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1、第一部分第一部分微生物的利用微生物的利用实验一实验一大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离实验目的实验目的1.进行大肠杆菌的进行大肠杆菌的扩增扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进行进行细菌培养的操作细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的进行大肠杆菌的分离分离，用，用固体平面培养固体平面培养基基进行细菌的进行细菌的划线培养划线培养3.说明大肠杆菌培养的说明大肠杆菌培养的条件条件和实验和实验原理原理一一. 基础知识基础知识（一）（一）微生物微生物（二）（二）微生物培养基微生物培养基（三）（三）无菌技术无菌技术二二. 微生物实验所需的操作技术微生物实验所需的操作技术三三. 大肠杆菌的培养和分离实验大肠
2、杆菌的培养和分离实验四四. 课题小结课题小结1.1微生物微生物结构结构结构结构都相当都相当都相当都相当简单简单简单简单，个体多数十分，个体多数十分，个体多数十分，个体多数十分微小微小微小微小，通常要用光学，通常要用光学，通常要用光学，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。且体内一般不含有叶绿素，不能进行光合作用构。且体内一般不含有叶绿素，不能进行光合作用构。且体内一般不含有叶绿素，不能进行光合作用构。且体内一般不含有叶绿素，不能进行光
3、合作用五类五类五类五类病病病病 毒毒毒毒细细细细 菌菌菌菌放线菌放线菌放线菌放线菌真真真真 菌菌菌菌原生动物原生动物原生动物原生动物病毒界病毒界病毒界病毒界原核生物界原核生物界原核生物界原核生物界真菌界真菌界真菌界真菌界原生生物界原生生物界原生生物界原生生物界1.1.11.1.1微生物的特点微生物的特点微生物的特点微生物的特点1.1.21.1.2微生物的种类微生物的种类微生物的种类微生物的种类1.1.31.1.3细菌的形态、结构和菌落细菌的形态、结构和菌落细菌的形态、结构和菌落细菌的形态、结构和菌落1.1.3细菌的形态结构和菌落细菌的形态结构和菌落图图图图1-1 1-1 常见的三种细菌典型形态
4、常见的三种细菌典型形态常见的三种细菌典型形态常见的三种细菌典型形态A.A.球菌球菌球菌球菌 B.B.杆菌杆菌杆菌杆菌 C.C.弧菌弧菌弧菌弧菌单细胞不分枝单细胞不分枝单细胞不分枝单细胞不分枝的的的的原原原原核核核核微生物，细菌细微生物，细菌细微生物，细菌细微生物，细菌细胞微小而透明，通胞微小而透明，通胞微小而透明，通胞微小而透明，通常用常用常用常用适当染料染色适当染料染色适当染料染色适当染料染色后显微镜观察后显微镜观察后显微镜观察后显微镜观察1.1.3.11.1.3.1细菌的形态细菌的形态细菌的形态细菌的形态1.1.3.21.1.3.2细菌的结构细菌的结构细菌的结构细菌的结构 基本结构：基本结
5、构：基本结构：基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞壁、细胞膜、细胞壁、细胞膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中有液泡、细胞质，细胞质中有液泡、细胞质，细胞质中有液泡、细胞质，细胞质中有液泡、储存性颗粒、核质等储存性颗粒、核质等储存性颗粒、核质等储存性颗粒、核质等 附属结构：附属结构：附属结构：附属结构：鞭毛、纤毛、荚鞭毛、纤毛、荚鞭毛、纤毛、荚鞭毛、纤毛、荚膜、膜、膜、膜、芽孢芽孢芽孢芽孢（抗逆（抗逆（抗逆（抗逆休眠体）休眠体）休眠体）休眠体）等等等等1.1.3.31.1.3.3菌落菌落菌落菌落革兰氏染色：革兰氏染色：革兰氏染色：革兰氏染色：阳性阳性阳性阳性或阴性，细胞壁成或阴性，细胞壁成或阴性，细
6、胞壁成或阴性，细胞壁成分不同分不同分不同分不同1.1.3.3菌落菌落单个或少数细菌单个或少数细菌单个或少数细菌单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形在固体培养基上大量繁殖时，就会形在固体培养基上大量繁殖时，就会形在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有成一个肉眼可见的，具有成一个肉眼可见的，具有成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体一定形态结构的子细胞群体一定形态结构的子细胞群体一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落叫做菌落叫做菌落叫做菌落 细菌的菌落细菌的菌落细菌的菌落细菌的菌落特征因种特征因种特征因种特征因种而异而异而异而异 菌落是菌落是菌落是菌落是鉴定菌种鉴定菌
