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1、ALK的病理学和诊断指南的病理学和诊断指南返回目录返回目录FISH ALK 检测的现行标准检测的现行标准阳性结果阳性结果标准：分开的红标准：分开的红/绿信号绿信号非典型：单个红点非典型：单个红点非典型：分开非典型：分开 + 单个红点单个红点ALK 阳性的定义阳性的定义: 15% 的细胞呈阳性的细胞呈阳性Varella-Garcia et al., ASCO 2010; Abs #10533FISH ALK检测的现行标准检测的现行标准阴性结果阴性结果1 标准：融合信号标准：融合信号非典型：单个绿点非典型：单个绿点1. Varella-Garcia et al., ASCO 2010; Abs #
2、10533FISH检测样本的制备及染色概述检测样本的制备及染色概述 肿瘤区域的确定肿瘤区域的确定对一玻片进行H&E染色标出肿瘤区域（不包括坏死区域、原位癌和小细胞癌）用标记好的H&E染色玻片作为模板，在未染色玻片上标注肿瘤区域*(后续步骤参见未染色玻片)FFPE样本的制备样本的制备从组织块上切下2段，厚度51m置于表面带正电荷的载玻片上去石蜡去石蜡预处理预处理蛋白酶处理蛋白酶处理与探针杂交与探针杂交清洗清洗 (杂交当日)DAPI复染复染准备好玻片自以下步骤开始*FISH法中应使用来自H&E染色的连续10片内的切片Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit Pack
3、age InsertALK FISH信号解读指南信号解读指南典型的信号形式典型的信号形式典型的信号形式典型的信号形式阴性信号：邻近或融合的橙色和绿色阴性信号：邻近或融合的橙色和绿色阴性信号：邻近或融合的橙色和绿色阴性信号：邻近或融合的橙色和绿色阳性信号：分开或绿色丢失阳性信号：分开或绿色丢失阳性信号：分开或绿色丢失阳性信号：分开或绿色丢失Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit Package InsertEML4-ALK的的FISH检测中需注意的问题检测中需注意的问题至少计数至少计数50个肿瘤细胞以确保结果的精确性个肿瘤细胞以确保结果的精确性 1如果红色和绿色
4、探针分离如果红色和绿色探针分离 2个信号直径个信号直径 ，则认为，则认为FISH信信号为阳性号为阳性1ALK 重排可能遍及整个肿瘤而非局部重排可能遍及整个肿瘤而非局部2约约5%-11%的细胞会出现假阳性分离的细胞会出现假阳性分离1,2ALK重排细胞比例的增加与克唑替尼治疗的肿瘤缓解程度重排细胞比例的增加与克唑替尼治疗的肿瘤缓解程度并无关联并无关联31.Varella Garcia et al., IASLC 2011; Abs #MTE36.12. Camidge et al., Clin Cancer Res 2010; 16:5581-55903. Camidge, IASLC 2011;
5、 Abs #MO04.04FISH病理报告实例：显示病理报告实例：显示 EML4-ALK 融合融合Courtesy I. WistubaFISH病理报告实例：显示无病理报告实例：显示无EML4-ALK 融合融合病理报告要使用准确的语言，如病理报告要使用准确的语言，如 “EML4-ALK 重排重排 15%” “ALK 异常异常” 还包括其他变异，如还包括其他变异，如ALK基因拷贝数增加，此变异未被确基因拷贝数增加，此变异未被确认为对认为对ALK抑制剂应答的预测性标记物抑制剂应答的预测性标记物1Courtesy I. Wistuba1. Raftopoulos et al., IASLC 2011
6、, Abs #O05.06免疫组织化学免疫组织化学(IHC) 检测检测ALK表达表达使用高敏感度检测系统后，越来越多的数据支持使用高敏感度检测系统后，越来越多的数据支持IHC可用作初步筛查可用作初步筛查的方法的方法敏感度和特异度可达敏感度和特异度可达100%，尽管在不同研究中存在差异，尽管在不同研究中存在差异与与FISH相比，相比，IHC是一种更常规的技术，成本低、工作量相对小是一种更常规的技术，成本低、工作量相对小ALKIHCFISH患者患者 1:IHC显示ALK表达量高，FISH显示重排患者患者2:IHC显示无ALK表达，FISH显示无重排Mino-Kenudson Clin Cancer
7、 Res 2010; 16:1561-1571.IHC需要标准化需要标准化从临床试验过渡到大规模使用从临床试验过渡到大规模使用IHC 前，还需要对以下方面进行规范：前，还需要对以下方面进行规范：最好的抗体和检测系统是什么最好的抗体和检测系统是什么应采用哪种评分系统应采用哪种评分系统有哪些生物学相关的截止点有哪些生物学相关的截止点采用适当的质量控制采用适当的质量控制抗体研究数量供货商敏感度范围特异度范围ALK18Dako9%-100%97%-100%5A46Abcam,Novocastra18%-100%96%-100%D5F31CellSignaling100%99%Adapted from
8、Yi et al., J Thorac Oncol 2011; 6:459-465and Mitsudomi et al., ASCO 2011, Abs #7534研究中的检测研究中的检测ALK重排的其他检测方法重排的其他检测方法多重多重 RT-PCR用于筛查所有用于筛查所有ALK 融合变异体融合变异体1,2显色原位杂交技术显色原位杂交技术(CISH) 3使用标准明视野显微镜，使用标准明视野显微镜， 数据可存档数据可存档465例样本结果显示与例样本结果显示与FISH (k=0.92) 和和IHC (k=0.82)高度一致高度一致分离型CISH探针显示ALK重排Takeuchi等报道的新发现的
9、EML4-ALK变异体4的RT-PCR结果1. Takeuchi et al., Clin Cancer Res 2008; 14:6618-66242. Li et al., ASCO 2011; Abs #105203. Kim et al., IASLC 2011; Abs #O05.02EML4-ALK融合变异体V1V2V3AV3BV4V5AV5BV6V7EML4-ALK.V1+-EML4-ALK.V2-+-EML4-ALK.V3A-+-EML4-ALK.V3B-+-EML4-ALK.V3AB-+-EML4-ALK.V5A-+-EML4-ALK.V5B-+-EML4-ALK.V6-+-
10、EML4-ALK.V5A/6-+-+-EML4-ALK.V4-+-EML4-ALK.V7-+EML4-ALK.V4/7-+-+RT-PCR检测到的多个检测到的多个EML4-ALK变异体变异体Danenberg et al., ASCO 2010, Abs #10535非小细胞肺癌分子检测规程提议非小细胞肺癌分子检测规程提议非小细胞肺癌分子检测规程提议非小细胞肺癌分子检测规程提议现行指南中建议进行现行指南中建议进行EGFR 突变检测突变检测提议在规程中增加提议在规程中增加ALK 筛查筛查；随着诊断时间的缩短以及更好利用标本，随着诊断时间的缩短以及更好利用标本，方法将不断被优化方法将不断被优化Mitsudomietal.ASCO2011;Abs#7534顺序同时HornandPao,临床肿瘤学杂志 2009;27:4232-4235Kohetal.,J Thorac Oncol2011;6:905912优化优化ALK 检测的主要因素检测的主要因素评价时间范围最好预先测试顺序/平行检测建议同时检测多个生物标记物适用患者任何可能出现ALK异位的患者。腺癌患者不应根据患者年龄、种族、性别或吸烟史进行选择
