胶原降解相关的基质金属蛋白酶系及其抑制物基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶(metrix me
7、talloproteinase(metrix metalloproteinase，MMPs)MMPs)组织金属蛋白酶抑制物组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)TIMPs)基质金属蛋白酶( MMP) 是一组锌离子依赖性内肽酶，包括多个结构相似、能够消化基质和基膜的酶，目前至少已确定了18 种。根据结构域及酶与底物亲和力的不同分为胶原酶明胶酶间质溶解酶膜型金属蛋白酶。MMP 表达下调和酶激活过度受抑，可能参与了许多表现为ECM 过多沉积的病理
8、过程( 如动脉粥样硬化、多种结缔组织疾病和重要脏器纤维化形成过程等) 。此外，细胞外基质金属蛋白酶诱导物( EMM-PRIN) ，具有诱导MMP 基因表达的作用。基质金属蛋白酶浅论基质金属蛋白酶与心肌纤维化MMP 主要以酶原的形式分泌到细胞外，需经过蛋白酶的水解才能活化，已发现MMP 有3 种不同的激活方式，第一种是细胞外由血清蛋白酶所介导，即通过丝氨酸蛋白酶( 如血清酶、胰蛋白酶、尿激酶等) 分解酶原，使金属蛋白酶中半胱氨酸序列的Zn-Cys 断裂而具有部分活性，再通过别的金属蛋白酶如MMP-3 进一步分解，形成具有完全活性的MMP; 第二种是原生质膜上由膜型MMP 所介导，这一机制被认为在
9、细胞转移、降解细胞周围基质过程中起着重要作用;第三种是细胞内激活。文献也证实MT-MMP 也存在着细胞内激活，但其机制有待进一步研究。MMP 的激活方式浅论基质金属蛋白酶与心肌纤维化心肌缺血及梗死导致神经体液异常，刺激心肌细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞合成分泌MMPs。MMPs被丝氨酸蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽及组织蛋白酶G等激活后降解基质胶原，使心肌失去基质胶原支持并出现排列紊乱。血清及心肌MMPs活性增加与心室重构、左心室扩大有相关性(Yan等.2005，Yamazaki等.2004)。心力衰竭晚期，神经体液调节异常激活MMPs，介导炎症因子活化，刺激成纤维细胞、内皮细胞合
10、成及分泌基质物质，释放入血；且MMPs引起TIMPs反应性增加。TIMPs抑制MMPs，使胶原、血清透明质酸及层粘连蛋白等间质物质降解减少；细胞外间质物质堆积增加，并释放入血，使外周血中胶原、血清透明质酸及层粘连蛋白等间质物质浓度进一步增加。基质金属蛋白酶的功能Batlle等(2007)比较特发性扩张型心肌病重症心力衰竭患者和心脏移植供者的心脏，发现前者MMP-2的表达水平和心脏纤维化水平相关，提示MMP-2可能参与了充血性心力衰竭患者的心脏纤维化全过程。Martos等进一步证实舒张性心力衰竭的患者中MMP-2和MMP-9水平较对照组升高，舒张功能不全较严重的患者TIMP水平越高，而血清学证据
11、提示舒张性心力衰竭患者的ECM胶原代谢水平增加，二者结果相匹配，说明其预测纤维化作用与胶原代谢产物相当。基质金属蛋白酶预测纤维化作用各类细胞因子、炎症因子和氧化应激均可能促进成纤维细胞增殖、合成大量胶原，导致纤维化，而细胞纤维化可以促进细胞因子的分泌。目前研究主要集中在以下几种。(一)结缔组织生长因子(CTGF)(二)转化生长因子(TGF-)(三)血小板衍生生长因子(四)炎症因子三、胶原代谢相关细胞因子CTGF是在1991年，首先由Bradham等在血小板衍生生长因子的诱导下，从人脐静脉内皮细胞cDNA文库中克隆得到的，具有细胞因子特性。CTGF是高度保守的CCN(connective-tis
12、sue-growth-factor，cysteine-rich protein-61，nephroblastoma-over-expressed)多肽家族成员，促进成纤维细胞分裂和胶原沉积，与多种器官纤维化的发生发展关系密切。(一)结缔组织生长因子(CTGF)Dean等(2005)在大鼠心梗模型中发现CTGF mRNA和蛋白表达高峰出现在心肌梗死后180天，表达部位在存活的心肌组织，提示CTGF可能主要与后期的心脏纤维化有关。Ahmed等(2004) 在AngII致心肌纤维化模型发现CTGF起关键作用，通过AT1受体阻滞剂则可以下调TGF-1的表达而改善纤维化程度。CTGF与心脏纤维化相关Ko
13、itabashi等在舒张性心功能不全MF改变的研究中发现，严重MF和舒张性心力衰竭使心肌细胞的CTGF表达异常增多。Koitabashi在2008年提出可以用血浆中CTGF的水平作为心力衰竭的标志物。研究发现，血浆CTGF水平与血浆BNP、TGF-、MMP2和TIMP-2相关。尽管CTGF在全身均有表达，不能作为心肌纤维化特异标志物，但它可以作为一种纤维化预后和器官受损的标志物。大量的横断面研究和前瞻性研究都已经证实了CTGF作为心肌纤维化标志物的价值。CTGF：纤维化预后和器官受损的标志物TGF-与心肌纤维化密切相关。TGF-参与调节成纤维细胞的增殖、转化、迁移和细胞外基质的产生。NAD(P