7、种鉴定菌种鉴定菌种的重的重的重的重要依据要依据要依据要依据大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠菌群大肠菌群大肠菌群大肠菌群1.2微生物培养基微生物培养基培养基（培养液）是微生物培养基（培养液）是微生物培养基（培养液）是微生物培养基（培养液）是微生物生存的环境生存的环境生存的环境生存的环境和和和和营养物质营养物质营养物质营养物质1.2.11.2.1培养基的分类（按物理形态分）培养基的分类（按物理形态分）培养基的分类（按物理形态分）培养基的分类（按物理形态分）（1 1）液体培养基（液）液体培养基（液）液体培养基（液）液体培养基（液） （2 2）半固体培养基）半固体培养基）半固体培养基）半固体培养基
8、（3 3）固体培养基）固体培养基）固体培养基）固体培养基添加的添加的添加的添加的琼脂琼脂琼脂琼脂量决定量决定量决定量决定1.2.21.2.2培养基所含的成分培养基所含的成分培养基所含的成分培养基所含的成分（1 1）水）水）水）水（2 2）无机盐）无机盐）无机盐）无机盐（3 3）碳源）碳源）碳源）碳源（4 4）氮源）氮源）氮源）氮源（5 5）生长因子）生长因子）生长因子）生长因子含碳含碳含碳含碳无机物或无机物或无机物或无机物或有机物有机物有机物有机物，后者通常可作，后者通常可作，后者通常可作，后者通常可作能源能源能源能源含氮含氮含氮含氮无机盐或无机盐或无机盐或无机盐或有机物有机物有机物有机物，用
9、于合成氨基酸等，用于合成氨基酸等，用于合成氨基酸等，用于合成氨基酸等生长生长生长生长必需必需必需必需，而，而，而，而自身不能合成自身不能合成自身不能合成自身不能合成的化合物的化合物的化合物的化合物 不同微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子不同微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子不同微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子不同微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子的的的的种类种类种类种类不同不同不同不同 培养基需要培养基需要培养基需要培养基需要调节调节调节调节pHpH、渗透压渗透压渗透压渗透压、控制、控制、控制、控制含氧量含氧量含氧量含氧量等条件等条件等条件等条件细菌：细菌：细菌：细菌：用蛋用
10、蛋用蛋用蛋白胨白胨白胨白胨和和和和酵母提取物酵母提取物酵母提取物酵母提取物配配配配制制制制霉菌：霉菌：霉菌：霉菌：用用用用无机物无机物无机物无机物或添加或添加或添加或添加蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖的的的的豆豆豆豆芽汁芽汁芽汁芽汁配制配制配制配制细菌：细菌：细菌：细菌：中性中性中性中性偏碱偏碱偏碱偏碱（7.58.57.58.5）霉菌：霉菌：霉菌：霉菌：中性中性中性中性偏酸偏酸偏酸偏酸（5.06.05.06.0）通常用通常用通常用通常用NaClNaCl调节调节调节调节1.3无菌技术无菌技术1.3.11.3.1获得纯净微生物培养物的关键获得纯净微生物培养物的关键获得纯净微生物培养物的关键获得纯净微生物培养物的
11、关键防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵1.3.21.3.2无菌技术无菌技术无菌技术无菌技术 的的的的四个方面四个方面四个方面四个方面（1 1）对实验操作）对实验操作）对实验操作）对实验操作空间空间空间空间、操作者的、操作者的、操作者的、操作者的衣着衣着衣着衣着和和和和手手手手进行清洁进行清洁进行清洁进行清洁和和和和消毒消毒消毒消毒 （2 2）将培养）将培养）将培养）将培养器皿器皿器皿器皿、接种、接种、接种、接种用具用具用具用具和和和和培养基培养基培养基培养基等器具进行等器具进行等器具进行等器具进行灭菌灭菌灭菌灭菌 （3 3）为避免周围微生物污染，实验）为避
12、免周围微生物污染，实验）为避免周围微生物污染，实验）为避免周围微生物污染，实验操作操作操作操作应在应在应在应在酒精灯火焰酒精灯火焰酒精灯火焰酒精灯火焰附近附近附近附近旁进行旁进行旁进行旁进行（4 4）避免避免避免避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相已灭菌处理的材料用具与周围物品相已灭菌处理的材料用具与周围物品相已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触接触接触接触1.3.31.3.3消毒消毒消毒消毒与与与与灭菌灭菌灭菌灭菌1.3.3.1消毒消毒使用较为使用较为使用较为使用较为温和温和温和温和的物理或化学方法仅杀死的物理或化学方法仅杀死的物理或化学方法仅杀死的物理或化学方法仅杀死物体表面物体表面物体表
13、面物体表面或或或或内内内内部一部分部一部分部一部分部一部分对人体有害的微生物对人体有害的微生物对人体有害的微生物对人体有害的微生物 一般不能杀死芽孢和孢子一般不能杀死芽孢和孢子一般不能杀死芽孢和孢子一般不能杀死芽孢和孢子n常用消毒方法常用消毒方法常用消毒方法常用消毒方法常用于牛奶的消毒常用于牛奶的消毒常用于牛奶的消毒常用于牛奶的消毒 煮沸消毒法煮沸消毒法煮沸消毒法煮沸消毒法 巴氏消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法 紫外线消毒紫外线消毒紫外线消毒紫外线消毒 化学药剂消毒法化学药剂消毒法化学药剂消毒法化学药剂消毒法 酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶酒精、氯气、石碳酸、煤酚
14、皂溶酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等液等液等液等在在在在充分燃烧层充分燃烧层充分燃烧层充分燃烧层灼烧灼烧灼烧灼烧1.3.3.2灭菌灭菌使用使用使用使用强烈强烈强烈强烈的理化因素的理化因素的理化因素的理化因素杀死物体内外所有的微生物杀死物体内外所有的微生物杀死物体内外所有的微生物杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子n常用灭菌方法和适用范围常用灭菌方法和适用范围常用灭菌方法和适用范围常用灭菌方法和适用范围l l灼烧灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌 l l干热灭菌干热灭菌干热灭菌干热灭菌l l高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌微生物的微生物的微
15、生物的微生物的接种工具接种工具接种工具接种工具 （接种环、接（接种环、接（接种环、接（接种环、接种针）或其他种针）或其他种针）或其他种针）或其他金属用具金属用具金属用具金属用具能能能能耐高温耐高温耐高温耐高温的需要的需要的需要的需要保持干保持干保持干保持干燥燥燥燥的物品（的物品（的物品（的物品（ 玻璃器皿）玻璃器皿）玻璃器皿）玻璃器皿）160160170170 ；1 12h2h100kPa 121100kPa 121 1530min 1530min最常用最常用最常用最常用方式，通常用于方式，通常用于方式，通常用于方式，通常用于培养基培养基培养基培养基的灭菌的灭菌的灭菌的灭菌及及及及各种器具各种
16、器具各种器具各种器具的灭菌的灭菌的灭菌的灭菌2.微生物实验所需的操作技术微生物实验所需的操作技术2. 12. 1器具的灭菌器具的灭菌器具的灭菌器具的灭菌2.22.2培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平培养液（基）的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术板技术板技术板技术2.32.3细菌的接种和纯化技术细菌的接种和纯化技术细菌的接种和纯化技术细菌的接种和纯化技术棉花塞口棉花塞口棉花塞口棉花塞口牛皮纸（或报纸）包口或包扎牛皮纸（或报纸）包口或包扎牛皮纸（或报纸）包口或包扎牛皮纸（或报纸）包口或包扎60806080烘干烘干烘干烘干
17、121121（1Kg/cm1Kg/cm2 2）灭菌）灭菌）灭菌）灭菌15min15min不能用脱脂棉：不能用脱脂棉：不能用脱脂棉：不能用脱脂棉：易吸水易吸水易吸水易吸水后导致污染后导致污染后导致污染后导致污染2.3.12.3.1平板划线法平板划线法平板划线法平板划线法2.3.22.3.2稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法简便，简便，简便，简便，常用常用常用常用效果好效果好效果好效果好2.2培养液的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术培养液的配置、灭菌，放斜面和倒平板技术2.2.12.2.1配置配置配置配置LBLB（Luria-Luria-BertaniBertani，溶菌肉汤）