14、)H氧化酶通过调节Smad2/3的活化来介导TGF-1诱导人心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，从而在心肌纤维化起重要作用。Dean等在大鼠心梗模型中，发现TGF-1mRNA和蛋白表达在心肌梗死后1周升高最明显，主要表达在梗死灶的边缘区域及瘢痕形成处，此种不同时间及心脏不同部位表达的差异性提示TGF-1主要参与心肌梗死急性期炎性反应和损伤修复。(二)转化生长因子(TGF-)近年新发现的生长分化因子-15(GDF-15)是TGF-超家族成员之一，参与心血管疾病的发生发展过程，在心肌急性缺血和缺血-再灌注损伤、心肌肥厚及心力衰竭等病理过程中表达水平增高，发挥保护性作用。目前临床资料提示它与胶原代谢相
15、关，故可能成为一个新的预测或减少心肌纤维化的重要因子。GDF-15 与心肌纤维化PDGFs是一种促进成纤维细胞及血管平滑肌细胞有丝分裂和趋化的细胞因子。PDGFs高表达导致心肌纤维化的发生(Ponten等.2005)。通过对靶基因敲减或过表达研究(Zymek等.2006)等发现，PDGFs致心肌纤维化主要通过活化其受体酪氨酸激酶，起动第二信使级联放大作用，以自分泌和旁分泌的形式与其它生长因子协同作用，如TGF-1。PDGFs在体内还可以改变纤维母细胞的形态，诱导胶原的合成与增殖。(三)血小板衍生生长因子(PDGFs)血小板衍生生长因子血小板衍生生长因子(platelet derived gro
16、wth factors(platelet derived growth factors，PDGFs)PDGFs)炎性因子在多种疾病所致的心脏纤维化进程中有重要作用。实验发现急性心肌梗死早期炎性细胞因子合成和释放增加，包括肿瘤坏死因子-(TNF-)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素1(IL-1)；给予醛固酮处理45周，左、右心室壁中无论是血管损伤还是非损伤部位，均出现巨噬细胞、T淋巴细胞浸润，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、TNF-等炎性因子表达增加。炎性细胞和炎性因子表达量和活性增强，促进静止状态的成纤维细胞增殖，且促进其转化为肌成纤维细胞，增加胶原沉
17、积，导致心肌纤维化。炎性因子在此过程中形成复杂的调节网络，互相促进导致恶性循环，检测炎性因子(尤其是TNF-和IL-6)可直接反映促心肌纤维化因素，但因其作用广泛，受全身因素影响，特异性欠佳，发掘一个特异的反映心肌纤维化的炎性因子更有助诊断。(四)炎症因子MicroRNA(miRNA)是一类长约1924核苷酸的非编码RNA，绝大多数miRNA通过与靶基因3-UTR区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育，参与多种疾病过程。四、胶原基因转录相关的microRNAUTRUTR（Untranslated Regions)Untranslated Regio
18、ns)即非翻译区，是信使即非翻译区，是信使RNARNA（mRNAmRNA）分子两）分子两端的非编端的非编52615261码片段。码片段。 5-UTR5-UTR从从mRNAmRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUGAUG起始密码子，起始密码子，3-UTR3-UTR从编码区末端的从编码区末端的终止密码子终止密码子延伸至多聚延伸至多聚A A尾巴（尾巴（Poly-APoly-A）的末端。）的末端。目前发现并被miRBase数据库收录的人类miRNA分子近700种，其中绝大部分的miRNA分子在不同病理和生理状况下表达，多数miRNA可在人体液中检出。随着检测技术的进
19、步，循环miRNA在疾病诊断中的应用研究，尤其是在肿瘤诊断和预后等领域有了实质性进展。miRNA在疾病诊断中的应用近年来新发现的miRNA与心血管疾病的发生和发展关系极为密切，同时找到多个与心肌纤维化相关的miRNA。目前研究已经证实的有miR-21：可能诱导成纤维细胞的增殖导致纤维化。心肌梗死可以导致梗死区周围严重的纤维化和心肌肥厚，miR-29：在心肌梗死边缘区域表达明显下调，可能与胶原和细胞外基质基因诱导相关，并借此促成心肌梗死相关的心脏纤维化。miR-133a：可调节心肌细胞和骨骼肌细胞的分化，并在心脏发育中起重要作用。通过在压力负荷模型转miR-133a基因成年小鼠研究发现，miR-133a在不改变心肌细胞肥大的情况下抑制心肌纤维化。以上miRNA都参与调节多个靶目标功能，随着研究深入，未来可能发现或是构建一个定向调节心肌纤维化的miRNA。miRNA与心血管疾病的关系心肌纤维化的生物标志物研究意义重大任何单一的生物标志物均有其局限性，因此选择几个标志物联合评估可能具有更重要的临床价值。生物标志物水平必然存在一个动态变化趋势，如何发现具有临床意义的检测窗口期，有待我们更深入系统地去发掘其中的规律。总结