18、培养基，溶菌肉汤）培养基，溶菌肉汤）培养基，溶菌肉汤）培养基n配方配方配方配方蛋白胨：蛋白胨：蛋白胨：蛋白胨：0.5g0.5g酵母提取物：酵母提取物：酵母提取物：酵母提取物：0.25g0.25gNaClNaCl：0.5g0.5g水：水：水：水：50mL50mL琼脂：琼脂：琼脂：琼脂：1g1g（固体）（固体）（固体）（固体）pHpH：7.47.47.67.6n配制过程配制过程配制过程配制过程计算计算计算计算、称量称量称量称量混合混合混合混合加热加热加热加热溶化溶化溶化溶化NaOHNaOHHClHCl调调调调pHpH（7 76 6）分装分装分装分装三角漏三角漏三角漏三角漏斗分斗分斗分斗分三角瓶三角
19、瓶三角瓶三角瓶试管试管试管试管棉塞或棉塞或棉塞或棉塞或封口膜封口膜封口膜封口膜加塞加塞加塞加塞包扎包扎包扎包扎通气通气通气通气；阻止阻止阻止阻止微生物进入微生物进入微生物进入微生物进入牛皮纸牛皮纸牛皮纸牛皮纸灭菌灭菌灭菌灭菌高压蒸汽高压蒸汽高压蒸汽高压蒸汽1Kg/cm21Kg/cm2，121121， 15min15min放斜面放斜面放斜面放斜面倒平板倒平板倒平板倒平板未凝固时未凝固时未凝固时未凝固时固体培养基固体培养基固体培养基固体培养基分装、放斜面、倒平板分装、放斜面、倒平板n分装分装分装分装 培养基不能沾上培养基不能沾上培养基不能沾上培养基不能沾上塞子塞子塞子塞子、管管管管口和口和口和口和
20、管壁管壁管壁管壁易导致污染易导致污染易导致污染易导致污染 固体分装固体分装固体分装固体分装试管试管试管试管，培养液不超过管高，培养液不超过管高，培养液不超过管高，培养液不超过管高1/51/5便于放斜面便于放斜面便于放斜面便于放斜面 液体分装三角瓶，一般培养基高度为瓶高液体分装三角瓶，一般培养基高度为瓶高液体分装三角瓶，一般培养基高度为瓶高液体分装三角瓶，一般培养基高度为瓶高1/41/4左右左右左右左右 本实验中，将本实验中，将本实验中，将本实验中，将50mL50mL液体液体液体液体LBLB培养基和培养基和培养基和培养基和50mL50mL固体固体固体固体LBLB培养培养培养培养基分别装入基分别装
21、入基分别装入基分别装入2 2个个个个250mL250mL三角瓶中，加封口膜（或棉塞）三角瓶中，加封口膜（或棉塞）三角瓶中，加封口膜（或棉塞）三角瓶中，加封口膜（或棉塞）n放斜面放斜面放斜面放斜面固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却n倒平板倒平板倒平板倒平板培养接种用菌种培养接种用菌种培养接种用菌种培养接种用菌种超净台和双手消毒超净台和双手消毒超净台和双手消毒超净台和双手消毒点燃酒精灯创造无菌环境点燃酒精灯创造无菌环境点燃酒精灯创造无
22、菌环境点燃酒精灯创造无菌环境倒平板操作倒平板操作倒平板操作倒平板操作倒平板操作倒平板操作n n倒平板操作中的问题讨论倒平板操作中的问题讨论倒平板操作中的问题讨论倒平板操作中的问题讨论倒平板操作中的问题讨论倒平板操作中的问题讨论（1 1）培养基灭菌后，需要冷却到）培养基灭菌后，需要冷却到）培养基灭菌后，需要冷却到）培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，才能用来倒左右时，才能用来倒左右时，才能用来倒左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？平板。你用什么办法来估计培养基的温度？平板。你用什么办法来估计培养基的温度？平板。你用什么办法来估计培养基的温度？（2 2）为什么需要使锥形
23、瓶的瓶口通过火焰？）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？）为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？（3 3）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？）平板冷凝后，为什么要将平板倒置？（4 4）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？底之间的部位，这个
24、平板还能用来培养微生物吗？为什么？底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基平板冷凝后
25、，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造
26、成污染空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物因此最好不要用这个平板培养微生物因此最好不要用这个平板培养微生物因此最好不要用这个平板培养微生物2.3.1平板划线法平板划线法n n平板划线法操作中的问题讨论平板划线法操作中的问题讨论平板划线法操作中的问题讨论平板划线法操作中的问题讨论平板划线法操作的问题讨论平板划线法操作的问题讨论1n平板划线的具体方法平板划线的具体方法平板划线的具体方法平板划线的具体方法
27、连续划线法连续划线法连续划线法连续划线法 交叉划线法交叉划线法交叉划线法交叉划线法2 21 13 3n平板划线的具体方法平板划线的具体方法平板划线的具体方法平板划线的具体方法（1 1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？每次划线前灼烧接
28、种环是为了杀死上次划线结束接种环上残留的每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束接种环上残留的每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束接种环上残留的每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束接种环上残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。结束后要
29、灼烧接种环以及时杀死残留的菌种，避免污染环境和感结束后要灼烧接种环以及时杀死残留的菌种，避免污染环境和感结束后要灼烧接种环以及时杀死残留的菌种，避免污染环境和感结束后要灼烧接种环以及时杀死残留的菌种，避免污染环境和感染操作者染操作者染操作者染操作者单菌落单菌落单菌落单菌落1 12 23 34 460706070平板划线法操作的问题讨论平板划线法操作的问题讨论2（2 2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？（3 3）在作第二次以及其后的
30、划线操作时，为什么总是从上一）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？次划线的末端开始划线？次划线的末端开始划线？次划线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种以免接种环温度太高，杀死菌种以免接种环温度太高，杀死菌种以免接种环温度太高，杀死菌种线条末端细菌的数目较少，这样操作能使细菌的数目随着划线线条末端细菌的数目较少，这样操作能使细菌的数目随着划线线条末端细菌的数目较少，这样操作能使细菌的数目随着划线线条末端细菌的数目较少，这样操作能使细菌的数目随着划线次数的
31、增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落（4 4）为什么平板划线时不能划破培养基表面？）为什么平板划线时不能划破培养基表面？）为什么平板划线时不能划破培养基表面？）为什么平板划线时不能划破培养基表面？一是划破后会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的一是划破后会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的一是划破后会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的一是划破后会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的二是存留在划破处的单个
32、细胞无法形成规矩的菌落，菌落二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落2.3.2稀释涂布平板法稀释涂布平板法n n操作方法操作方法操作方法操作方法 梯度稀释梯度稀释梯度稀释梯度稀释 涂布分离涂布分离涂布分离涂布分离问题：问题：问题：问题：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划
33、线与系涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第列稀释的无菌操作要求，想一想，第列稀释的无菌操作要求，想一想，第列稀释的无菌操作要求，想一想，第2 2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？3.大肠杆菌的培养和分离实验大肠杆菌的培养和分离实验3.13.1设备及用品设备及用品设备及用品设备及用品灭菌锅或高压锅、灭菌锅或高压锅、灭菌锅或高压锅、灭菌锅或高压锅、250ml250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径的三角瓶、封口膜
34、和橡皮圈、直径的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（口瓶、镊子、有棉塞的试管（口瓶、镊子、有棉塞的试管（口瓶、镊子、有棉塞的试管（15mm120mm15mm120mm）5 5
35、支支支支3.23.2实验材料实验材料实验材料实验材料（1 1）50mlLB50mlLB液体培养基：蛋白胨液体培养基：蛋白胨液体培养基：蛋白胨液体培养基：蛋白胨0.5g0.5g、酵母提取物、酵母提取物、酵母提取物、酵母提取物0.25g0.25g、NaClNaCl 0.5g 0.5g、加水、加水、加水、加水50ml50ml（2 2）大肠杆菌菌种斜面）大肠杆菌菌种斜面）大肠杆菌菌种斜面）大肠杆菌菌种斜面（3 3）空白斜面）空白斜面）空白斜面）空白斜面 3.33.3实验过程实验过程实验过程实验过程3.43.4课题成果评价课题成果评价课题成果评价课题成果评价革兰氏阴性革兰氏阴性革兰氏阴性革兰氏阴性，兼性
36、厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧菌菌菌菌3.3实验过程实验过程1.1.配制配制配制配制LBLB培养基培养基培养基培养基2.2.灭菌灭菌灭菌灭菌LBLB液体液体液体液体培养基培养基培养基培养基LBLB固体固体固体固体培养基培养基培养基培养基各各各各50mL50mL，三角瓶，三角瓶，三角瓶，三角瓶3.3.倒平板倒平板倒平板倒平板固体固体固体固体冷却成平冷却成平冷却成平冷却成平板培养基板培养基板培养基板培养基4 4个培养皿个培养皿个培养皿个培养皿液体液体液体液体4.4.接种扩大培养接种扩大培养接种扩大培养接种扩大培养1.1.培养基培养基培养基培养基冷却冷却冷却冷却2. 2. 接种环烧灼接种环烧灼接种环烧
37、灼接种环烧灼3. 3. 接种环在菌种斜面培养基上接种环在菌种斜面培养基上接种环在菌种斜面培养基上接种环在菌种斜面培养基上冷却冷却冷却冷却4. 4. 挑取菌种挑取菌种挑取菌种挑取菌种接种接种接种接种到液体培养基中到液体培养基中到液体培养基中到液体培养基中5. 375. 37摇床摇床摇床摇床震荡培养震荡培养震荡培养震荡培养12h12h培养的大肠杆菌菌种培养的大肠杆菌菌种培养的大肠杆菌菌种培养的大肠杆菌菌种5.5.平板划线分离平板划线分离平板划线分离平板划线分离3737培养培养培养培养2424h h4 4保存保存保存保存6.6.单菌落接种单菌落接种单菌落接种单菌落接种6.6.菌种培养、保存菌种培养、
38、保存菌种培养、保存菌种培养、保存1.1.挑取挑取挑取挑取单菌落单菌落单菌落单菌落菌种菌种菌种菌种2.2.斜面斜面斜面斜面连续划线连续划线连续划线连续划线酒精灯酒精灯酒精灯酒精灯旁操作旁操作旁操作旁操作细菌培养分离视频细菌培养分离视频细菌培养分离视频细菌培养分离视频3.4课题成果评价课题成果评价n培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格n接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求n是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录如果
39、未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 12 d2 d后无菌落生后无菌落生后无菌落生后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备如培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是
40、符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习培养培养培养培养12 h12 h与与与与24 h24 h后的大肠杆
41、菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯学态度与习惯学态度与习惯学态度与习惯4.课题小结课题小结大肠杆菌的大肠
42、杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的培养和分离培养和分离培养和分离培养和分离培养基培养基培养基培养基无菌技术无菌技术无菌技术无菌技术制备制备制备制备LBLB培养基培养基培养基培养基纯化分离纯化分离纯化分离纯化分离培养保存培养保存培养保存培养保存培养基类型培养基类型培养基类型培养基类型培养基的应用物质培养基的应用物质培养基的应用物质培养基的应用物质避免杂菌污染的方法避免杂菌污染的方法避免杂菌污染的方法避免杂菌污染的方法实验室常用消毒法实验室常用消毒法实验室常用消毒法实验室常用消毒法实验室常用灭菌法实验室常用灭菌法实验室常用灭菌法实验室常用灭菌法计算计算计算计算称量称量称量称量溶化溶化溶化溶化灭菌灭菌灭菌灭菌倒平板倒平板倒平板倒平板平板划线法平板划线法平板划线法平板划线法稀释涂布法稀释涂布法稀释涂布法稀释涂布法斜面接种斜面接种斜面接种斜面接种
